流感相关知识及实验室检测.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,流感的相关知识及实验室检测,微生物检验科,一、流感病毒的生物学特征,流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。流感病毒分为甲、乙、丙三型。,甲型流感病毒常以流行形式出现，引起世界性大流行，在动物中广泛分布，并也能在动物中引起流感流行和造成动物大量死亡。,乙型流感病毒常引起流感局部暴发，不能引起世界性大流行，也没有在动物中存在的证据。,丙型流感病毒主要以散在形式出现，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流行。,流感病毒属于正粘病毒科，病毒颗粒多形态或球形，直径,80,120nm,，丝状体可达数微米。病毒的毒粒结构可分为三层：最外层为双层类脂囊膜，膜上覆盖着血凝素（,H,）、神经氨酸酶（,N,）、,M2,蛋白。囊膜上的突起，一种像三角形、细长的、能凝集红细胞的称血凝素（,H,），另一种像蘑菇样、能使病毒颗粒从吸附的红细胞表面释放下来的叫神经氨酸酶（,N,）。中间层为球形蛋白壳，是由基质（,M1,）蛋白形成的，有一个或若干个分子厚。里层为核壳体，呈螺旋对称，直径,9,15nm,，包含核蛋白（,NP,），三种多聚酶蛋白（,PB1,，,PB2,，,PA,），病毒单链的,RNA.,病毒是专性活细胞内寄生物，不能单独进行繁殖，必须在活细胞内才能繁殖。,整个复制周期概括起来分为：吸附，侵入，脱壳，生物合成，装配与释放等,5,个步骤。,流感在流行病学上最显著的特点为：突然爆发，迅速蔓延，波及面广，具有一定的季节性，,发病率高，死亡率低,，多发于青少年，一般不留后遗症，每次流行后在人群中总要造成不同程度的超额死亡，死亡者多为年迈体衰或有慢性疾病的患者。,流感经呼吸道飞沫传播，潜伏期短，一般为,1,3,天。,人对流感病毒普遍易感。病人是流感的主要传染源，隐性感染者因不易被人察觉，可自由活动，也易向周围人群传播病毒。,一般来讲，,流感病毒对热敏感,，,5630min,被灭活。,4,-40,条件下不稳定，,-70,以下或冷冻干燥后置,4,可长期保存。流感病毒最适,PH,值,7.0,8.0,。流感病毒能被紫外线灭活，对乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂、氧化剂、卤素化合物、重金属、去污剂等均敏感。,人流感病毒只,感染呼吸道表面粘膜上皮细胞,，并在这些细胞中繁殖。如果把活流感病毒注入易感者皮下或肌肉内，病毒不能繁殖，但可引起高热头痛、白细胞减少等症状。,二、流感监测的意义,流感为第一个实行全球性监测的传染病,，目前已有,80,多个国家、,110,余个国家,/,地区流感中心组成了全球性流感监测网络。,流感实验室监测最主要的目的是及时发现并抓到有意义的新变异株，尤其大流行株，提供给诊断试剂制备和疫苗生产；准备做好流感疫情预报。,自人流感病毒被发现以来，人甲型流感病毒出现过四个亚型均首发于我国。,1968,年以来所出现的新变异株绝大多数也首发于我国。因此我国流感动态已引起,WHO,和世界各国的关注，甚至有人提示我国的南方是世界流感流行的中心。,三、流感监测的方法,流感病毒在我国的活动规律南北存在明显的差异。长江以南地区，流感活动季节性不太强，每年有两个活动峰，一个在冬春季，另一个在夏季；,长江以北地区具有较严格的季节性，每年只有一个冬春季高峰。,在辽宁省，流感监测方案规定流行周每周至少采集,1015,份，非流行周每周至少采集,510,份，流行季节（每年,10,月至次年,3,月）至少采集,120,份。,流感样病例定义：体温,38,，伴有咳嗽或咽喉痛、全身痛等症状的急性呼吸道传染病病例。,流感监测对象为发病三天之内的流感样病例，监测时采集的标本一般为咽拭子、鼻拭子或含漱液。当有流感暴发疫情时，应尽量收集典型病例的,鼻咽拭子、含漱液、血清、抽吸液,等标本。标本应在,4,保存,24,小时内送至实验室，实验室对收到的标本最好,24,48,小时内进行接种。,四、流感病毒实验室分离,1,、,MDCK,细胞传代技术,2,、流感病毒接种技术,3,、血凝实验,1,、,MDCK,细胞传代技术,把需用的溶液置室温或,37,恒温箱预温；,把已长成片的,MDCK,细胞生长液倒掉；,把,Versene,与,0.25%,胰酶按,7,：,1,5,：,1,的比例配制成消化液，每瓶细胞加入适量的消化液，置,37,恒温箱中消化，此期间要经常在倒置显微镜下观察。,当细胞变圆，细胞与细胞间互不相连，表明消化时间已到。,倒掉消化液，每瓶加入适量的细胞生长液，用毛细吸管将细胞轻轻吹下吹散。,加入适量细胞生长液，混匀。分装并留下原瓶。,将分装好的细胞瓶放入,37,恒温箱中培养，约,3,7,天可长成片。,长成片的细胞即可进行病毒接种。,细胞培养中应注意的一些问题：,1,、消化时间过长。胰酶浓度过低或保存时间过长。,2,、细胞的保存问题。,3,、温度的问题。温度增加,23,对细胞产生不良影响，使之在,24,小时之内死亡。低温对细胞影响小。,4,、污染的问题。,预防和避免污染是细胞培养成功的关键。,污染的预防,添加抗生素,实验时使用的器具用品消毒灭菌,操作者严格遵守操作规程,定期更换实验室及生物安全柜的滤膜,发生污染后对实验室进行彻底消毒,2,、流感病毒接种技术,接种前先将标本管内的棉签取出，用小镊子摘下棉签头，在管内反复挤压后弃去。,向标本管内加入抗生素放,42,小时。目的：抑制细菌生长。,将长成片的细胞弃去细胞生长液，用,Hanks,液洗,2,遍，加入标本,0.5,1ml,，放,33,35,恒温箱内,2,小时。目的：使病毒吸附在细胞上。,弃去标本液，用,Hanks,液洗,2,遍，加入,2,倍于细胞生长液的病毒维持液，放,33,35,恒温箱内培养。目的：使病毒在细胞内繁殖。,逐日观察细胞形态，当有,75,100%,的细胞发生病变即可收获病毒。,细胞病变形态包括拉丝、脱落、圆缩等。,7,日仍未发生病变的视为阴性。盲传一代，仍为阴性的可报告为阴性。,3,、血凝实验,第一孔加入,100l,病毒液，其下各孔均加入,50l,生理盐水；,由第一孔开始做倍比稀释，最后一孔弃去,50l,液体；,每孔内加入,50l 1%,血球，混匀；,室温静置,30,60,分钟观察结果。以生理盐水做阴性对照。,血球均匀凝集为,+,；,血球凝集但上缘有卷边为,+,；,血球沉积成较大的圆环，周围有较多凝集颗粒为,+,；,血球沉积成较小的圆环，周围有少量凝集颗粒为,+,；,血球沉积成较小的圆环，周围基本没有凝集颗粒为,；,谢谢！,