基因工程核酸杂交培训课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程核酸杂交,*,基因工程核酸杂交,基因工程（gene engineering）：,又称为重组DNA技术，是指将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内复制和表达的技术。,分子克隆（molecular cloning）:,是指在体外将制备的DNA片段与载体重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝的技术。,2,基因工程核酸杂交,第一节 工具酶,第二节 载体,第三节 分子克隆的基本步骤,第四节 基因工程的应用,主要内容,3,基因工程核酸杂交,限制性核酸酶内切酶,DNA,聚合酶,DNA,连接酶,碱性磷酸酶,核酸酶,S1,第一节 工具酶,4,基因工程核酸杂交,第一节 工具酶,一、限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶定义,限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease,RE),是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,5,基因工程核酸杂交,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；,第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；,第四个字母代表株；,用罗马数字表示发现的先后次序。,命名,H,in,d,属,系,株,序,H,aemophilus,in,fluenzae,d,株,流感嗜血杆菌,d,株的第三种酶,第一节 工具酶,一、限制性核酸内切酶,6,基因工程核酸杂交,作用 ,三种限制性核酸内切酶的作用,酶活性,核酸内切酶,核酸内切酶,核酸内切酶,甲基化酶 甲基化酶,ATP酶,DNA解旋酶,DNA链上的,无,有,有,特异识别位点,DNA链上的,无,在识别序列内,在识别序列外,特异切割位点,在分子克隆中,无,有,无,的重要意义,7,基因工程核酸杂交,类酶识别序列特点,回文结构,(palindrome),切口：,平端切口,、,粘端切口,GG,A,T,CC,CC,T,A,GG,第一节 工具酶,一、限制性核酸内切酶,8,基因工程核酸杂交,Bam,H,GTC,CAG,G,CCTAG,GATCC,G,+,GGATCC,CCTAGG,Hin,d,GTCGAC,CAGCTG,GAC,CTG,+,平端切口,粘端切口,第一节 工具酶,一、限制性核酸内切酶,9,基因工程核酸杂交,限制性核酸内切酶的主要用途,1）在分子克隆过程中切割DNA以获取目的基因片段、切割载体形成切口，使目的基因能插入载体。,2）分析限制性片段长度多态性（RFLP），用于遗传病的诊断，法医DNA指纹分析等。,3）用于构建DNA的物理图谱、基因定位及DNA同源性分析等。,第一节 工具酶,一、限制性核酸内切酶,10,基因工程核酸杂交,DNA聚合酶和Klenow片段,Taq DNA聚合酶,逆转录酶,末端脱氧核糖核苷酰转移酶,第一节 工具酶,二、DNA聚合酶,11,基因工程核酸杂交,1、DNA聚合酶和Klenow片段,DNA-pol是单一肽链的多功能酶，,分子量为103kd，它具有3种酶活性：,1)5,3,聚合酶活性,；,2)3,5,核酸外切酶活性,；,3)5,3,核酸外切酶活性。,第一节 工具酶,二、DNA聚合酶,12,基因工程核酸杂交,第一节 工具酶,二、DNA聚合酶,1、DNA聚合酶和Klenow片段,5,3,外切酶 5,3,聚合酶 3,5,外切酶,(103kD),Klenow 片段,N C,5,3,聚合酶 3,5,外切酶,(68kD),35kD(小)68kD(大),N,枯草杆菌蛋白酶,13,基因工程核酸杂交,Klenow片段的主要功能有：,1)补齐双链DNA的3,末端，同时可使,3,末端,DNA标记同位素；,2)在cDNA克隆中，合成cDNA第二链；,3)DNA序列分析。,第一节 工具酶,二、DNA聚合酶,1、DNA聚合酶和Klenow片段,14,基因工程核酸杂交,一种耐热的DNA聚合酶，分子量为65 kd，最佳作用温度是7080，Taq酶具有5,3,聚合酶活性和依赖于聚合作用的5,3,外切酶活性。,Taq DNA聚合酶可用于DNA测序及通过PCR对DNA分子的特定序列进行体外扩增。,第一节 工具酶,2、,Taq DNA聚合酶,15,基因工程核酸杂交,依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板、4种dNTP为底物，催化合成DNA，其功能主要有：,1)逆转录作用,；,2)核酸酶H的水解作用；,3)依赖DNA的DNA聚合酶作用。,。,第一节 工具酶,3、,逆转录酶,16,基因工程核酸杂交,5,3,3,5,RNA,(用 表示),RNA,-,DNA,杂化分子,3,5,RNase （,核酸酶H活性,),DDDP,（DNA聚合酶活性）,4种,dNTP,RDDP （,逆转录酶,）,引物、4种,dNTP,病毒双链DNA,用 表示）,（,cDNA第二链,(complementary DNA，,cDNA,),与病毒RNA,互补的DNA,(用 表示),5,3,3,5,5,3,5,3,17,基因工程核酸杂交,分子量为60 kd，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3,末端,-OH上。,功能主要有：,1)在载体或目的基因 3,末端加上互补的同质多聚尾，形成人工粘性末端，便于,DNA重组连接。,2)用于DNA 3,末端的同位素探针标记,。,第一节 工具酶,4、,末端脱氧核糖核苷酰转移酶,18,基因工程核酸杂交,(,A、G、C、T,),n,OH,5,3,5,3,OH,5,3,5,3,(,A、G、C、T,),n,Mg,2+,dNTP,n,ppi,Mg,2+,dNTP,n,ppi,5,3,OH,5,3,OH,5,3,5,3,(,A、G、C、T,),n,Co,2+,dNTP,n,ppi,Co,2+,dNTP,n,ppi,（1）底物是,单链DNA,或有,3,突出末端,的双链DNA，需要,Mg,2+,。,（2）底物是,平端,或,3,凹端,的双链DNA，需要,Co,2+,。,(,A、G、C、T,),n,19,基因工程核酸杂交,大肠杆菌DNA连接酶和T4 DNA连接酶两种类型，,分子量分别为7500和6000，两者的辅基不同，,前者需NAD+，后者需ATP。,它们催化的反应也不尽相同，大肠杆菌DNA连接,酶只能连接粘性末端，而T4DNA连接酶既能连接,粘性末端，又能连接平末端。,第一节 工具酶,三、,DNA连接酶,20,基因工程核酸杂交,第一节 工具酶,三、,DNA连接酶,21,基因工程核酸杂交,催化去除DNA、RNA或dNTP上的5,-,磷酸基团，,其主要用途有：,1)除去DNA片段上的5,磷酸,，以防自身连接。,2)在使用T4多核苷酸激酶和,32,P同位素标记前，,除去RNA或DNA上5,端的磷酸。,第一节 工具酶,四、,碱性磷酸酶,22,基因工程核酸杂交,核酸酶S1可水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交分子中的单链部分。,其主要作用有：,除去粘性末端以产生平末端。,除去,cDNA,合成时形成的发夹结构。,分析,RNA,的茎环结构和,DNA-RNA,分子的杂交情况。,第一节 工具酶,五、,核酸酶S1,23,基因工程核酸杂交,功能：,水解,双链DNA,、,RNA,或,DNA-,RNA,杂交体中的,单链部分,。,核酸酶S1,核酸酶S1,核酸酶S1,+,第一节 工具酶,五、,核酸酶S1,24,基因工程核酸杂交,第二节 载体,指能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具,。,载体的本质为DNA,。,制备的,目的基因,或,外源性DNA,片段必须与合适的,载体,连接形成重组体，才能进入受体细胞并进行复制和表达。,载体包括,克隆载体,和,表达载体,。,载体（vector）:,25,基因工程核酸杂交,常用的载体有：,质粒、噬菌体、粘粒、酵母质粒,和,病毒等。,载体大都经过,改造,，如质粒改造后携带某些选择性标记和克隆位点的遗传信息；,噬菌体改造后只保留同一种限制酶的单个或两个切点。在常用的克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件（DNA序列）即为表达载体，它不仅可携带外源基因片段进入宿主细胞，而且可在宿主细胞中表达外源基因。,第二节 载体,26,基因工程核酸杂交,能,自我复制,并具较高的拷贝数。分子量一般 10Kb。,带有,遗传筛选,标记。,有适当的限制,酶切位点,，便于外源基因的插入和筛选。,载体上具有多个限制酶的单一位点（即在载体其他部位无这些酶的相同位点）称为多克隆位点,（multiple cloning sites，MCS）,。,载体,应具备的特征：,第二节 载体,27,基因工程核酸杂交,能将载体外源基因在受体细胞中复制扩增并产生足够量目的基因的载体称为,克隆载体,。,（一）质粒载体,质粒,（plasmid）,是指细菌染色体以外的小分子环状双链DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息,。,第二节 载体,一、克隆载体,28,基因工程核酸杂交,用于保存和扩增 2Kb目的DNA。,构建cDNA文库。,目的DNA的测序。,作为核酸杂交时的探针来源。,质粒克隆载体的主要用途：,第二节 载体,（一）质粒载体,29,基因工程核酸杂交,pBR322质粒是由一系列,大肠杆菌质粒DNA,通过DNA重组技术构建而成的双链克隆载体，长为4.36Kb。,它含有一个能保证高拷贝自我复制的,复制起始点,（Ori），并装有,四环素抗性（Tet,r,）基因,和,氨苄青霉素抗性（Amp,r,）基因,供菌落筛选。,在这两个抗性基因中分别含有,BamH,I和,Pst,I等限制酶的,单一酶切位点,，用于插入外源DNA片段。如有外源基因的插入，会导致这些标志性基因的失活。,30,基因工程核酸杂交,复制起始点,抗药基因,抗药基因,第二节 载体,（一）质粒载体,31,基因工程核酸杂交,pUC系列载体是由pBR322质粒和M13噬菌体重组构建而成的,双链DNA质粒,载体。,pUC18和pUC19质粒长约2.69Kb，除多克隆位点互为相反方向排列外，其它序列均相同。,PUC质粒系列还包括pUC8、pUC9和pUC118、pUC119，它们的区别在于MCS的限制酶识别位点数目不同，而每一对pUC质粒的MCS中限制酶识别位点数目相同、顺序相反。,32,基因工程核酸杂交,pUC质粒含,Amp,r,，可供菌落筛选。载体中装入一个来自大肠杆菌乳糖操纵子的DNA片段（,lacZ,基因,），该基因编码,-半乳糖苷酶氨基端的一个片段，IPTG可诱导此片段合成，而此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型,-半乳糖苷酶实现基因内互补（,-互补,），形成完整的,-半乳糖苷酶。,-半乳糖苷酶能催化指示剂底物5-溴-4-氯-3-吲哚-,-D-半乳糖苷（X-gal）形成蓝色菌落。pUC载体的lacZ,基因中含有MCS，当外源基因插入MCS，lac,-肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无,-半乳糖苷酶活性，菌落呈白色（即半乳糖苷酶的,蓝白斑筛选,实验）。,第二节 载体,（一）质粒载体,33,基因工程核酸杂交,pUC18、pUC19质粒载体,第二节 载体,（一）质粒载体,34,基因工程核酸杂交,噬菌体,（bacteriophage，phage）,：指感染细菌的病毒,。,按其生活周期分为两种类型：,溶菌性噬菌体,：指噬菌体感染细胞后，,连续增殖,，直到,细菌裂解,，释放的噬菌体又可感染其它细菌。,溶原性噬菌体,：指噬菌体感染细胞后，可将自身的DNA,整合,到细菌的染色体中去，和细菌染色体一起复制。,第二节 载体,（二）噬菌体载体,35,基因工程核酸杂交,噬菌体,野生型的,噬菌体是,线性双链DNA,，全长,48.5Kb,，其中,60%（约30Kb）是溶菌生长所必需,，中间,40%的区域为非必需，可被外源DNA片段代替,而不影响,噬菌体的生存。,噬菌体,5,末端,含,12核苷酸的互补单链顺序，是天然的粘性末端,，称为,cos位点,，,噬菌体感染宿主菌后，其粘端通过碱基配对而结合，形成环状DNA分子。,第二节 载体,（二）噬菌体载体,36,基因工程核酸杂交,噬菌体的结构,第二节 载体,（二）噬菌体载体,37,基因工程核酸杂交,用途：,用作一般的克隆载体。,用于构建基因组或cDNA文库（22Kb）。,用于抗体库或随机肽库的构建。,核酸的序列分析。,重组噬菌体的分子量必须在野生型噬菌体的,75%105%,之间。,重组噬菌体,筛选标记：,外源基因插入型：,蓝白斑,(LacZ)筛选,外源基因置换型：,噬菌斑数目,（red和gam基因，转染率高1001000倍）,第二节 载体,（二）噬菌体载体,38,基因工程核酸杂交,M13噬菌体,含一约6.4Kb的单链（正链）闭环DNA分子。M13噬菌体在细菌内呈溶源状态生长，,成熟的子代噬菌体中只有一条含外源DNA的链（负链）,。改造过的M13噬菌体引入了带有大肠杆菌,LacZ,的调控序列和,N端部分氨基酸的编码信息,以及,多克隆位点,序列，因此也可用蓝白斑筛选重组体。M13噬菌体载体主要用于目的,DNA的测序和单链放射性探针的制备,，克隆的外源DNA一般,1Kb,。,第二节 载体,（二）噬菌体载体,39,基因工程核酸杂交,M13,噬菌体在细菌内的复制模式图,噬菌体,正链,复制,复制型,DNA,经pII蛋白,造缺口,3,5,5,3,3,5,滚环复制,释出单链DNA,(,正链,),经pII,蛋白,剪切,进入下,一循环,第二节 载体,（二）噬菌体载体,40,基因工程核酸杂交,M13噬菌体,特点：,野生型M13噬菌体为6.4Kb左右的闭环正链DNA分子。,克隆的外源基因片段,1kb,。,M13,噬菌体能以,单链,和,双链,两种方式存在，可用于,感染,(经包装的单链DNA)和,转化,(双链DNA)。,M13中引入的,多克隆位点,，正好插入,LacZ基因,内，可利用蓝白色噬菌斑筛选重组体。,M13噬菌体只,降低,宿主细胞的生长速度，而,不溶解,宿主细胞（,呈溶源状态生长，,故可从细菌培养液中获得噬菌体，制备单链DNA）,。,第二节 载体,（二）噬菌体载体,41,基因工程核酸杂交,组成：,携带,抗药基因,。,质粒复制的起始位点(,ORI,)。,用于插入目的基因的,单一酶切位点,。,噬菌体的,cos位点,。,第二节 载体,（三）粘性质粒(cosmid),42,基因工程核酸杂交,加入,噬菌体,头部和尾部蛋白，可将粘粒包装成类似于,噬菌体,的具感染能力的颗粒，容易进入大肠杆菌。,粘粒进入细菌后则完全失去,噬菌体,的功能，而表现,质粒,的特性。,特点：,粘粒（粘性质粒）载体大小为46Kb，而,插入外源基因长达4050kb。,用途：,克隆大片段DNA；构建基因组文库。,第二节 载体,（三）粘性质粒(cosmid),43,基因工程核酸杂交,酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）,是利用,酵母染色体DNA,和,大肠杆菌pBR322,改造而成,，,可以插入长达,1 000 Kb,的外源DNA片断。,根据其复制方式不同分为,三型,：整合型（YIP）、复制型（YRP）和附加体型（YEP）载体，YRP中插入酵母着丝粒区，构成酵母着丝粒质粒（YCP）载体。,第二节 载体,（四）酵母细胞中克隆基因常用载体,44,基因工程核酸杂交,三类载体的共同特点:,能在大肠杆菌中复制，并具有较高的拷贝数；,含有在酵母细胞中便于选择的遗传标记；,含有合适的限制酶切位点，以便插入外源基因。,YIP和YCP载体能稳定遗传但都是单拷贝、转化率低，多用于遗传分析；而YRP和YEP载体对酵母具有很高的转化活性、拷贝数较高但稳定性差，后者较前者稳定，是基因克隆中常用的载体。,第二节 载体,（四）酵母细胞中克隆基因常用载体,45,基因工程核酸杂交,（五）动物细胞基因克隆的载体,已构建并经常使用的动物病毒克隆载体有：,猿猴空泡病毒,40,（,simian,vacuolating,virus 40,，,SV40,）,载体,腺病毒（,adenovirus,）,载体,逆转录病毒（,retrovirus,）,载体,第二节 载体,46,基因工程核酸杂交,外源目的基因在新宿主细胞中是否克隆成功，是通过鉴定,克隆是否表达,的方法来证实，即产生克隆基因所编码的蛋白质，其每个环节都至关重要。,真核基因在原核细胞中表达需要,有效转录,及一系列,调控元件,，必须保证外源基因插入方向的正确性；受原核启动子的控制；必须能在大肠杆菌中有效转录和有效翻译。,基因表达、合成有功能的蛋白质依赖于,基因的有效转录、mRNA正确的翻译和翻译后加工。,第二节 载体,二、表达载体,表达载体,是指能将外源基因在受体细胞中有效转录和正确翻译的载体。,47,基因工程核酸杂交,为了判断某一待测DNA序列的生物活性，常采用报告基因（reporter gene）方法。,第二节 载体,二、表达载体,报告基因（,reporter gene）：,是指处于待测基因下游并通过转录和表达水平来,反映上游待测基因功能,的基因，又称报道基因。,48,基因工程核酸杂交,（一）原核细胞表达载体,原核细胞的表达载体主要是,大肠杆菌表达载体,。外源基因在原核细胞中表达需要重要调控元件。大肠杆菌表达载体是在克隆载体的基础上导入表达系统调控元件：,启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号。,第二节 载体,二、表达载体,49,基因工程核酸杂交,第二节 载体,二、表达载体,5,TTGACATATAAT/,3,-35区 -10区 转录起始点,Pribnow box,DNA,如乳糖启动子（Lac）、色氨酸启动子（Trp）、Tac启动子（Trp-Lac）以及PL和PR启动子等。,原核细胞启动子示意图,（一）原核细胞表达载体,1.启动子（promoter）：,50,基因工程核酸杂交,（一）原核细胞表达载体,2.SD序列,第二节 载体,二、表达载体,mRNA,51,基因工程核酸杂交,（一）原核细胞表达载体,终止子（terminator）：,一个基因的3,末端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶识别并停止转录的功能。,该序列含有一段富含,A/T,和富含,G/C的,回文对称结构，终止子转录后形成的RNA具有,茎环状局部二级结构,。,第二节 载体,二、表达载体,52,基因工程核酸杂交,-,NNAA,GCGCCG,NNNN,CCGGCGC TTTTTT,NNN,-,DNA,-,NNTT,CGCGGC,NNNN,GGCCGCGAAAAAA,NNN,-,G/C富含区2,G/C富含区1,A/T富含区,5,3,5,3,RNA,-,NN,AA,GCGCCG,NNNN,C,CGGCGC,UU,UUUU,NNN-OH,5,3,RNA结构,5,G C,N,N N,N,C,C G,C G,C G,G C,G C,A U,A U,NNNN,UUUU-,OH,3,DNA转录的强终止子模式图,转录,53,基因工程核酸杂交,（一）原核细胞表达载体,第二节 载体,二、表达载体,（1）非融合型表达载体pKK223-3。,（2）分泌型克隆表达载体PINlll系统,（3）融合型表达载体pGEX系统,54,基因工程核酸杂交,（二）哺乳动物细胞表达载体,真核表达载体的真核表达元件有：,启动子,/,增强子,克隆位点,终止位点和加,poly A,信号,。,1,原核,DNA,序列,包括能在大肠杆菌中自身复制的复制子和抗药基因的筛选标记。,2,启动子,转录起始位点上游,2530bp,有富含,AT,的,TATA,框，,TATA,框的上游约,100200bp,处为上游启动子元件。,3,增强子（,enhancer,）,是一类显著提高基因转录效率的顺式作用元件。,4,终止子和加,polyA,信号。,第二节 载体,二、表达载体,55,基因工程核酸杂交,既能在原核细胞中复制、又能在真核细胞中复制，在原核和真核细胞分子克隆中均能应用的载体称为,穿梭载体,（shuttle vector）,。,（一）穿梭粘粒载体,穿梭粘粒载体能携带真核DNA片段在细菌内扩增，并通过转染进入哺乳动物细胞进行转录和表达。这类载体常用于研究目的基因表达调控的组织细胞特性以及它所编码蛋白质的功能，也可从粘粒基因组文库中筛选出特殊功能基因,三、穿梭载体,第二节 载体,56,基因工程核酸杂交,（二）酵母穿梭质粒载体,酵母复制型载体,是,穿梭质粒载体，它,由酵母DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构建而成，除有细菌质粒复制子和抗药性标记外，还有酵母DNA片段提供的选择标记，同时又携带了自主复制顺序，由于该载体同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因，故能在两种细胞中存在和复制。,另外，由噬菌体、质粒与SV40病毒DNA元件也可构建成穿梭载体，Pac10重组病毒-质粒载体也是穿梭载体。,第二节 载体,57,基因工程核酸杂交,酵母穿梭载体示意图,酵母复制起始区,酵母YRP型,穿梭载体,Amp,r,酵母,Leu,2,细菌复制起始区,转化大肠杆菌,Amp,s,细胞,转化酵母,Leu,细胞,质粒可在大肠杆菌 和酵母之间穿梭,58,基因工程核酸杂交,第三节 分子克隆的基本步骤,一、目的基因的获取,二、载体的选择,三、目的基因和载体的酶切与连接,四、重组DNA导入受体细胞,五、重组体的筛选和鉴定,59,基因工程核酸杂交,第三节 分子克隆的基本步骤,60,基因工程核酸杂交,连接,含,重组子,的,阳性克隆,载体,+,目的基因,转化、筛选,和,鉴定,阳性克隆,DNA重组体,+,受体细胞,DNA 分子克隆的基本步骤,分、切、接、转、筛,第三节 分子克隆的基本步骤,61,基因工程核酸杂交,（一）从基因文库中获取,（二）逆转录法,（三）人工合成DNA片段,（四）直接从染色体DNA中分离目的基因,第三节 分子克隆的基本步骤,一、目的基因的获取,62,基因工程核酸杂交,（一）从基因文库中获取,目的基因,：指被研究的某一基因或DNA序列，即需要克隆或表达的基因。,基因组文库,（genomic library，G-文库）,是指含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群。,构建基因组文库时，先将原核或真核细胞染色体DNA提纯，通过机械或酶切使之成为一定大小的片段，将其与适当的载体相连接，经体外包装、转染细菌，得到一组含不同DNA片段的重组噬菌体颗粒。这个文库中含有基因组内全部基因片段，是一个贮存基因组全部序列的信息库，故称为G-文库。,第三节 分子克隆的基本步骤,一、目的基因的获取,63,基因工程核酸杂交,转染,（transfection）,是指以噬菌体、病毒或以它为载体构建的重组子导入细胞的过程。,如以细胞全部mRNA经逆转录，制备出全套cDNA建库，则称为,C-文库,。,第三节 分子克隆的基本步骤,一、目的基因的获取,64,基因工程核酸杂交,（二）逆转录法,本法是,应用得最多,的获取目的基因的方法。但,前提,是目的基因的序列已知，至少部分已知。,选用富含目的基因mRNA的细胞作为实验材料，有利于分离到目的基因,。如胰岛素基因的mRNA主要存在于胰腺组织，血红蛋白基因的mRNA占网质红细胞总mRNA的50%90%。用此法得到的目的基因进行克隆可获得较完整的连续编码顺序，易在宿主细胞中表达及筛选。,第三节 分子克隆的基本步骤,一、目的基因的获取,65,基因工程核酸杂交,（三）人工合成DNA片段,根据已知某种,基因的核苷酸序列,或某种,基因产物的氨基酸序列,，可推导出为该多肽编码的核苷酸短序列，再用DNA合成仪人工合成目的基因。此法适用于合成,分子量较小的目的基因,（100bp以内），如：人生长激素释放因子、血管加压素、干扰素、胸腺素及胰岛素原的基因等。,第三节 分子克隆的基本步骤,一、目的基因的获取,66,基因工程核酸杂交,（四）直接从染色体DNA中分离目基因,根据染色体DNA的限制性内切酶图谱，用适当的限制性内切酶切割染色体DNA、分离目的基因。本方法较,适用于制备原核生物目的基因,，,其原因为：,（1）,真核细胞染色体DNA有,丰富的内含子,，它们在原核细胞中转录后不能被剪接。,（2）真核细胞的基因多数为,单拷贝,，难以分离到足够量的目的基因。,第三节 分子克隆的基本步骤,一、目的基因的获取,67,基因工程核酸杂交,噬菌体和粘性质粒载体,常用来构建,基因组文库,，,构建,cDNA,文库,和克隆,较小,DNA,片段,常用,pUC,系列,等质粒，,3.M13,噬菌体,则用于克隆一些,待测的,DNA,序列,。,第三节 分子克隆的基本步骤,二、载体的选择,68,基因工程核酸杂交,(一)粘性末端连接,本法适用于在质粒和目的基,因上有,相同,单或双,酶切位点,第三节 分子克隆的基本步骤,三、目的基因和载体酶切与连接,69,基因工程核酸杂交,3,HO-G CTTAA-,p,5,5,p,-AATTC G-OH,3,3,HO-G,CTTAA-p 5,5,p-AATTC,G-OH 3,质粒,目的基因,目的基因和载体连接,EcoR,EcoR,碱性磷酸酶,3,HO-G CTTAA-,OH,5,5,HO,-AATTC G-OH,3,退火,DNA连接酶,3,HO-G CTTAA,G,CTTAA-p 5,5,p,AATTC G,AATTC,G-OH 3,70,基因工程核酸杂交,(二)平末端连接,质粒,产生,平末端,的,内切酶,DNA连接酶,目的基因,重组质粒,产生,粘性末端,的,内切酶,产生,粘性末端,的,内切酶,核酸酶S1,核酸酶S1,1质粒和目的基因上,没有相同的酶切位点,第三节 分子克隆的基本步骤,三、目的基因和载体酶切与连接,71,基因工程核酸杂交,2人工接头,第三节 分子克隆的基本步骤,三、目的基因和载体酶切与连接,72,基因工程核酸杂交,3.通过同聚尾连接,第三节 分子克隆的基本步骤,三、目的基因和载体酶切与连接,73,基因工程核酸杂交,质粒,目的基因,3,3,3,ACGTC G 5,5,G CTGCA 3,3,GnGGG,ACGTC G 5,5,G CTGCA,GGGGn,3,3,CnCCC,5,5,CCCCn 3,末端转移酶,dGTP,末端转移酶,dCTP,混合，退火,1）转化细菌2）体内修复,G,CCCC,GGGG,ACGTC,CTGCA,GGGG,CCCC,G,Pst,核酸外切酶,目的基因和载体连接,GACGT,C,CTGCA,G,G,ACGTC,C,TGCA,G,CCC,GGG,GGG,CCC,Pst,Pst,74,基因工程核酸杂交,细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取,外源DNA能力的细胞称谓,感受态细胞,(competent cell)。,以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导,入细菌的过程称为,转化,（transformation,）。,第三节 分子克隆的基本步骤,四、重组DNA导入受体细胞,75,基因工程核酸杂交,（一）遗传标记表型特征筛选,1抗生素抗性标记筛选,因大多数质粒载体带有抗生素抗性标记的特征（如Amp,r,、Tet,r,等），当带有完整抗性基因的载体转化无抗性细菌后，被转化的,阳性菌,获得抗生素抗性基因而存活并,形成噬菌斑,，未转化菌不能存活，但应排除未重组的空载体。,第三节 分子克隆的基本步骤,五、重组体的筛选和鉴定,76,基因工程核酸杂交,双抗生素筛选法,某些质粒载体如 pBR322质粒中装有Ampr和Tetr 抗性基因，在含四环素和氨苄青霉素的平皿上都能够生长的细菌只含有空载体，此筛选方法称为双抗生素对照筛选。,第三节 分子克隆的基本步骤,五、重组体的筛选和鉴定,77,基因工程核酸杂交,2,-半乳糖苷酶基因失活筛选（,蓝白斑筛选）,第三节 分子克隆的基本步骤,五、重组体的筛选和鉴定,78,基因工程核酸杂交,3营养标记选择,当细胞生物合成途径中某个酶的,编码基因失活后，该细胞成为营养缺陷型，如导入,细胞的重组DNA能弥补缺陷的基因，那么，培养基,中就不需补充有关的营养成分，由此可挑选出含重,组DNA的阳性细菌。,第三节 分子克隆的基本步骤,五、重组体的筛选和鉴定,79,基因工程核酸杂交,（二）重组子结构特征的筛选,1重组子大小鉴别筛选,从挑选的菌落中分别提取重组载体DNA和原载体DNA，用一种限制酶切消化后直接进行电泳，,重组载体DNA因分子量较大而迁移率较小,。,2酶切鉴定,根据已知外源基因两端的酶切位点，分别用相应的两种内切酶进行切割，经琼脂糖凝胶电泳后，可根据DNA mark来分析插入DNA片段的分子量。,第三节 分子克隆的基本步骤,五、重组体的筛选和鉴定,80,基因工程核酸杂交,3PCR筛选法,4核酸杂交技术筛选,将DNA的克隆片段或转化细菌平板转移至硝酸纤维素薄膜上，应用特异性的核酸探针对其进行原位杂交，可筛选出阳性克隆。另外，还可通过斑点杂交和Southern blot杂交技术筛选。,第三节 分子克隆的基本步骤,五、重组体的筛选和鉴定,81,基因工程核酸杂交,重组DNA技术操作的主要步骤,载体,质粒,噬菌体,病毒,目的基因（外源基因）,基因组DNA,cDNA,人工合成,PCR产物,限制酶消化,开环载体DNA,目的基因,连接酶,重组体,转化,体外包装，转染,带重组体的宿主,筛选,表型筛选,酶切电泳鉴定,菌落原位杂交,目 录,82,基因工程核酸杂交,第四节 基因工程的应用,1.生命科学基础理论研究中的应用,2.动植物基因工程,3.微生物基因工程和发酵工业,83,基因工程核酸杂交,在分子生物学领域,，利用基因工程技术，大肠杆菌,体内的基因50%以上已被定位，其DNA序列已被测,出，基因表达调控关系也基本搞清。,在真核生物中，,利用基因工程的理论和技术已发现,上百种癌基因和209余种抗癌基因，它们分别是细胞,增殖调控的正负信号。,在发育生物学中,精细胞的分化及受精过程所发生的,变化，基因表达的发育调控的研究与基因工程技术,的应用是密不可分的。,第四节 基因工程的应用,一、生命科学基础理论研究中的应用,84,基因工程核酸杂交,基因工程的理论和技术对,人类基因组计划,的,实现具有重大作用，将对人类基因组作图和,测序，对于了解人类的全部基因构成，提供,可资查的一个完美的基因信息库，也为认识,人类遗传疾病和癌发病机理,提供有价值的信息。,第四节 基因工程的应用,一、生命科学基础理论研究中的应用,85,基因工程核酸杂交,转基因动物与蛋白制药的生产,转基因动物与动物改良,转基因动物与人类疾病治疗,转基因动物与基础生物学研究,转基因植物,第四节 基因工程的应用,二、动植物基因工程,86,基因工程核酸杂交,转基因动物与蛋白制药的生产,转基因动物可以用来代替发酵罐生产一些珍贵,的蛋白质。它的原理是使外来基因在动物乳腺,中表达，从乳液中提取所要的蛋白质。,英国的药用蛋白公司用这种方法将转基因绵羊,来试行生产人类抗胰蛋白酶因子，在每升羊奶,中可取得35克这种蛋白质。,第四节 基因工程的应用,二、动植物基因工程,87,基因工程核酸杂交,转基因动物与动物改良,第四节 基因工程的应用,二、动植物基因工程,88,基因工程核酸杂交,裸鼠身上的人造耳朵,人造耳朵？人造大脑？让人怀疑，是不是人造器官的时代已经到来？,如果有一天，全身上下的“零件”都脱胎换骨的打制成“人造”器官，那岂不是将是一个“人将不人”的时代？,转基因动物与人类疾病治疗,第四节 基因工程的应用,二、动植物基因工程,89,基因工程核酸杂交,转基因动物与基础生物学研究,在佛罗里达州杰克逊维尔的MAYO诊所研究员,成功的繁殖出了大脑患有神经纤维缠结，具有,人类老年性痴呆症病理特征的小鼠。这只小鼠,模拟了人类神经纤维缠结的形成过程，为研究,者希望攻克预防、治疗老年性痴呆和其他痴呆,症提供了重要的基础。,第四节 基因工程的应用,二、动植物基因工程,90,基因工程核酸杂交,英国伦敦的一个研究小组把一个来自Y染色体的,Sry基因注入基因型为雌性的鼠的胚胎内，结果,令人吃惊。这些本来应该发育成雌鼠的胚胎最,后竟都长成了雄性鼠。这个结果表明，Sry基因,是决定雄性性别的基因。科学家猜测，这个基,因很可能在人类中也起着同样的作用。,转基因动物与基础生物学研究,第四节 基因工程的应用,二、动植物基因工程,91,基因工程核酸杂交,转基因植物,第四节 基因工程的应用,二、动植物基因工程,92,基因工程核酸杂交,我国已有人干扰素、人白介素 2、人集落刺激因子、重组人乙型肝炎疫苗、基因工程幼畜腹泻疫苗等多种基因工程药物和疫苗进入生产或临床试用,世界上还有几百种基因工程药物及其它基因工程产品在研制中，成为当今农业和医药业发展的重要方向，将对医学和工农业发展作出新贡献,第四节 基因工程的应用,三、微生物基因工程和发酵工业,93,基因工程核酸杂交,第四节 基因工程的应用,三、微生物基因工程和发酵工业,94,基因工程核酸杂交,核酸分子杂交技术,nucleic acid hybridization,分子生物学.第八章,95,基因工程核酸杂交,主要内容,第一节 核酸杂交概述及基本原理,第二节 核酸探针,第三节 核酸分子杂交技术,第四节 基因芯片,96,基因工程核酸杂交,核酸定性或定量检测,基因克隆、突变及其表达研究,疾病的临床诊断,主要用途,97,基因工程核酸杂交,第一节 核酸杂交概述及基本原理,一、核酸杂交概述,二、核酸变性,三、核酸复性,四、核酸分子杂交,98,基因工程核酸杂交,1961年Hall等建立核酸杂交技术，探针与靶序列溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体；,60年代中期Nygaard 等的研究为应用标记DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的DNA序列奠定了基础；,70年代末期到80年代早期，分子克隆技术的出现，各种质粒和噬菌体DAN载体系统的构建，使特异性DNA探针的来源变得十分丰富。,第一节 核酸杂交概述及基本原理,一、核酸杂交概述,99,基因工程核酸杂交,80年代中期，PCR技术的发明与核酸分子杂交有机的结合，又使得核酸分子杂交技术的灵敏度大大提高；,90年代，基因芯片技术的出现使得一次性对大量样品序列进行检测和分析成为可能，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。,第一节 核酸杂交概述及基本原理,一、核酸杂交概述,100,基因工程核酸杂交,第一节 核酸杂交概述及基本原理,一、核酸杂交概述,-核酸的结构,一级结构：核苷酸的排列循序,稳定键：磷酸二酯键,二级结构：双螺旋结构,稳定键：氢键、碱基堆积力、疏水键,高级结构：染色体,101,基因工程核酸杂交,C,G,A,一级结构 二级结构 高级结构,102,基因工程核酸杂交,第一节 核酸杂交概述及基本原理,二、核酸变性,核酸变性（nucleic acid denaturation）:,在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA由双螺旋变成单链过程。,化学键变化：,维持双螺旋稳定的氢键和疏水键发生断裂，断裂可以是部分的或全部的，可以是可逆的或是非可逆的。,化学结构变化,：DNA变性改变了其空间结构，不涉及到其一级结构的改变。,103,基因工程核酸杂交,104,基因工程核酸杂交,加热,极端的pH,有机试剂（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等）,DNA的变性因素：,凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件,第一节 核酸杂交概述及基本原理,二、核酸变性,-DNA的变性因素,105,基因工程核酸杂交,变性能导致DNA 的一些,理化性质,及,生物学性质,发生改变,第一节 核酸杂交概述及基本原理,二、核酸变性,-,变性,DNA,的性质,溶液黏度降低,DNA双螺旋是紧密的“刚性”结构，变性后代之以“柔软”无规则单股线性结构，DNA黏度明显下降,溶液旋光性发生改变,变性后DNA分子的对称性及局部构型改变,紫外吸收增加,DNA变性后，DNA 溶液的紫外吸收增强,双链DNA单链DNA单核苷酸,106,基因工程核酸杂交,DNA,的紫外吸收光谱,增色效应（hyperchromic effect）：,DNA变性时其溶液,OD,260,增高的现象。,第一节 核酸杂交概述及基本原理,二、核酸变性,-,变性,DNA的,增色效应,107,基因工程核酸杂交,DNA分子在250280nm 波长具有吸收紫外光的特性，其吸收峰值在260n