第七章微生物的遗传变异和育种.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,表型饰变：,表型的差异只与环境有关,特点：,暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为,橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳。,遗传型变异（基因变异、基因突变）：,遗传物质改变，导致表型改变,特点：,遗传性、群体中极少数个体的行为,（自发突变频率通常为10,-6,-10,-9,）,微生物是遗传学研究中的明星：,微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。,很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖,。,对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。,1、经典转化实验,2、更有说服力的噬菌体感染实验,3、植物病毒的拆分和重建试验,第一节 微生物遗传变异的物质基础,第六章微生物的遗传变异和育种,一、三个经典实验,1928,年，英国,Griffith,S,型肺炎球菌：有荚膜，菌落表面光滑,有毒性,R,型肺炎球菌：没有荚膜，菌落表面粗糙，无毒性,著名的肺炎球菌转化实验,结果说明？,结果说明：加热杀死的,S,型肺炎球菌中一定有某种特殊的生物分子或遗传物质，可以使无害的,R,型肺炎球菌转化为有害的,S,型肺炎球菌。,这种生物分子或遗传物质是什么呢？,著名的肺炎球菌实验,纽约洛克非勒研究所,Avery,从加热杀死的,S,型肺炎球菌将蛋白质、核酸、多糖、脂类分离出来，分别加入到无害的,R,型肺炎球菌中，,结果发现，惟独只有核酸可以使无害的,R,型肺炎球菌转化为有害的,S,型肺炎球菌。,1944年,结论：,DNA,是生命的遗传物质,1952,年，,Hershey,和,Chase,病毒（噬菌体）,放射性同位素,35,S,标记病毒的蛋白质,外壳，,32,P,标记病毒的,DNA,内核，感染细菌。,新复制的病毒，检测到了,32,P,标记的,DNA,，,没有检测到,35,S,标记的蛋白质，,DNA,在病毒和生物体复制或繁殖中的关键作用。,8,年的时间,2、更有说服力的噬菌体感染实验,3、植物病毒的拆分和重建试验,烟草花叶病毒,感染试验,二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式,（一）、七个水平,（1）细胞水平,（2）细胞核水平,（3）染色体水平,（4）核酸水平,（5）基因水平,（6）密码子水平,（7）核苷酸水平,1.定义和特点：,定义：,游离并独立存在于染色体以外的能进行自主复制的细胞质,遗传因子，通常以小型共价闭合环状的超螺旋双链DNA分,子，即,cccDNA,存在于各种微生物细胞中。,大小：,11000kb,构型：,超螺旋、线状、环状,特点：,（,1）,质粒携带某些核基因组中所缺少的对宿主生存不必需基因，,在特殊条件下使宿主得到生长优势。,（2）严紧型复制控制：质粒的复制行为与核染色体的复制同步。,松弛型复制控制：质粒的复制与核染色体的复制不同步。,（3）,质粒消除。,（二）、原核生物的质粒,质粒的检测,提取所有胞内,DNA,后电镜观察；,超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；,对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点，,如抗药性初步判断。,特定的质粒提取方法和,后处理使染色体和RNA,均被除掉。,对于由于三种构型同时存在时造成的多带现象（提取质粒时造成,或自然存在），可以进行特异性单酶切，使其成为一条带。,第六章微生物的遗传变异和育种,（2）质粒的种类,根据质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应，分为以下几类：,F质粒;抗性因子;Col质粒;Ti质粒;代谢质粒;Ri质粒;固氮质粒;隐秘质粒。,其中研究较多的细菌质粒有：F质粒决定大肠杆菌的致育性；抗性因子决定细菌的耐药性；Col质粒决定产生大肠杆菌素。,第一节 微生物遗传变异的物质基础,二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式,2、原核生物的质粒,第六章微生物的遗传变异和育种,F质粒,（接合质粒、F因子、致育因子或性因子）,大小：,仅100kb，为cccDNA。,功能：,决定细菌的性别和转移能力。,F质粒在大肠杆菌的有性接合作用中起主要作用。,第一节 微生物遗传变异的物质基础,二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式,2、原核生物的质粒,（2）质粒的种类,F因子：,Hfr菌株上的F因子变成自由状态时携带某一,染色体基因的F因子。,分类：,F,+,菌株：,携带F质粒的菌株。(相当于雄性),F,菌株：,无F质粒的菌株。(相当于雌性),高频重组菌株：,F质粒整合到宿主细胞染色体上的菌株,(Hfr)。（相当于附加体）。,第六章微生物的遗传变异和育种,第一节 微生物遗传变异的物质基础,二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式,2、原核生物的质粒,（2）质粒的种类,F因子能以游离状态(F+)和,以与染色体相结合的状态,(Hfr)存在于细胞中，所以,又称之为附加体(episome)。,第六章微生物的遗传变异和育种,抗性因子(R因子）,第一节 微生物遗传变异的物质基础,二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式,2、原核生物的质粒,（2）质粒的种类,分类：,抗药性,抗重金属,例如R1质粒(94kb)可使宿主对下列五种药物具有抗性：氯霉素、链霉素、磺胺、氨苄青霉素和卡那霉素，并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于R1抗性质粒上。,许多R质粒能使宿主细胞对许多金属离子呈现抗性，包括砷、汞、镍、钴、银、镉等。在肠道细菌中发现的R质粒，约有25为抗汞离子，而铜绿假单胞菌中约占75,。,R100质粒(89kb)可使宿主对,下列药物及重金属具有抗性：,汞、,四环素、,链霉素、,磺胺、,氯霉素、,夫西地酸,并且负责,这些抗性的基因是成簇地存,在于抗性质粒上。,抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。,第六章微生物的遗传变异和育种,Col质粒（细菌素质粒）,含有,编码大肠杆菌素的基因,，故而得名。,大肠杆菌素是一种细菌蛋白，只抑制或杀死其他近缘肠道,细菌或同种不含Col质粒的不同品系的菌株。,应用：例如乳酸乳球菌(旧称乳酸链球菌)产生的乳酸链球,菌素(Nisin)能强烈抑制某些G,+,细菌的生长，而被,用于食品的防腐保鲜。,第一节 微生物遗传变异的物质基础,二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式,2、原核生物的质粒,（2）质粒的种类,细菌素结构基因、涉及细菌素运输及发挥作用（processing）的蛋,白质的基因、赋予宿主对该细菌素具有“免疫力”的相关产物的基因,一般都位于质粒或转座子上，因此，细菌素可以杀死,同种但不携带该质粒的菌株。,Col质粒（细菌素质粒）,第六章微生物的遗传变异和育种,Ti质粒（诱瘤质粒）,存在于根癌土壤杆菌中引起,双子叶植物冠瘿瘤的致病因子,。,200kb的环状质粒，包括毒性区、接合转移区、复制起始区和,T-DNA区4部分。其中的毒性区和T-DNA区与冠瘿瘤生成有关。,致病机制,：Ti质粒上的T-DNA可携带外源基因整合到植物细,胞的核染色体上，合成正常植株所没有的冠瘿碱类化合物，破,坏控制细胞分裂的激素调节系统，导致细胞无控制的瘤状增生,广泛应用于转基因植物载体的是一种经过人工改造后的Ti质粒,。已有200多种转基因植物中，约有80由Ti质粒介导。,第一节 微生物遗传变异的物质基础,二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式,2、原核生物的质粒,（2）质粒的种类,根癌土壤杆菌所含Ti质粒是引起双子叶植物冠瘿瘤的,致病因子,许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒,具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物）造成伤害。,第六章微生物的遗传变异和育种,代谢质粒(降解性质粒),这类质粒含有编码降解一系列复杂有机物的酶的基因。,如假单胞菌能将复杂有机化合物，尤其是有毒化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式，故在,污水处理、环境保护等方面发挥特殊,作用。,每一种具体的质粒常以其降解的底物而命名。如CAM(樟脑)质粒，OCT(辛烷)质粒，XYL(二甲苯)质粒，SAL(水杨酸)质粒，MDL(扁桃酸)质粒，NAP(萘)质粒和TOL(甲苯)质粒等。,曾有人通过遗传工程手段构建具有数种代谢质粒的菌株，此种具有广谱降解能力的工程菌被称为“超级菌”。,此外，代谢质粒中还包括一些能编码固氮功能的基因。例如根瘤菌中与结瘤和固氮有关的基因均位于代谢质粒中.,第一节 微生物遗传变异的物质基础,二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式,2、原核生物的质粒,（2）质粒的种类,第六章微生物的遗传变异和育种,Ri质粒,发根土壤杆菌可侵染双子叶植物的根部诱生大量毛根瘤。,Ri质粒一段T-DNA整合到寄主根部细胞的核基因组中，根部,并不形成瘤，仅生出可再生新植株的毛状根。若将毛状根,离体培养，还能合成次生代谢物。,Ri质粒在功能上与Ti质粒有广泛的同源性，发生转化的T-,DNA在宿主细胞中稳定遗传。,在实践上，Ri质粒已成为外源基因的良好载体，也可用于,次生代谢产物的生产,。,第一节 微生物遗传变异的物质基础,二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式,2、原核生物的质粒,（2）质粒的种类,第六章微生物的遗传变异和育种,固氮质粒,该质粒存在于根瘤菌属(,Rhizobium,)中含有编码一系列与共生固氮相关的基因。因其相对分子质量比一般质粒大几十倍至几百倍，故又名巨大质粒。它与根瘤菌属细菌的固氮作用有关。,隐秘质粒,不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。目前对其生物学意义尚不甚了解。,第一节 微生物遗传变异的物质基础,二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式,2、原核生物的质粒,（2）质粒的种类,第六章微生物的遗传变异和育种,一、基因突变,二、自发突变与定向培育,三、诱变育种,第二节 基因突变和微生物育种,第六章微生物的遗传变异和育种,基因突变,泛指细胞内(或病毒粒子内)遗传物质的分子结构或数量,突然发生了可遗传的变化。,基因突变可自发或诱导产生。,第二节 基因突变和微生物育种,一、基因突变,广义的突变,包括基因突变和染色体畸变。染色体畸变又包括,染色体的缺失、重复、插入、倒位和易位。,狭义的突变,指基因突变(点突变)，包括一对或几对碱基的缺,失、插入或置换；,表型变化的突变类型的分类：,1，营养缺陷型,野生型菌株的遗传型应是A+B+,A营养缺陷型的遗传型用A-B+表示，,而B营养缺陷型的遗传型用A+B-表示。,(一）、基因突变的类型,抗性突变型 条件致死突变型 形态突变型,抗原突变型 产量突变型,特点：,在选择培养基（一般为基本培养基）上不生长,负选择标记,突变株不能通过选择平板直接获得,营养缺陷型,营养缺陷型,影印平板（Replica plating）法是Lederberg夫妇在1952年建立,条件致死突变型,在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死,效应的突变型。,负选择标记,特点：,这类突变型常被用来分离生长繁殖必需的突变基因,常用的条件致死突变是温度敏感突变，用ts表示，这类突变在高温下,（如42）是致死的，但可以在低温（如25-30）下得到这种突变。,形态突变型,造成形态改变的突变型,特点：,非选择性突变,突变株和野生型菌株均可生长，但可从形态特征上进行区分。,举例：,产蛋白酶缺陷突变株的筛选,菌落颜色变化,形成芽孢缺陷菌株,细胞水平上的形态突变，,突变株,的检出更加困难。,半乳糖苷酶基因的插入失活，使重组子菌落为白色而,与兰色的非重组子分开。,第六章微生物的遗传变异和育种,（1）碱基变化与遗传信息的改变,不同碱基变化引起遗传信息的改变不同，主要有以下四种类型。,原序列 5 AUG CCU UCA AGA UGU GGG3,Met Pro Ser Arg Cys Gly,同义突变,5 AUG CCU UCA AGA UGU GG,A,3,Met Pro Ser Arg Cys Gly,错义突变,5 AUG CCU UCA,G,GA UGU GGG3,Met Pro Ser,Gly,Cys Gly,无义突变,5 AUG CCU UCA AGA UG,A,GGG3,Met Pro Ser Arg,stop,缺失一个碱基A,移码突变,5 AUG CCU UCA,AGU GUG,GG3,Met Pro Ser,Ser Val,第二节 基因突变和微生物育种,一、基因突变,1、基因突变的类型,第六章微生物的遗传变异和育种,定义：,某一细胞(或病毒粒子)在每一世代中某一性状发生突变,的几率，称突变率。,双重或多重基因突变的几率是各个基因突变几率的乘积。,检出选择性突变株的手段，尤其采用检出营养缺陷型的回复突,变株或抗药性突变株的方法达到目的。,据测定，一般基因的自发突变率为,10,-6,，转座突变率为10,-4,，,无义突变或错义突变的突变率约10,-8,。,第二节 基因突变和微生物育种,一、基因突变,（二）、突变率,第六章微生物的遗传变异和育种,自发性。,不对应性,稀有性,独立性,诱变性,稳定性,可逆性,第二节 基因突变和微生物育种,一、基因突变,（三）、基因突变的特点,第六章微生物的遗传变异和育种,第二节 基因突变和微生物育种,一、基因突变,（四）、基因突变自发性和不对应性的实验证明,如何证明基因突变的非对应性？,三个经典实验,变量实验、涂布实验、影印实验,证明突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系！,变量实验（fluctuation analysis）,Salvador Luria and Max Delbruck（1943）,Salvador Luria,Max Delbruck,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969,Newcombe的涂布实验（1949）,影印实验（replica plating）,Joshua Lederberg and Esther Lederberg（1952）,Joshua Lederberg,J.Lederberg is awarded the Noble Prize in,Medicine and Physiology in 1958,突变真的与选择压力无关吗？,适应性突变（,adaptive mutability,）和高频突变（,hypermutation,）,Benson S.,Adaptive mutation:a general phenomenon or special case?,Bioessays.1997 Jan;19(1):9-11.Review.,Galitski T,Roth JR.,A search for a general phenomenon of adaptive mutability.,Genetics.1996 Jun;143(2):645-59.,Dan I.Andersson,E.Susan Slechta,and John R.Roth,Evidence That Gene Amplification Underlies Adaptive Mutability of the Bacterial,lac Operon。,Science 1998 November 6;282:1133-1135.,Godoy VG,Fox MS.,Transposon stability and a role for conjugational transfer in adaptive mutability.,Proc Natl Acad Sci U S A.2000 Jun 20;97(13):7393-8.,Bull HJ,McKenzie GJ,Hastings PJ,Rosenberg SM.,Evidence that stationary-phase hypermutation in the Escherichia coli chromosome is,promoted by recombination.,Genetics.2000 Apr;154(4):1427-37.,第六章微生物的遗传变异和育种,第二节 基因突变和微生物育种,一、基因突变,（五）、基因突变的机制,（1）诱发突变的机制,诱发突变,：人为的理化因子的刺激使微生物的性状发生了可,遗传的变化。,诱变剂：,能使突变率显著高于自发突变频率的物理、化学和,生物因子。,仅影响一对碱基,影响一段染色体,诱变剂,与,DNA,碱基的原发反应,遗传效应,碱基类似物,掺入作用,ATGC转换,羟胺,与胞嘧啶起反应,GC,AT,转换,亚硝酸,A、,G,、,C,氧化脱氨作用,交联,ATGC转换,缺失,烷化剂,烷化碱基(主要是,G,),烷化磷酸基团,脱去烷化的嘌呤,糖-磷酸骨架断裂,ATGC,转换,AT,TA,颠换,GC,CG,颠换,染色体畸变,吖啶类,碱基对间的插入作用,移码突变,紫外线,形成嘧啶水合物,形成胸腺嘧啶二聚体,GC,AT,转换,移码突变,X射线、,射线等,碱基的羟基化与降解,DNA,降解,糖,-,磷酸骨架断裂,ATGC转换,移码突变,染色体畸变,E,.,coli,Mu温和噬菌体,结合到一个基因中间,移码突变,第六章微生物的遗传变异和育种,第二节 基因突变和微生物育种,一、基因突变,5、基因突变的机制,（1）诱发突变的机制,碱基的置换,（点突变）,置换：,转换,（相同碱基之间）；,颠换,（不同碱基）,化学诱变剂发生置换的机制：,A 直接引起置换,诱变剂直接与核酸的碱基发生化学反应。,此类诱变剂有：亚硝酸、羟胺和烷化剂。,B 间接引起置换,碱基类似物，通过代谢掺入到DNA分子中。,此类诱变剂有：5-溴尿嘧啶(5-BU)、5-氨基尿嘧啶(5-AU)、,5、基因突变的机制,（1）诱发突变的机制,移码突变,定义：,诱变剂引起DNA分子中的一个或少数几个核苷酸碱基,的增加(插入)或缺失，造成突变点以后的全部遗传密,码的转录和转译发生错误，从而引起微生物遗传性状,的改变。,此类,诱变剂,:吖啶类染料(原黄素、吖啶黄、吖啶橙、,-氨基吖啶等)和一系列称为ICR类化合物。,染色体畸变,定义：,某些理化因子使DNA链上发生较大的损伤。,此类,诱变剂,：X射线、亚硝酸和烷化剂等。,一条染色体内的畸变有缺失、重复、插入、倒位和易位。,5、基因突变的机制,（2）自发突变的机制,自发突变,：没有人工参与下的微生物所发生的突变。,自发突变的机制有下面三种原因：,射线和环境因素的诱变效应,微生物自身有害代谢产物的诱变效应,互变异构效应,（六）紫外线对DNA的损伤与修复,自学！,三、诱变育种,诱变育种：,是指利用物理、化学等各种诱变剂处理均匀而分,散的微生物细胞，显著提高基因的随机突变频,率，而后采用简便、快速、高效的筛选方法，,从中挑选出少数符合育种目的的优良突变株，,以供科学实验或生产实践使用。,在诱变育种过程中，诱变和筛选是两个主要环节，由于诱变,是随机的，而筛选则是定向的，相比之下，筛选更为重要。,二、突变与育种,1、从生产实践中育种,10,-6,左右的突变率的自发突变，正突变，也有负突变，,例如上海酒精二厂的糖化菌种宇佐美曲霉3758号的变种,“上酒白种”。,2、定向培育优良菌株,定向培育：利用微生物的自发突变，采用特定的选择条件,，通过对微生物群体不断移植以选育出较优良,菌株的古老方法。,19世纪巴斯德培育低毒力的炭疽芽孢杆菌,卡介苗,二、突变与育种,（一）自发突变与育种,（,breeding by spontaneous mutation,）,1.,从生产中育种,在生产第一线易获得较优良的生产菌株。,2.,定向培育优良菌株,定向培育是一种利用微生物自发突变，并采用特定的选择条件，通过对微生物群体不断移植以选育出较优良菌株的古老方法。,筛选,诱变,诱变育种,定向的更重要,随机的,（二）诱变育种（breeding by induced mutation）,可获得供工业和实验室应用的各种菌株；,提高有用代谢产物的产量；,减少杂质、提高产品质量、扩大品种和简化工艺等。,诱变育种具有重大的实践意义,1.,诱变育种的基本环节,第六章微生物的遗传变异和育种,第二节 基因突变和微生物育种,三、诱变育种,1、诱变育种的基本程序,原始菌株(出发菌株),纯化出发菌株性能测定,细胞或孢子悬浮液制备,活细胞计数,诱变预备实验诱变剂处理,活细胞计数,中间培养,涂布平板突变株分离,形态变异观察并计算其突变率,挑变异菌落于斜面上培养,初筛(性能粗测),复筛(性能精测),生产性能试验,2.,诱变育种几个原则,（1）选择简便有效的诱变剂,（2）挑选优良的出发菌株,（3）处理单细胞或单孢子悬液,（4）选用最适的诱变剂量,（5）充分利用复合处理的协同效应,（6）利用和创造形态、生理与产量间的相关指标,（7）设计高效筛选方案,（8）创造新型筛选方法,第六章微生物的遗传变异和育种,第二节 基因突变和微生物育种,三、诱变育种,2、诱变育种中的几个原则,(3)选择简便有效的诱变剂,(1)挑选优良的出发菌株,(2)单孢子(或单细胞)悬浮液的制备,(4)确定最适的诱变剂量,(5)充分利用复合处理的协同效应,(6)利用和创造形态变异、生理变异与产量间的相关指标,(7)设计高效筛选方案,(8)创造新型筛选方法,化学诱变剂,非电离辐射类,引起电离辐射,烷化剂,碱基类似物,吖啶类化合物,物理因素,（1）选择简便有效的诱变剂,X射线,射线,快中子,等,紫外线,激光,离子束,等,烷化剂,可与巯基、氨基和羧基等直接发生反应，更易引起基因突变。,最常用的烷化剂,N,-甲基,N,-硝基-,N,-亚硝基胍（NTG）、,甲基磺酸乙酯（EMS）、,甲基亚硝基脲（NMU）、,硫酸二乙酯（DES）、,氮芥、乙烯亚胺和环氧乙烷等。,拟辐射物质,氮芥、硫芥和环氧乙烷等,各种点突变,一般只有辐射才能诱发,染色体畸变,诱发,第六章微生物的遗传变异和育种,第二节 基因突变和微生物育种,三、诱变育种,（1）挑选优良的出发菌株,选用经过生产实践中选育出来的自发突变菌株进行诱变处理效果较好；,选用本身能少量积累所需产品或其前体的菌株；,选用已发生过其他突变，如代谢产物变化的菌株。例如在选育金霉素高产菌株时，发现用丧失黄色素合成能力的菌株作出发菌株比分泌黄色素者更有利于产量变异；,选用对诱变剂敏感性较高的增变变异株，对诱变剂的敏感性显著高于原始菌株；,选用经几次诱变处理能提高产量或效价的菌株等等。,2、诱变育种中的几个原则,第六章微生物的遗传变异和育种,第二节 基因突变和微生物育种,三、诱变育种,(2)单孢子(或单细胞)悬浮液的制备,用生理状态一致的单细胞或单孢子悬浮液，使细胞均匀接触诱变剂，减少分离性表型延迟现象的发生，并防止长出不纯菌落。,表型延迟:,诱变剂通常仅作用于某一单链的某一序列。因此，突变后的性状无法反映当代的表型，而要通过DNA的复制和细胞分裂后才表现出来，于是出现了不纯菌落。这种遗传型虽已突变，但表型却要经DNA复制、分离和细胞分裂后才表现出来的现象。,悬浮液可以用生理盐水(物理诱变)或缓冲液(化学诱变)制备，以减少pH值的变化造成的影响。为了确定悬浮液的浓度，一般真菌孢子或酵母菌细胞的浓度大约为10,6,个/ml左右为宜。放线菌孢子或细菌不超过10,8,个/ml。,2、诱变育种中的几个原则,第六章微生物的遗传变异和育种,第二节 基因突变和微生物育种,三、诱变育种,2、诱变育种中的几个原则,(3)选择简便有效的诱变剂,(1)物理诱变剂,包括非电离辐射的紫外线、激光和离子束等，能够引起,电离辐射的X射线、射线和快中子等。,紫外线(UV),操作最简便，波长在,250270nm,处诱变效果,最好，在260nm左右的紫外线被核酸强烈吸收，引起DNA,结构变化。其作用机制：,DNA链或氢键的断裂DNA分子内或分子间的交联。,核酸与蛋白质的交联；胞嘧啶的水合物作用；形成,胸腺嘧啶二聚体：,光复活作用 暗修复作用,第六章微生物的遗传变异和育种,第二节 基因突变和微生物育种,三、诱变育种,2、诱变育种中的几个原则,化学诱变剂,常用的有甲基磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙酯(DES)、氮芥、亚硝基胍、甲基亚硝基脲(NMU)等。后两种因有显著的诱变效应，故称之为“超诱变剂”。,艾姆氏试验,由于生物的遗传物质都是核酸，故凡能使核酸结构发生改,变的因素都可影响生物学功能。,艾姆氏试验(Ames test)是一种利用细菌营养缺陷型的回复,突变来,检测环境或食品中是否存在化学致癌剂,的简便有效,方法。,(3)选择简便有效的诱变剂,Ames试验,第六章微生物的遗传变异和育种,第二节 基因突变和微生物育种,三、诱变育种,2、诱变育种中的几个原则,艾姆氏试验测定潜在化学致癌物的方法如下：,将不同浓度的试验药品与在肝脏中与酶接触，经代谢变化,后才有诱变作用。,将上述混合物适当保温，以圆滤纸片吸取不同浓度的试样,制成试验滤纸片。,以基本培养基倒成平板，,将,鼠伤寒沙门氏菌,的组氨酸缺陷,型突变株涂布于平板上，再将不同浓度的滤纸放入平板中,央，同时做一空白对照。,在基本培养基上滤纸片周围长出的菌落即为养缺陷型的回,复突变株，而营养缺陷型突变株在空白对照平板上滤纸片,周围未长菌落。分析计算试验药品是否具有诱变作用，以,及最有效的诱变浓度。,(3)选择简便有效的诱变剂,艾姆氏试验,证明Ames试验重要性的应用实例：,国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，由于其,药效显著，在60-70年代十分流行，,但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的,妇女大多曾服用“反应停”，后来采用Ames试验发现这种物质的确,具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用,但如果能在这种药物上市之前就进行Ames试验检测，那么这种大,量出生畸形儿的悲剧完全可以避免。,第六章微生物的遗传变异和育种,第二节 基因突变和微生物育种,三、诱变育种,2、诱变育种中的几个原则,在育种工作中，常以杀菌率表示诱变剂的相对剂量。,杀菌率的计算：取等量被处理菌体与未被处理菌体分别在,完全培养基上培养，计数各自长出的菌落按下式计算：,(4)确定最适的诱变剂量,杀菌率=,未被处理的菌落数-被处理的菌落数,未被处理的菌落数,100%,第六章微生物的遗传变异和育种,第二节 基因突变和微生物育种,三、诱变育种,2、诱变育种中的几个原则,（5）充分利用复合处理的协同效应,（6）利用和创造形态变异、生理变异与产量间的相关指标,（7）设计高效筛选方案,（8）创造新型筛选方法,第六章微生物的遗传变异和育种,第二节 基因突变和微生物育种,三、诱变育种,3、突变株的筛选方法,（1）抗药性突变株的筛选,抗药性基因为遗传研究和育种工作重要的选择性遗传标记，同时，有些抗药菌株还是重要的生产菌种。,梯度平板法是定向筛选抗药性突变株的一种有效方法，通过制备琼脂表面存在药物浓度梯度的平板，在其上涂布诱变处理后的细胞悬液，经培养后再从其上选取抗药性菌落等步骤，就可定向筛选到相应抗药性突变株。,在筛选抗代谢药物的抗性菌株以取得相应代谢物的高产菌株方面，此法能达到定向培育的效果。例如，异烟肼(商品名为雷米封)是吡哆醇的结构类似物或代谢拮抗物，,第六章微生物的遗传变异和育种,第二节 基因突变和微生物育种,三、诱变育种,图6-4 用梯度平板法定向筛选抗性突变株,3、突变株的筛选方法,第六章微生物的遗传变异和育种,第二节 基因突变和微生物育种,三、诱变育种,（2）营养缺陷型突变株的筛选,用途：遗传重组的基因标记菌种；氨基酸、维生素或碱基,等物质的生物测定试验菌种；生物体内合成氨基酸,和核苷酸等物质的代谢途径,筛选营养缺陷型突变株的三类培养基,基本培养基(MM)：仅能满足某微生物的野生型菌株生长所,要的最低营养成分的组合培养基。,完全培养基(CM)：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要,的天然或半组合培养基。,补充培养基(SM)：凡只能满足相应的营养缺陷型突变株生,长需要的组合或半组合培养基。,3、突变株的筛选方法,第六章微生物的遗传变异和育种,第二节 基因突变和微生物育种,三、诱变育种,3、突变株的筛选方法,筛选营养缺陷型突变株的筛选方法,一般要经过4个环节：,诱变、淘汰野生型(浓缩)、检出(分离)和鉴定营养缺陷型,检出营养缺陷型：常用的有以下四种方法。,（2）营养缺陷型突变株的筛选,夹层培养法,限量补充培养法,逐个检出法,影印平板法,第六章微生物的遗传变异和育种,一、原核生物的基因重组,二、原核生物的基因重组,第三节 基因重组和杂交育种,第六章微生物的遗传变异和育种,两个不同性状个体内独立基因组的遗传基因，通过一定途径,转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新的稳定基,因组的过程，称为基因重组或遗传重组，简称重组。,与一般在细胞水平上进行的杂交区别。,真核微生物基因重组可通过有性杂交、准性杂交来实现；,原核微生物基因重组必须在特殊条件下进行，即通过转化、,转导、接合、原生质体融合和溶源转变实现基因重组。,第三节 基因重组和杂交育种,一、原核生物的基因重组,第六章微生物的遗传变异和育种,微生物的遗传基因可以通过以下,5种途径重组,：,两个不同性细胞或体细胞结合，促使整套染色体交换的基,因重组，如真菌的有性杂交或准性杂交。,细胞间不接触，仅涉及到个别或少数基因的重组。例如受,体细胞接受供体细胞内抽提的DNA而进行的基因重组(转化),，以及供体细胞的基因通过噬菌体的携带转移到受体细,胞中进行的基因重组(转导)。,细胞间暂时沟通，使供体菌的核基因组片段传递给受体菌,由噬菌体提供遗传物质，使寄主细胞获得完整噬菌体的,核酸的基因重组(溶源转变)；,双亲细胞的原生质体融合，促使部分染色体基因重组，,如细菌、酵母菌、霉菌的原生质体融合。,第三节 基因重组和杂交育种,一、原核生物的基因重组,第六章微生物的遗传变异和育种,原核微生物的基因重组方式主要有转化、转导、接合和原生质,体融合。,共同特点为：,片段性，仅一小段DNA序列参与重组；,单向性，即从供体菌向受体菌(或从供体基因组向受体基,因组)作单方向转移；,转移机制独特而多样，如接合、转化和转导等。,第三节 基因重组和杂交育种,一、原核生物的基因重组,(1)定义：,处于自然或人工感受态的受体菌细胞直接吸收供体,菌的同源或异源的游离DNA片段，而获得后者部分,遗传性状的现象,。,转化子：,通过转化方式而形成的杂种后代。,(2)转化微生物的种类,原核微生物,：肺炎链球菌、嗜血杆菌属、芽孢杆菌属、奈瑟氏,球菌属、根瘤菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属和,黄单胞菌属等；,真核微生物,：酿酒酵母、粗糙脉孢霉和黑曲霉等。在实验室中,常用的一些属于肠道菌科的细菌，如,E.coli,等。,（一）、转化,第六章微生物的遗传变异和育种,(3)感受态,感受态：,受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种,生理状态。,出现时间及感受态细胞所占比例和维持时间也不同。,调节感受态的一类特异蛋白,称感受态因子。它是一种胞外蛋白,，主要包括3种成分，即膜相关DNA结合蛋白、细胞壁自溶素和,几种核酸酶。,(4)转化因子,转化因子的本质是离体的DNA片段。只有15kb左右的片段。,第三节 基因重组和杂交育种,一、原核生物的基因重组,第六章微生物的遗传变异和育种,（5）转化过程,肺炎链球菌,第三节 基因重组和杂交育种,一、原核生物的基因重组,第六章微生物的遗传变异和育种,（6）转染,定义：,用提纯的病毒核酸(DNA或RNA)去感染其宿主细胞或其原生质体，可增殖出一群正常病毒后代的现象。,作为转染的病毒核酸，不是作为供体基因的功能，被感染的宿主也决不是能形成转化子的受体菌，这是转化与转染的本质区别。,第三节 基因重组和杂交育种,一、原核生物的基因重组,定义：,通过缺陷噬菌体的媒介，将供体细胞的小片段DNA携,带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前,者部分遗传性状的现象,。,转导子：,由转导作用而获得部分新性状的重组细胞。,种类：,普遍转导,和,局限转导,转导现象在自然界较为普遍，它很可能是一种产生新基因组合的重要方式。,（二）、转导,第六章微生物的遗传变异和育种,（1）普遍转导,定义：,通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小,片段DNA进行“误包”，而将其遗传性状传递给受体菌,现象。,一般用温和噬菌体作为普遍转导的媒介。,种类：,完全普遍转导,流产普遍转导,第三节 基因重组和杂交育种,一、原核生物的基因重组,2、转 导,普遍性转导,噬菌体可以转导,给体染色体的任何部分,到受体细胞中的转导过程,意外的发现,1951年，Joshua Lederberg和Norton Zinder为了证实大肠杆菌以外,的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型,的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验：,用“U”型管进行同样的实验时，在给体和受体细胞,不接触的情况下，同样出现原养型细菌！,沙门氏菌LT22A是携带P22噬菌体的溶源性细菌,另一株是非溶源性细菌,一个表面看起来的常规研究却导致,一个惊奇和十分重要发现的重要例证！,基因的传递很可能是由可透过“U”型管滤板的,P22噬菌体介导的,（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）,转导模型,普遍性转导的三种后果：,进入受体的外源DNA通过与细胞染色体,的重组交换而形成稳定的转导子,流产转导（abortive transduction）,转导DNA不能进行重组和复制，但其,携带的基因可经过转录而得到表达。,特点：在选择培养基平板上形成微小菌落,外源DNA被降解，转导失败。,DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，,而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。,完全普遍转导,2、转 导,转导颗粒（转导噬菌体）,“错装”率 10,-6,10,-8,2、转 导,流产普遍转导,局限性转导,温和噬菌体感染,整合到细菌染色体的特定位点上,宿主细胞发生溶源化,溶源菌因诱导而发生裂解时，,在前噬菌体二侧的少数宿主,基因因偶尔发生的,不正常切,割,而连在噬菌体DNA上,部分缺陷的温和噬菌体,把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中,（2）局限转导,定义：,指通过部分缺陷的温和噬菌体将供体菌的少数特定基,因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，,形成转导子的现象。,种类：,低频转导(LFT)高频转导(HFT),特点：,只局限于传递供体菌核染色体上的个别特定基因；,该特定基因由部分缺陷,温和噬菌体携带；,缺陷噬菌体在脱离宿主核染色体过程中，发生低频,率的误切或由于双重溶源菌的裂解而形成；,局限转导噬菌体的产生要通过,UV,等因素对溶源菌,的诱导并引起裂解后才产生。,2、转 导,局限性转导与普遍性转导的主要区别：,a）被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接，与噬菌体DNA一起,进行复制、包装以及被导入受体细胞中。,而普遍性转导包,装的可能全部是宿主菌的基因。,b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因,导入受体，故称为局限性转导。,而普遍性转导携带的宿主基,因具有随机性。,第六章微生物的遗传变异和育种,低频转导(LFT),指通过一般溶源菌释放的噬菌体所进行的转导，因其只能形成极少数(10,-4,10,-6,)转导子，故称低频转导。,第三节 基因重组和杂交育种,一、原核生物的基因重组,2、转 导,（2）局限转导,高频转导(HFT),在局限转导中，若对双重溶源菌进行诱导，就会产生含50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物(HFT lysate)，用这种裂解物去转导受体菌，即可获得高达50左右的转导子。,2、转 导,（2）局限转导,3.溶源转变,当正常的温和噬菌体感染其宿主而使之发生溶源化时，因噬菌体基因整合到宿主的核基因组上，而使宿主获得了除免疫性之外的新遗传性状的现象，称溶源转变。,溶源转变,一个与转导相似又不同的现象,温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因,整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象。,溶源转变与转导的不同？,a）不携带任何供体菌的基因；,b）这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的；,（1）定义：,供体菌(雄性)通过性菌毛与受体菌(雌性)直接接触,，将F质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后,者，使后者获得若干新遗传性状的现象。,接合子：,通过接合而获得新遗传性状的受体细胞。,（2）接