DNA重组技术课件.pdf

重组DNA技术11.1重组DNA技术是基因工程的核心技术11.2 获得需要的目的基因（外源基因）11.3 构建重组质粒和基因克隆11.4 转化受体细胞和转化子的筛选11.5 转化子的分析Southern杂交11.1 重组DNA技术是基因工程的核心技术重组DNA技术，又称为基因克隆或分子克隆技 术，克隆(clone)-无性繁殖A分子克隆-DNA的无性繁殖技术重组DNA技术包括了一系列的分子生物学操 作步骤。重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技 术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高 技术产业。基因工程(genetic engineering)A所谓基因工程(genetic engineering)就是把 外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使 这个基因能在受体细胞内复制，转录，翻译表 达的操作叫基因工程。A基因工程可使另一种生物获得新的遗传性状或 表达所需要的产物。重组DNA操作一般步骤：（1）获得目的基因；（2）与克隆载体连接，形 成新的重组DNA分子；（3）用重组DNA分子转化 受体细胞，并能在受体 细胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定;（5）对获得外源基因的细 胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或 表达出所需要的产物。11.2 获得需要的目的基因(外源基因)获得需要的目的基因常用的方法：(1)直接从生物体中提取总DNA,构建基因组DNA文库(genomic DNA library),从中调用目的基因；(2)以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立 cDNA文库；(3)利用聚合酶链式反应(PCR)特异性地扩增所需要 的目的基因片段，等等。(4)化学合成细胞内总DNA的提取分离与基因组文库的构建 细胞内总DNA的提取分离程序苯酚沉淀蛋白质紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。DNA的浓度(mg/L)二A26O X 50 注:比色杯光径1DNA的纯度=Awra/A2M 21.8基因组DNA文库的构建将总DNA经过酶解，经蔗糖梯度离心或琼脂糖凝胶 电泳分离不同长短的DNA片段。包含的基因组片段 分别克隆在质粒或噬菌体载体上，转染细菌或体 外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因组 文库。cDNA文库的构建mRNA3,mRNA反转3、r cDNA（互补DNA）第二条DNA链ANNEAL PRIMER55,MAKE DNA COPY WITH REVERSE TRANSCRIPTASEAAAAAAA l I l l l l lTTTTTTTr 5V .3,TREAT WITH ALKALI TO DEGRADE RNA3,end of cDNA focmsDNA POLYMERASE USES HAIRPtN LOOP AS PRIMER TO SYNTHESIZE A COMPLEMENTARY DNA STRANDTTTTTTT 5lirpin loop5,double stranded cDNA copy of original mRNA反转录人工合成互补DNA,cDNAA构建基因文库获取目的 基因存在的问题-费时费事内含子序列反转录人工合成互补DNA 方法的优势一获取的DNA片段往往是具有 特定功能的目的基因J RNA为模板逆转录为DNAI逆转录完成以DNA为模板合成双链DNA形成不含内含子的双链DNA聚合酶链式反应(PCR)PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量 扩增(包括分离)一段目的基因的技术。加入4种物质：(1)作为模板的DNA序列；(2)与被分离的目的基因两条链 各自5,端序列相互补的DNA引物(20个左右碱基的短DNA单链)；(3)TaqDNA聚合酶;(4)dNTP(dATP,dTTP,dGTP和dCTP)。(PCR)聚合酶链式反应变性、退火、延伸 三步曲A变性：双链DNA解链 成为单链DNAA退火：部分引物与 模板的单链DNA的特 定互补部位相配对 和结合A延伸：以目的基因 为模板，合成互补 的新DNA链4种核苦酸引物iliMhiHiUTI Jiliihiiii山山山 IwihiihI 95CI 55CI 1 I 1 I 1 I I I I I I I 1 I I!I 1111 11 1 I【I I I72,C.o/+4小+十DNA聚合院DNA模板I I I I I聚合酶链式反应(PCR)厂十号1+每一轮聚合酶链式反应可 使目的基因片段增加一倍A30轮循环可获得23。(1.07X 109)个基因片 段口以豪合疝4种植3戢MIHi!川 i Jll叫丁 II-1-RETTI I II,j.Li,.,|jCTHfr_ J.1：Ui r PCR技术的发明 PCR的发明是DNA操作技术的革命美国Mui I is教授 开汽车时的联想逶迤崎岖的山路DNA双螺旋 行驶的汽车一小段DNA引物1988年发明了 PCR技术1993年获得诺贝尔奖陋丁；门3吗,.11.3构建重组质粒DNA和基因克隆基因重组和克隆操作最重要的工具是：1.限制性内切酶 2.载体 和 3.宿 主菌微量的目的基因必须经过基因克隆获得大量的拷贝 后限楠麟瞬汗步的重组、转化和表达等操作。限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列特定位点分子手术刀 Arber Smi th和Nat hans因为在发现限制性内切酶 方面开创性工作而共同获得了 1978年的诺贝尔奖。分子刀-DNA限制性内切酶识别特定的核甘酸序列46个碱基对形成粘性末端或平端“Hpa I51包ZHU SS3,3何囚国叵旧回守CUTEco RI5-IzHAMzHzHsh3,3&HD囚回回5.CUTHind III3,京30忖5CUT$母3.3-lZWcHKD 6,CUT IpmH重组DNA的操作粘性末端重组DNA限制性内切酶已经发现和鉴定了200多种 EcbRI特异识别 GAATTC及其互补 碱基组成的双链 片段粘性末端 T4连接酶oRI杯”RITHA BoIAmHTTG!.:!:c G 出c一 A HT基因体外重组linear plum id O94ACOVALENT LINKAGE BY DNA LIGASEplasmed DMA molecule cxxHaMng chrny DNA framtnts produced by cutting dhromosomai ONA whh the same mtncticn nix:leaseThe formation of a recombinant DNA molecule载体载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，（1）能够自我复制，并带动插入的外源基因一起复制（2）具有合适的限制性酶切位点（3）具有合适的筛选标记（4）细胞内拷贝数要多（5）载体的分子量要小（6）细胞内稳定性高目前最常用的载体包括细菌质粒、九噬菌体、cosmi d质粒 等。质粒质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复 制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一个 质粒可以大量增加其拷贝数。细菌质粒DNA大肠杆菌细胞质粒载体的一般结构四克隆常用载体11.4转化受体细胞和转化子的筛选A基因克隆获得大量目的基因后，就要使其在合适的 宿主细胞中表达，产生需要的基因表达产物或使宿 主生物具备所需的性状，同时目的基因还能在宿主 细胞中稳定遗传。这一过程就是遗传转化。A若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可 对转化的大肠杆菌进行培养使目的基因大量表达和 积累。对表达产物分离纯化便可获得想要的产品。通过DNA体外重组技术构建的重组质粒还可以直接 用以转化蓝藻等原核生物或其他一些原生生物。宿主菌或受体细胞大肠杆菌酵母昆虫细胞哺乳动物细胞感受态细胞（competentcell)受体细胞和重组基因的导入（转化或转染）A将目的基因克隆到大肠杆 菌细胞中的操作步骤：1.获得目的基因和质粒载体；2.形成重组质粒；3.制备感受态细胞，用重组质粒 转化大肠杆菌细胞；4.培养大肠杆菌，让重组质粒及 外源目的基因形成大量拷贝；5.筛选含重组质粒的大肠杆菌细 胞，进行检查或鉴定。0磁大肠杆菌细胞3.分离大肠杆 菌细胞中的质粒1.从细分jDNA碾.人体细胞2限制酶截取DNA片断粒DNA重蛆4重组质粒5,用重组质粒转化大肠杆菌细胞0磁6.培养大肠杆茴.克隆大量人类基因J礴利用途因的插入失活筛选重组质粒PUC118质粒的多克隆位 点整合在lacZ基因中，该位点如果 没有插入外源目的基因，lacZ基因 便可表达出P半乳糖昔酶，如果平 板培养基中含有IPTG（乳糖操纵 子的诱导物）和X-ga I,X-ga I（B半乳糖甘酶的底物）便会被B 半乳糖甘酶水解成兰色，大肠杆菌 形成蓝色克隆。在多克隆位点插入外源目的基 因，破坏了 lacZ基因的结构，大肠 杆菌形成白色的克隆-I，C筛选克隆制备克 隆DNA含有插入子的克隆lacZ基因被 破坏显示白色,无插入子的克 隆lacZ正常显示蓝色.白色为 所需克隆.未转化细胞含载体无插入子力口入DNA链接酶转入液体 培养插入DNA核酸内切酶 英切倒入 含X-g.l和 氢卞育索 平板单克隆9PUC18载体还携带了抗生 素(antibiotic)基因，可筛 选重组质粒。many plasmids each containing a difftreni DHA insert one otbacteria plated out on medium containing antibiotico o o o o ooooonly bacteria carrying a plasmid ar resistant to the antibiotic and growtess out the first atternetrve and leads to the unambiguous order of restriction nuciea&c cutting site siiown belowA B 2 kb 5kb%b-lOib-Restriction mapping DNA杂交直接鉴定 32P标记的DNA分子探针杂交A放射自显影法DNA探针菌落印迹 至滤膜（加入探针液 杂交处理使DNA暴露变性 Q 成单链DNA单链冲洗滤膜 放射自显影包含自的基因菌落植物遗传转化常用的方法A载体法转化农杆菌介导法(Ti质粒)基因的直接转移(1)高压电脉冲电激穿孔(2)基因枪法(3)微注射法托盘构建缺失基因的蓝细菌突变株（直接转化重组质粒）11.5转化子的分析-Southern杂交纪念发明者Edward Southern(1)提取总DNA(2)酶解(3)电泳(4)转移到滤膜(5)变性解链(6)DNA探针及杂交(7)洗脱(8)放射自显影(9)比较分析DA.野生生姐的总0NA=电泳加入同位素 探针杂交凝歧成像 确岸Marker 的位置与 分子质或漕当的 限制住内 B,突变体细脸检网黑;，有 ktH A股泳一工转印即电 至硝酸纤维注膜变11加脂糖赞胶2Marker洗腰后放射自H影至胶片0 5及W IEc闲I-)国闹 I EaR IEM IfcroR 1鉴定克隆-Southern分子杂交DNA+限制性内切酶琼脂糖凝月父电泳硝酸纤维薄膜I-ii酶切片段 init II mm IIIIl II mm I iiii 11 min ii iii iiI II Illii n in1）挑取待检测克隆制 备DNA样品吸液棉纸吸液海绵电泳方向+6 4 N碱性溶液2）酶切的DNA片段 经琼脂糖凝胶分离3）在碱性溶液驱动下DNA 双链变性，并转移到杂交 膜上，这一过程称为吸印（blott i ng）.X-光片三暴光，显影后可见杂交带.与杂交膜温浴，探针可与互 补的单链复性.stack of paper towelsnrtrocelliMose paper with Ughg bound nuc acidslabeled INA or Dt4ASbeled RNA standards m we markersmtrociHluloMi petbuffer,SEPARATED NUCLEIC ACIDS BLOTTED ONTO NITROCELLULOSE PAPER BY SUCTION OF BUFFER THROUGH BOTH GEL ANO PAPERAFTER REMOVAL OF UNBOUND PROBE.BANDS COMPLEMEMTARY TO LABHEO PROGE ARE REVEALED BY SPECIFIC DfTECTION OF THE LABEL_ labeled probePAPER WITH SEPARATED NQCLEC ACIDS HYBRKX2EO WITH LABELED PROBE scaled pU，1CNUCLEIC ACIOS SEPARATED ACCORDING TO SIZE BY ELECTROPHORfSlS IN AN AGAROSE GELpositionslabeled markeft Southern杂交分析示例A.DNA体外重组实验B.抗生素筛选转化子细胞C.培养突变株细胞D.Southern杂交实验结果 显示，外源目的基因已经转 入突变株细胞中 1973年，由美国斯坦福大学教授Cohn和美国加州大学教授 Boyer带领各自的研究组几乎同时分别完成了 DNA体外重组，一举打开了基因工程学大门。The Human Genome Project9.7人类基因组计划 1988年，美国国家卫生院和能源部 迄今为止在生命科学领域最宏大的研究计划一人类基因组 计戈IJ主要内容是完成人体23对染色体的全部基因的遗传 作图和物理作图，完成23对染色体上30亿个碱基的 序列测定A以美国为主、包括英国、法国、日本和中国多国科 学家参加的国际合作计划基因组细胞内染色体的总和,染色体组基因组亦称*CC，ir iiI I 1 I I-U II II Si K II y 1 1 1 V W w-IC”“11*从DM到染色体*色律1DK4 宁 213 YAC图的1.递传图 分辨率1MbII IIBMilM21号染色体(37Mb rm eed 多福秘2.物理图 分辨率100 kb4 核营序列 ATGCCGGATTGCAT1.用RFLP等标记出包含大约1 Mb的超大片段进行定位作 图2.用RFLP把超大片段分割成 10多个包含100 kb的大片段,做出它们的物理图3.用酵母人工染色体(YACs)或其他载体构建包含其中小 片段的一系列重叠的克隆，约0.51.0 Mb4.对小片段逐个进行测序，进而实现对整个染色体的测 序和作图G c n=:d也IN5RrDI95 T79096432DI95429DI96730B105r.18。DI9522、L DI95601 f JIn su II n-reel stan td 励如 5(IN5R)_ F4m自IWperchdesNroleE g(LDLR)FudoflchonJroplasla(COMP)rRWDI952D0AT0C2DMDI95254Hemolytic ancrria(GFI)Malignant hypcrthcrwla(R次 1)Myotonic dystrophy(DM)A 1992年，酵母3号染色体DNA的全部315 357个碱基序列的测 定，这是人类完成的第一条真核生物染色体DNA的全序列。1995年，科学家们获得了人类第3、第16和第22号染色体的 高密度物理图。1996年，科学家们完成酵母其他15条染色体的碱基序列测定。1997年，大肠杆菌基因组序列测定宣告完成。1999年12月1日，科学家们宣布，人类第22号染色体，含3.34X 107个碱基序列的测定已经全部完成，这是人类完成 的第一条人类自身染色体的全序列测定。A 2000年6月26日，人类基因组工作框架图完成，标志着功能 基因组时代的到来。科学家们对人类基因组的性质和作用的认识在不断地深化。未来：健康领域、基础科学研究领域2001年2月12日美、英、日、法、德、中 六国科学家，以及Cel era公司联合公布 人类基因组图谱，及初步分析结果NATURE|VOL 409|15 FEBRUARY2001|SCI ENCE|16FEBRUARY2001|www.sciencemag.org本章摘要重组DNA技术的一般操作步骤有：（1）获得目的基因；（2）构建重 组质粒；（3）转化受体细胞；（4）筛选和鉴定转化子；（5）培养转化细 胞获得所需性状或所需产物。获得目的基因的方法有：提取总DNA构建基因文库并从中调用；以mRNA为模板合成互补DNA片段；利用PCR特异性扩增所需目的基因片 段等。用紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。用限制性内切酶识别并切开核酸序列特定位点，将外源基因插入 到载体中，用重组载体转化宿主细胞，外源基因将随宿主的繁殖而复 制，这种过程称为基因的克隆。凝胶电泳是用于分离、纯化和鉴定DNA片段最常规的实验技术。可依据DNA分子的大小来使其分离。还可以利用DNA杂交技术直接鉴定 带有重组质粒的细菌克隆。利用载体法或基因直接转移等技术将外源目的基因转入合适的宿 主细胞中进行表达，获得所需表达产物或所需性状。用Southern杂交 对转基因生物外源目的基因进行检测分析。细菌质粒pUC181.该质粒比较小，可以插入一段较长的DNA片段。2.进入宿主细菌细胞后，PUC18在每个细胞中可复制 形成大约500个拷贝。3.在PUC18中有一小段人为设计和插入的具有多种限 制性酶切位点的序列，即多克隆位点思考题克隆载体包括哪些基本的结构元 件,简述DNA克隆的过程？