饲料中霉菌毒素检测技术.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2015/12/21,#,饲料中霉菌毒素检测技术,交流提纲,一、,饲料中霉菌毒素的危害,二、饲料中霉菌毒素的主要检测方法,三、,ELISA,法的操作要点及注意事项,质量第一 公正科学 及时准确,四、,HPLC,法在饲料霉菌检测中的应用,一、饲料中霉菌毒素的危害,1,、什么是霉菌毒素？,真菌,霉菌,抗生素,霉菌,毒素,酵母,蕈菌,霉菌毒素是霉菌产生的次级代谢产物,次级代谢产物,一、饲料中霉菌毒素的危害,2,、霉菌毒素产生的原因,霉菌无处不在，它们可在农作物生长、收获、运输和储存期间生长并产生毒素,农作物作为饲料原料在生产、销售、储存、运输过程中如果受到霉菌污染也会发生霉变、遭受霉菌毒素污染,一、饲料中霉菌毒素的危害,3,、霉菌毒素的种类,现已报道的霉菌毒素大约有,300,种,在饲料中常见的,、,对人和动物健康造成潜在危害的毒素主要有：黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、,T-2,毒素、伏马毒素和脱氧雪腐镰刀菌稀醇（呕吐毒素）等,6,种毒素,一、饲料中霉菌毒素的危害,4,、霉菌毒素的主要危害,一是,可以引起饲料的变质，产生异味，降低其饲用价值，甚至完全让其失去商品价值,二是,饲料被霉菌污染后，导致畜禽的急、慢性中毒，免疫机能和生产性能下降,，造成养殖业效益的下降,三是,残留于畜禽肌肉、内脏或乳中的霉菌毒素通过食物链传递给消费者，,给食品安全带来,更大的,风险,二、饲料中霉菌毒素的主要检测方法,1,、饲料中主要霉菌毒素的检测标准一览表,霉菌毒素名称,标准号,标准名称,检测方法,黄曲霉毒素,GB/T 30955-2014,饲料中黄曲霉毒素,B1,、,B2,、,G1,、,G2,的测定 免疫亲和柱净化高效液相色谱法,高效液相色谱法（荧光）,GB/T 17480-2008,饲料中黄曲霉毒素,B1,的测定 酶联免疫吸附法,酶联免疫吸附法,GB/T 8381-2008,饲料中黄曲霉毒素,B1,的测定 半定量薄层色谱法,薄层色谱法,NY/T 2071-2011,饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和,T-2,毒素的测定液相色谱,-,串联质谱法,液相色谱,-,串联质谱法,NY/T 2550-2014,饲料中黄曲霉毒素,B1,的测定 胶体金法,胶体金法,NY/T 2549-2014,饲料中黄曲霉毒素,B1,的测定 免疫亲和荧光光度法,荧光光度法,NY/T 2548-2014,饲料中黄曲霉毒素,B1,的测定 时间分辨荧光免疫层析法,免疫层析法,DB37/T 2617-2014,饲料中黄曲霉毒素,B1,的测定 高效液相色谱法,高效液相色谱法,玉米赤霉烯酮,GB/T 28716-2012,饲料中玉米赤霉烯酮的测定 免疫亲和柱净化,-,高效液相色谱法,高效液相色谱法（荧光）,GB/T19540-2004,饲料中玉米赤霉烯酮的测定,薄层色谱法,酶联,免疫吸附法,DB51/T 1080-2010,饲料中玉米赤霉烯酮的测定 高效液相色谱法,高效液相色谱法,DB22/T 1618-2012,饲料中玉米赤霉烯酮的测定 液相色谱,-,质谱,/,质谱法,液相色谱,-,串联质谱法,脱氧雪腐镰刀菌烯醇（呕吐毒素）,GB/T 30956-2014,饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定 免疫亲和柱净化高效液相色谱法,高效液相色谱法（紫外）,GB/T 8381.6-2005,配合饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定薄层色谱法,薄层色谱法,DB51/T 1079-2010,饲料中呕吐毒素的测定高效液相色谱法,高效液相色谱法,赭曲霉毒素,A,GB/T 30957-2014,饲料中赭曲霉毒素,A,的测定 免疫亲和柱净化高效液相色谱法,高效液相色谱法（荧光）,GB/T19539-2004,饲料中赭曲霉毒素,A,的测定,薄层色,谱方法,酶联免疫吸附测定法,DB51/T 1081-2010,饲料中赭曲霉毒素,A,的测定 高效液相色谱法,高效液相色谱法,T-2,毒素,GB/T 28718-2012,饲料中,T-2,毒素的测定 免疫亲和柱净化,-,高效液相色谱法,高效液相色谱法（荧光）,GB/T 8381.4-2005,配合,饲料中,T-2,毒素的测定薄层色谱法,薄层色谱法,DB51/T 1078-2010,饲料中,T-2,毒素的测定高效液相色谱法,高效液相色谱法,伏马毒素,NY/T1970-2010,饲料中伏马毒素的测定（伏马毒素,B1,和伏马毒素,B2,含量）,液相色谱串联质谱法 高效液相色谱法（荧光）,DB51/T 1082-2010,饲料中伏马毒素,B1,的测定 高效液相色谱法,高效液相色谱法,二、饲料中霉菌毒素的主要检测方法,2,、霉菌毒素的主要检测方法,胶体金免疫层析法,酶联免疫吸附法,荧光光度法,薄层色谱法,高效液相色谱（荧光,/,紫外）法,高效液相色谱串联质谱法,二、饲料中霉菌毒素的主要检测方法,3,、主要检测方法的特点比较,色谱方法,ELISA,试纸条,样品处理,复杂，需要净化柱纯化操作,简单，只需萃取过滤,简单，只需萃取过滤,检测时间,30-60,分钟,30-60,分钟,5-10,分钟,检测通量,单个样品，一种或多种毒素,多个样品，一个毒素,单种样品,仪器成本,昂贵（,HPLC,LC-MS/MS,）,便宜（酶标仪）,无需仪器,准确度,高,中,低,检测成本,昂贵,便宜,便宜,人员技术要求,专业技术背景 复杂的培训,无需专业背景，简单培训,无需专业背景，简单培训,样品要求,几乎可以处理任何样品,对样品基质要求高,对样品基质要求非常高,检测效率,可以进行多毒素检测,只能完成单一毒素检测,只能完成单一毒素检测,二、饲料中霉菌毒素的主要检测方法,4,、检测方案,胶体金,阳性样确证,高效液相,液质联用,荧光分析,初筛,ELISA,批量样本,可疑样品,二、饲料中霉菌毒素的主要检测方法,5,、检测流程,取样,GB/T,14699.1 2005,饲料 采样,制样,GB/T20195,动物饲料试样的制备,萃取,净化,（主要用于色谱法）,分析测试,三、,ELISA,法的操作要点及注意事项,1,、酶联免疫吸附（,ELISA,）试验的定义及分类,定义：用酶标记抗原或抗体检测液体中未知抗体或抗原的方法。,间接法,将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗检测液相中未知抗体,双抗体夹心法,将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗检测液相中的可溶性抗原,竞争法,将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体,分类：,三、,ELISA,法的操作要点及注意事项,2,、竞争,ELISA,的原理,三、,ELISA,法的操作要点及注意事项,2,、检测步骤及,注意事项,（,1,）准备阶段,详细阅读说明书,确认试剂盒试剂组成、数量及其用途,试剂配制,试样的制备、提取及稀释,试剂盒试用前要充分回温,实验室室温最好控制在,20-25,准备好实验器具（移液枪机及枪头）,确认仪器设备运行正常,三、,ELISA,法的操作要点及注意事项,2,、检测步骤及,注意事项,（续）,（,2,）加样,标准曲线孔,-,酶标抗原,+,标准曲线溶液,样品测试孔,-,酶标抗原,+,样品提取物溶液,注意事项：,加样体积准确,前后加样时间不宜过长,不可漏孔、跳孔,防止交叉污染,三、,ELISA,法的操作要点及注意事项,2,、操作要点及注意事项（续）,容易出现的问题,解决方法,加样时间过长，导致前后反应时间差异大,一次检测不要检测太多样品,加样使用使用单枪，其他步骤使用排枪,先将酶标抗原和样品提取液在空白微孔板中混合均匀，再用多通道移液器将混合液加到检测微孔板中,交叉污染,枪头一次性使用,试样加入,后的,步骤枪,头不接触微孔,液体挂壁排不尽,使用硅化枪头,移取体积不一致,高质量移液枪,+,配套墙头,+,人员操作训练,产生气泡,轻轻回形振荡,三、,ELISA,法的操作要点及注意事项,2,、操作要点及注意事项,(,续,),（,3,）孵育,孵育前应混匀反应物,严格按照说明书控制温度、时间及避光要求,防止微孔内,液体挥发，加以密封,（,4,）洗板,甩除液体要干净利落，不要投鼠忌器,加洗液不要溢出微孔，防止交叉污染,拍板用力适当，看不到明显液体为宜,三、,ELISA,法的操作要点及注意事项,2,、操作要点及注意事项,(,续,),（,5,）显色,加显色液要快速准确,回形振荡混匀，消除气泡,严格按照说明书控制温度、时间及避光要求,防止微孔内,液体挥发，加以密封,（,6,）显色终止,按照加显色液的顺序及速度加终止夜,回形振荡混匀液体,三、,ELISA,法的操作要点及注意事项,2,、操作要点及注意事项,(,续,),（,6,）读数（检测吸光度）,终止反应后应尽快检测吸光度,按照说明书要求设置酶标仪参数,三、,ELISA,法的操作要点及注意事项,3,、其他应注意的问题,劳动安全保护及环境保护,不同批次的试剂盒微孔板不要混用,试剂盒质量差异（重复性、准确性）明显,四、,HPLC,法在饲料霉菌检测中的应用,霉菌,毒素 名称,提取液,净化,检测器,备注,黄曲霉毒素,甲醇,-,水,免疫亲和柱,多功能净化柱,荧光检测器,串联质谱,荧光检测需柱前光化学衍生,玉米赤霉烯酮,乙腈,-,水,免疫亲和柱,荧光检测器,串联质谱,脱氧雪腐镰刀菌烯醇（呕吐毒素）,水,免疫亲和柱,紫外检测器,赭曲霉毒素,A,甲醇,-,水,免疫亲和柱,荧光检测器,T-2,毒素,甲醇,-,水,免疫亲和柱,荧光检测器,需柱前化学衍生,伏马毒素,甲醇,-,水,免疫亲和柱,SAX,净化柱,荧光检测器,串联质谱,荧光检测需柱前化学衍生,1,、,HPLC,法检测霉菌毒素的关键点比较,四、,HPLC,法在饲料霉菌检测中的应用,2,、免疫亲和柱净化原理,加入待净化样本,洗涤干扰物,洗脱目标物,四、,HPLC,法在饲料霉菌检测中的应用,3,、免疫亲和柱使用注意事项,免疫亲和柱应在,2,8,保存，不要冷冻，关注有效期,免疫亲和净化柱使用前要恢复其温度至室温（,20-25,）,整个纯化过程尽量不要让柱子干涸,免疫亲和净化柱不能混用,具体使用方法按照说明书操作，不可完全按检测标准生,搬硬套,四、,HPLC,法在饲料霉菌检测中的应用,4,、其他注意事项,取样和制样,玻璃纤维滤纸不得含荧光物质,基质效应,欢迎批评指正,谢谢大家,质量第一 公正科学 及时准确,