HIV感染的实验诊断.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,HIV感染的实验诊断,白立石,北京市疾病预防控制中心,艾滋病确认中心,2008年5月,一、,HIV,感染后的免疫和病毒学,HIV,的基因组结构和蛋白,基质 衣壳 核衣壳 表面糖蛋白 跨膜糖蛋白,蛋白酶 反转录酶 整合酶,HIV,结构基因,有,3,个,env(,核苷酸,5781-8360),编码包膜蛋白,p160,、,120,、,41,等。,gag(,核苷酸,310-1860),编码病毒核心,/,衣壳蛋白,p55,、,24,、,15,、,17,；,pol(,核苷酸,1629-4673),编码逆转录酶,(RT),、,p66,、,51,、,32,、,11,等；,HIV,调节基因,有,6,个,tat:,上调,mRNA,促病毒复制,-,启动,rev:,调节病毒,mRNA-,开关,vif:,增强出芽,释放新病毒颗粒,-,感染因子,nef:,下调,mRNA,抑病毒复制,-,制动,vpu:,仅见于,HIV-1,功能不详；,vpx:,仅见于,HIV-2,功能不详。,5,days,脑部：巨嗜细胞和胶质细胞,淋巴系统,:,胸腺,淋巴结,脾脏,肠道：嗜铬细胞,前列腺精液,阴道黏液,骨髓,肺胞巨嗜细胞,血液,细胞积存,:,CD4,+,T,淋巴细胞,巨嗜细胞,胶质细胞,嗜铬细胞,Image from:,Kahn and Walker,M.D.NEJM 1998,Volume 339:33-39,July 2,HIV,感染者的三种临床转归,Virus,CD4,CD8,a,HIV,CD4,CD4,CD8,CD8,a,HIV,Virus,Virus,典型,8,10 y,快速,:4-5 y:(2%),缓慢,/,长期不进展,:10 y:(2%),二、,HIV,酶联筛查检测方法和试剂,感染急性期，,窗口期,检测试剂以,ELISA,为主，还有,PA,，斑点免疫胶体金和免疫层析。,ELISA,试剂为,HIV1/2,型，包括,M,和,O,组，,N,组不包括但很少。,三四五代酶联试剂的差异和使用策略：,三代成熟质量稳定，窗口期,20d;,四代提前,4,9d,，质量不稳定，用于血站急性感染的检测。,筛查试验和确认试验的差异：,酶联试验敏感性高于确认试验，四代试剂敏感性更高，确认阴性的不一定是真阴性。,（一）,HIV,抗体,ELISA,检测试剂（血液）,第三代：,双抗原夹心法，可检测所有类型抗体，由于能检出,IgM,抗体，缩短了窗口期，有报道说较第二代产品平均可提前,5,天作出诊断。,第四代：,双抗原（抗体）夹心法，将,HIV P24,抗体和,HIV,抗原同时包被，再加入待检血清，最后加入酶标记的,HIV,抗原和,HIV P24,单克隆抗体，同时检测血清中的,HIV P24,抗原和,HIV,抗体。,第五代：,HIV,抗体和,P24,抗原实现分别检测，真正实现早期诊断。,Fourth,Generation,Third,Generation,Second,Generation,IgM,IgG,各种HIV检测方法平均窗口期,方法平均天数,第,2,代,EIA,45,第,3,代,EIA,22,P24,抗原,16,HIV RNA,11,（二）、检测试剂的质量指标,灵敏度,诊断试验的灵敏度有两个不同意义：,1,代表一个试验能检测最少量被分析物（如抗体）的能力。通常可对阳性血清进行稀释以确认哪个试验更敏感。,2,指某试验检出阳性的能力（无假阴性）。一个试验有可能检出很少量的某抗体，但也可因试验中缺少适当的抗原而漏掉一些阳性样品。,2,特异性,指某试验正确鉴定所有阴性的能力（无假阳性）。大部分,HIV,筛查试验不是,100%,特异，可用公式计算,真阴性,特异度,=,100%,真阴性,+,假阳性,注：公式中真阴性指试验中所能检测的真阴性数。,如,100,份血清，,5,份真阳性，,95,份真阴性，与参考试验比较，某试验检出,6,份阳性（一份假阳性），则,特异性,=94/(94+1)100%=98.9%,3,试验效率,指某试验正确鉴定所有阳性和阴性的总体能力（无假阳性,或假阴性），是灵敏度和特异性的综合指标，反映了该试验的,总的效率。,真阳性,+,真阴性,试验效率,=,100%,真阳性,+,假阳性,+,真阴性,+,假阴性,注,:,公式中真阳性和真阴性指试验数目。,在以上例子中，检测,100,份血清，,5,份真阳性，,95,份真阴,性，,1,份假阳性，,1,份假阴性，因此,4+94,试验效率,=,100%=98%,4+1+94+1,4,预测值,预测值与以上的参数不同，它描述的是考虑了被检人群,中感染的流行因素后的试验评价。,阳性预测值（,PPV,）：定义为在所有阳性结果人群中感染,个体所占比例。,阴性预测值（,NPV,）：定义为在所有阴性结果人群中未感,染个体所占比例。,真阳性,阳性预测值,=,100%,真阳性,+,假阳性,真阴性,阴性预测值,=,100%,真阴性,+,假阴性,注：公式中真阳性和真阴性指试验数目。,在感染流行率较高（,5%,）的人群中,1000,人受检：,50,份真阳性（已感染），,950,份真阴性（未感染），,5,份假阳性（试验结果），,5,份假阴性（试验结果），计算,PPV=45/(45+5)100%=90%,NPV=945/(945+5)100%=99.5%,在另一人群有相同的结果（即相同数量的假阳性和假阴性）,在感染流行率较低的人群（,0.7%,）中,1000,人受检：,7,份真阳性（已感染），,993,份真阴性（未感染），,5,份假阳性（试验结果），,5,份假阴性（试验结果），计算,PPV=2/2+5=28.6%,NPV=988/988+5=99.5%,5,艾滋病病原诊断中的几个问题,明确不同实验方法的意义和适应范围：,HIV,血清学检测方法可分初筛和确证两类。,HIV,初筛试验,特异性不够强，有时会造成一些假阳性结果，故在初筛试,验出现阳性结果时，应再重复试验，若仍为阳性再用确证,试验（,West Blot,）去证实。,但一些非感染者的血液也会对某些抗原显示反应（出现的条 带不够判为阳性的标准），在正常的非感染者人群中发生比例,15%,，所以如果用,WB,来测,ELISA,阴性者的血清，有些标本被视为不确定。出现不确定结果时，可能是,HIV,早期感染或是非特异反应，应在,1-6,个月后复查，并结合个体的临床表现、感染因素、,WB,带型等综合分析后做出结论。,针对,HIV,感染不同时期选用不同的检测手段：,HIV,感染后两周内，无法查到抗体。两周后出现病毒血症，可用,P24,抗原检测方法或测逆转录酶活性。,6-8,周后抗体产生时，进行抗体检测。,诊断,HIV,感染在早期可检测抗原，而在感染后的大多数时间，可用血清学方法诊断。,HIV,抗体测定的预测值：试剂的敏感性和特异性可衡量优劣，但不能完全决定一个测定结果正确与否的可能性大小，与预测值关系更大。,預測值除与试剂好坏有关外，还取决于测定对象本身患病率的高低。由表,1,可以看出：在用,ELISA,法对高危人群检测时，其阳性预测值为,99.98%,，而在非高危人群中，阳性预测值仅为,18.94%,（即查出阳性结果是真阳性的机率只有,18.94%,），反之阴性结果的机率为,99.997%,。,表,1 ELISA,法,HIV,1,抗体测定的预示值,人群,预示值,(%),阳性 阴性,旧金山同,性恋人群,99.98 80.06,美国非高,危人群,18.94 99.997,HIV,抗体检测反应强度与,HIV,感染的概率：,ELISA,法可根据光密度（,OD,）值的强度直接确定。反应越强的血清，含有,HIV,抗体的可能性就越大。表,2,中正常献血员（感染率,30/10,万），中等强度反应时，,HIV,抗体阳性概率仅为,1%,，高强度反应时，则为,86.1%,。见表,2,。,不仅要看阴阳结果，还要看反应强度或,S/CO,比值。,表,2 HIV,感染机率与,ELISA,反应强度的关系,人群,HIV,感染率（,/10,万）,ELISA,反应强度（,%,）,低度 中度 高度,非高危献血员,30,0.0007,1.13,86.1,高危献血员,95,0.0022,3.48,95.2,军人,150,0.0036,5.39,96.9,吸毒者,45000,1.91,96.6,99.9,注：,1,、数字表示相应强度反应的血清中含有,HIV,抗体的概率,2,、低度为,S/CO1,中度为,1S/CO6,。,三、确认试验,WB为主，还有：线性免疫试验（LIA）,放射免疫沉淀试验（RIPA）和免疫荧光试验（IFA）。,WB存有培养病毒的宿主细胞成分，容易出现非特异性反应造成不确定结果，LIA使用重组蛋白（多肽），非特异性大大减少，试剂盒有INNO-LIA,Pepti-Lav等。IFA很少使用。,（一）、,HIV,抗体强度与抗体带型的关系,抗体带型,15,全带型,8,条带型,6,条带型,5,条带型,4,条带型,3,条带型,2,条带型,1,条带型,1,1,1,5,1,6,4,2,106,7,2,1,2,2,46,1,2,合计,1,2,18,120,49,（二）、,HIV,病毒载量与抗体带型的关系,载量,带型,510,510,2,510,2,10,3,10,3,10,4,10,4,10,5,10,5,全带型,8,条带型,6,条带型,5,条带型,4,条带型,3,条带型,2,条带型,1,条带型,4,1,1,8,1,71,4,1,2,1,66,3,3,1,2,1,1,1,8,3,3,2,2,合计,6,9,79,78,18,（三）、造成,WB,假阳性或不确定的原因,1.,实验室操作中，阴性样本被污染或洗涤不彻底。,2.HIV,感染急性期，窗口期附近，,仅显示,gp160,或,120,，或,P24,，,P31,，,P55,带；此时,ELISA,往往已显示阳性反应,3.,晚期,AIDS,病人，部分抗体如,P24,，,P31,丢失,4.,其他病毒感染的交叉反应，如风疹，麻疹，腮腺炎等,5.,自身免疫病，高丙种球蛋白血症（全身性红斑狼疮）,6.,肾衰竭和血透析,7.,遗传性胰腺囊肿,8.,多次怀孕或输血,9.,肝病,10.,乙肝、狂犬等疫苗注射，使用胸腺肽。,11.,线粒体核酸和,T,细胞白细胞抗原引起的抗体,在无高危行为的献血和孕妇人群中，,WB,不确定率10-15%，甚至高达,32,.Gag,蛋白抗体条带最常见。,ELISA,筛查阳性结果中，,WB,不确定占,4-20%,俄罗斯报告占,12.7%,。,我国，,125,份确认为,HIV-1,抗体阳性,;,条带出现百分率为：,gp160,、,p24,为,100%,gp120,、,gp41,、,p66,、,p51,和,p31,在,96%,以上,p17,、,p55,分别为,86.4%,和,85.6%.,上海，,36,例,WB,试验,gp120,和,p24,双阳性者的跟踪随访和核酸辅助诊断发现，至少,24,例可判定为,HIV-1,感染。,5,例样本的核酸测定结果与血清学随访检测结果的符合率达到,100%,。,25,例随访到的对象中，,18,例样本平均,17,天后条带有明显进展，可以判定为,HIV,抗体阳转。,（四）,WB,不确定结果的有关数据,（五）假阴性结果,指,EIA+WB,的假阴性,原因,急性感染后的抗体迟反应,不同,HIV,毒株型,发病晚期抗体消失,窗口期：几周到6个月，与当地,HIV,流行率有关,HIV,亚型，,M/N/O,组间差异,（六）、确认试验不确定标本的常规处理,按照,全国艾滋病检测技术规范（,2004,年版）,的要求，只能作,“3,个月后复检,”,的处理，三个月后复检,1,次，连续,2,次，共,6,个月。,其转归有两种可能：仍呈现不确定或阴性，则诊断为,HIV,抗体阴性；带型发生进展，符合,HIV,抗体阳性判断标准，则诊断为,HIV,抗体阳性。后者是真正的,窗口期感染者,（一般为,2-3,个月，最长,6,个月）,，只占很小的比例；大多数为非感染者，但由于,WB,反应的敏感性而出现条带。,如有必要，可用辅助诊断方法对不确定样本进行实验诊断。,确认结果不确定标本的辅助诊断,1,、病毒载量：,RT-PCR,NASBA,b-DNA,，高拷贝的结果提示感染。小于,18,个月婴儿在,10000,拷贝,/,毫升应做,HIV,感染处理。注意不同方法间结果的差异，阴性不排除感染。,2,、免疫标志物：,CD4/CD8,CTL,微球蛋白和,Neopterin,等。,CD4,计数常用，,CD4/CD8,小于,1,提示感染。,3,、核酸定性：,DNA,PCR,或,RT-PCR,，阳性不能单独用于感染的诊断，阴性不排除感染。,4,、,P24,抗原检测：阳性结果需经中和实验确认，才提示,HIV,感染。阴性不排除感染，因敏感性低：,30,80,。,5,、病毒分离：特异性好，但敏感性不高，潜伏期难分离,6,、流行病学调查和临床症状：近期是否有,HIV,高危行为，是否有急性期的相关症状。,四、,HIV,感染的早期（窗口期）诊断,1,、早期诊断的意义 通常窗口期急性感染时出现病毒血症，此期间病毒载量，,P24,抗原均很高，是,HIV,快速复制阶段，具有高感染力；以下情况下，非常有必要尽快开展,HIV,感染早期诊断：（,1,）安全用血,-,窗口期血液筛查；（,2,）个体需求,-,暴露后诊断，包括通过输血、静脉吸毒、针刺等的血液暴露，以及同性恋、异性恋等性途径暴露；（,3,）各种职业暴露后的风险评估，医生警察。,2、早期感染的诊断方法,抗原检测,P24,抗原,EIA,试剂试剂盒在血清抗体阳转前,2-18,天即可以检测到。第四代,HIV ELISA,试剂敏感性和特异性均有了很大提高，可以作为血源筛查；,病毒,RNA,定性与定量检测 第一次病毒血症高峰时间大约在感染后,4-11,天，可以用核酸检测进行辅助诊断。,应用辅助诊断时方法时，应综合考虑流行病史、核酸检测值、临床表现、其他检测（病毒分离，,CD4,细胞，抗原）等。,