肿瘤体外药敏检测.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,肿瘤化疗药物敏感性试验是个体化治疗的基础,肿瘤化疗药物敏感性试验,(TCA),Tumor Chemosensitivity Assay,将肿瘤细胞进行体外的有药培养，然后通过检测细胞活性的有关指标，判断不同药物的疗效。通过这种试验，即可确定针对个体肿瘤细胞具有最佳疗效的化疗药物或药物组合。,1.,肿瘤细胞的异质性,(,heterogeneity,),肿瘤的发生具有多阶段、多基因的特点，而同一种肿瘤的基因特性和发生阶段都可能会有非常大的差别；表现出在形态上和生物学功能上的极大的不同。,这种肿瘤细胞的异质性已经得到越来越清楚的认识。,肿瘤细胞的异质性主要表现在,形态异质性：,病理学上的形态多种多样。,基因异质性：,肿瘤的发生经历了多基因的改变，同一种基,因可以有多个突变位点。如,P,53,基因的突变,位点就已发现有,2000,个之多。,功能异质性：,基因的异质性导致生物学功能的异质性。,左：肠型腺癌,(,胃,),右：弥漫型胃癌,2.,临床与个体化治疗,化疗作为全身性治疗的手段，在恶性肿瘤的治疗中具有不可替代的地位。,同种肿瘤对化疗药物具有不同的反应性，忽视个体差异仅凭经验式化疗存在盲目性，使得总体疗效不佳。尤其对实体瘤，经验化疗的疗效仅为,20,左右。,临床需要切实可行的检测方法，在用药前筛选出敏感药物，以进行针对性较强的个体化治疗；是否进行个体化治疗成为肿瘤化疗能否成功的关键因素。,0,50,100,150,200,250,0,20,40,60,80,100,ATP-TCA,指导的化疗,(,n=39),传统化疗,(,n=17),p,=0,0009,Weeks,%,Patients,0,50,100,150,200,250,0,20,40,60,80,100,ATP-TCA,指导的化疗,(n=39),传统化疗,(n=17),p,=0,0016,Weeks,%,Patients,Overall Survival,Progression free Survival,引自,Kurbacher CM,Cree IA,Brucker.Anticancer Drugs.1998,9:51-57,传统化疗和,ATP-TCA,指导的化疗的生存率比较,肿瘤化疗药敏方法发展及简介,化学治疗是肿瘤的三大治疗手段之一。近,30,年来，虽然某些恶性肿瘤的化学治疗有明显改善，但多数肿瘤，特别是实体瘤疗效仍不理想。这与肿瘤存在个体差异性，以及,多重耐药性（,MDR,）,等因素有关。,因此如何选择有效药物，进行有的放矢的治疗早已成为化疗界所关注的问题。,早在上世纪,60,年代已有报告，用卵巢癌组织进行药敏检测，该组病人中位生存期有明显延长。化疗药敏检测已发展成为体外,（,in vitro,）,与体内,（,in vivo,）,两类，成为,“,当今癌症研究的主攻课题,”,之一。,理想的药敏检测方法应该具备的条件,操作简便，可以标准化，便于推广,标本可评价率高,检测敏感、可靠、客观,临床相关性,肿瘤化疗药敏方法发展创新方向,1.,标准化，精确定量（无论是用药量或细胞数等）,2.,对体内环境的极近模拟,一、体外药敏检测,（一）瘤细胞直接损害试验,新鲜肿瘤标本制成单细胞悬液，与抗癌药接触,1,数小时后，洗去抗癌药，加入染色剂，与未加药对照样本比较，可从瘤细胞的杀伤比例判断药物抗肿瘤效应。根据染色剂与观察指标的不同，可分为：美兰法、伊红台盼蓝法、吖啶橙荧光测定法、同位素释放法等。上述试验周期短、成本低、方法简便，但准确性差，现已少用或仅作为细胞存活与否的判断方法。,（二）原代瘤细胞培养,体外药敏预测一般采用短期原代培养,。在无菌条件下，用机械法和或酶消化法，将新鲜肿瘤标本分离为组织块、细胞团或分散的单个细胞（视瘤组织多寡及所用培养方法而定），与各种抗癌药分别作用一定时间后，与对照组比较，可计算用药组的瘤细胞杀伤比例，测出抗癌药物敏感度。,主要的,原代瘤细胞培养,药敏检测方法,及其,存在的问题,药敏检测方法,存在问题,集落形成法,（,HTCA）,标本可评价率低，仅有,4070,。,实验周期长，需要,2,周以上,测试药物种类和数量有限,操作繁琐，难以标准化,阳性预测值较低，仅有,40,60,四唑蓝比色法,(,MTT),敏感性较差，最低仅能检测,500,个细胞,量程较小，有效量程在,2.0,以内,细胞毒性差异染色法,(DiSC),可适用标本类型不广，目前仅用于血液肿瘤,人为判断因素较大，难以推广,标本可评价率不高，仅有,70,80,阳性预测值较低，仅有,70,80,胸腺嘧啶核苷掺入法,(,3,H-TdR),实验人员接触放射，不利于健康,标本可评价率不高，仅有,70,80,测试结果仅能反映少量处于增殖相的肿瘤细胞,对某些药物的测试结果存在假阴性,原代瘤细胞培养,药敏检测方法的几点提示,本类方法在与其他学科的结合中仍在不断探索发展，并无完美及完全定形的技术，各方法内部尚有细化及改进方法。,肿瘤细胞贴壁法、瘤细胞粘附培养法、细胞团培养法及流式细胞仪测定法等已成为细胞分子生物学技术手段，不再作为独立的药敏检测方法。,一些相对简便经济的方法在目前仍应积极提倡，如,MTT,比色法。,（三）同步瘤细胞培养,将处于不同,细胞周期,的瘤细胞分离培养，可研究药物的周期特异性作用。,1.,药物阻断法,如长春新碱使细胞阻滞于,M,期，博莱霉素,则使其堆积于,G,2,期。,2.,物理法,运用细胞同步化技术，如,M,期细胞震荡收集,法，可避免药物阻断法的干扰作用。,（四）瘤细胞连续培养,瘤细胞培养一定时间后（通常为,1,4,周），细胞生长增殖达到一定密度，产生密度抑制。故需分离出一部分细胞，进行,传代培养,，并可建立细胞株。本法得到的瘤细胞数量多，在抗癌新药筛选中起重要作用。,缺点是实验周期长，只能作回顾性药敏检测。,二、体内药敏检测,即,异种移植法,。通常用啮齿类动物做移植宿主。将人癌标本移植于受试动物体内如,肾包膜下移植法（,SRCA,）,，再给予抗癌药。数天至数周后处死动物，测量移植瘤的大小变化，以评定药物敏感度。本法较体外试验更接近人体情况，对需要体内代谢而发挥作用的药物，如临床常用的环磷酰胺尤为适宜。还可测试联合化疗方案的疗效，临床意义较大。,体外试验与体内试验可交替应用,。如将体外培养的瘤细胞植入裸鼠体内，或将人癌移植瘤再作,HCTA,培养,均可。,几种,原代瘤细胞培养,药敏检测方法简介,一、,MTT,比色法,四氮唑化合物,MTT,（,Methylthiazolyl tetrazolium,）,在活细胞线粒体酶作用下可裂解为紫蓝色不溶性的甲臜化合物,（,Formazan,），,加入异丙醇或二甲基亚砜后，用分光光度计（酶标仪）测出其光密度变化。本法简单迅速，操作可半自动化。缺点是不能区分正常细胞与肿瘤细胞，此外对于不同类型的肿瘤标本可能需要不同的细胞浓度与药物作用时间。故有待进一步改进。目前已有药物梯度浓度的引入。,二,、,ATP-TCA,ATP,生物荧光肿瘤体外药敏检测,技术原理：,在有氧条件下,荧光酶（,luciferase,）,可以催化,荧光素（,luciferin,）,释放出荧光（波长为,562nm,），同时,ATP,转变成,AMP,。所释放的荧光强度与胞内,ATP,含量呈正相关。细胞死亡后，胞内,ATP,迅速水解，而活细胞的,ATP,含量基本恒定。因此所测得的荧光强度反映了活细胞的数量。比较药物系列浓度对培养细胞的不同抑制率，参照相应判断指标，从而可以评估该化疗药物对肿瘤细胞的杀伤效果。,ATP,+Luciferin+O,2,AMP+2Pi+,Photons,+Oxylaluciferin,Luciferase,荧光强度与活细胞数量的关系,技术,流程,Tumor,Single Cell suspension,Mechanical and,enzymatical dissociation,Incubation,for 3-5 days,Addition of drugs/medium,ATP-,Luminescence,ATP extraction,and stabilization,Software Evaluation,Construction of,dose-response plots,国内外研究历史回顾,1.1982,年，,Moyer,等首先提出内源性,ATP,的含量可以反映细胞活性;随后,Kangas,等相继证实生物荧光技术是一种敏感、可靠的确定各种细胞活性的检测方法。,2.自1988年，,Sevin,首先将此方法用于新鲜肿瘤组织的药敏检测，在欧洲和美国已经进行了大量的临床应用研究。,3.,1998年，,Kurbacher,等人报道了,ATP-TCA,辅助化疗与传统化疗比较的临床期试验结果，试验结果表明，,ATP,-TCA,指导的化疗治疗复发性卵巢癌较传统化疗模式更能提高临床疗效，延长病人总生存期和无进展生存期。,4.,NIH,的,GOG(Gynecologic Oncology Group),项目组认为,ATP-TCA,是最有发展前途的一种药敏试验方法，已纳入重点科研项目,(1998),。,目前先进国家对该技术的评价,1998,年,德国,DCS,公司将该技术产业化，并获得国际,ISO,质量评估体系认证，,在欧洲和北美市场获得准入,。,2.2001,年，美国全国医疗保险协会,(Health Maintenance Organization),认为，该技术是一项精确和可靠的并能指导医生选择用药的,先进技术,，建议在全美进行医疗保险赔付。目前在加州等,15,个州已获医疗保险赔付,。,3.2003,年日本厚生省和保险联合会也认为，该技术是一项,先进的临床医学项目,，该技术指导的肿瘤化疗较传统的化疗方案更能明显提高胃肠道肿瘤的治愈率，建议该项技术在全国范围内获得医疗保险赔付。,ATP-TCA,技术是目前最先进的体外药敏技术，该技术敏感可靠，具有极大的临床应用价值,主要试剂仪器,ATP-TCA,核心试剂盒（德国,DCS,）：包括完全分析培养基（,CAM,）、最大,ATP,抑制剂、组织消化酶液、,ATP,提取液、荧光素,-,荧光素酶（,lulu,）、,ATP,标准品、无菌,96,微孔培养板。自发光分析仪（德国,Berthold,）、超净工作台,ATP-TCA,技术的核心试剂,.,荧光酶试剂,(luciferin-luciferase counting reagent),热稳定性和发光效率均好的重组酶试剂保证检测的敏感性和可靠性，满足临床实际工作的需要,.,培养基,(complete assay medium),肿瘤细胞选择性培养基支持肿瘤细胞生长增殖，促进正常细胞死亡，从而保证药敏检测的肿瘤细胞特异性,培养前后细胞组成变化,培养前细胞组成,3-5,天培养后细胞组成,淋巴 上皮 成纤维 肿瘤 淋巴 上皮 成纤维 肿瘤,细胞 细胞 细胞 细胞,细胞 细胞 细胞 细胞,40-50%10-25%5-10%10-20%80%,选择性培养基的研究结果表明该培养基具有良好的选择性，适合肿瘤体外药敏检测的需要,ATP-TCA,药物测试方式,实 验 过 程,实体瘤（也可以是穿刺样品或腹水等液体样品）先被切碎，并用酶分离成,细胞悬液,。这一过程并不影响肿瘤细胞的活性。,将细胞悬液加入到含有浓度不同的化疗药物的,无血清培养基,（,CAM,）中，在培养基板中培养,3-5,天。,CAM,培养基可以抑制非瘤细胞的生长，选择性培养肿瘤细胞。,培养后，加入可以稳定细胞内,ATP,的提取试剂，,提取出,ATP,。,加入,荧光素,-,荧光素酶系统,，在板式发光分析仪上进行,ATP,的检测。,根据含药孔的,荧光值,与无药孔（,M,0,）的荧光值的比较，得出该浓度化疗药物对肿瘤细胞的抑制值。,做出化疗药物的,剂量,-,抑制曲线,，得到,AUC,值、,IC,90,、,IC,50,以及敏感度指数,SI,值，判断化疗药物的敏感度。,剂量,-,抑制曲线,评 价 标 准,强敏感,(SS),：,IC,50,25%,及,IC,90,100%PPC,中度敏感,(IS),：,IC,50,100%PPC,轻度敏感,(MS),：,IC,50,25%,及,IC,90,25%,及,IC,90,100%PPC,化疗药物敏感性分析：,下列指标可以说明药物的敏感性和耐药性,高,AUC,，低,IC,50,IC,90,SI,值，和高,TGI,值，显示,100,肿瘤细胞生长抑制，药物的敏感性就高。,低,AUC,，高,IC,50,IC,90,SI,值，和低,TGI,值，表示对药物的高耐药性。,三、组织培养药物敏感性检测技术,Histoculture Drug Response Assay(HDRA),HDRA,技术由,Hoffman,等人于,80,年代末期建立,是一种基于非分散性组织的药物敏感性检测技术,该技术将微小组织培养于一种天然胶原海绵基质上,同时加入抗癌药物对其作用一定的时间,细胞活性终点评价采用,MTT,还原法,结果较为直观可靠。,HDRA,技术流程,1.,肿瘤组织预处理,:,去脂肪,纤维以及血污,.,2.,肿瘤组织处理,:,清洗,眼科镊子和小剪刀进行剪切,使组,织块大小约为,1-2mm.,3.,将,3,块组织块放置于约,1cm,2,的胶原海绵小块上,然后放,置于预加有培养基的,24,孔板中,培养过夜,.,4.,加入含药物的培养基,每个浓度,2,个平行孔,.,5.,继续培养,3,天后,加入,MTT,孵育,4h,然后提取还原的,MTT,测定,570nm,的,OD,值,.,6.,药物处理组和对照组进行比较,计算抑制率,评价药物杀伤,.,肿瘤组织的处理,培养中的肿瘤组织,(,一,),培养孔,培养基液面,肿瘤组织,胶原海绵,培养中的肿瘤组织,(,二,),HDRA,培养肿瘤组织形态结构,MTT,还原法测定细胞活力,结果评价,加药处理组,(T),空白对照组,(C),抑制率,(I)=T/C,敏感药物,:I50%,HDRA,技术特点,1.,肿瘤组织不需要进行机械,/,酶学分散,保持其结构及形态,减少操作造成的细胞损失,.,2.,模拟体内药物对癌组织的作用,评价客观,同时避免了仅进行癌细胞评价的片面性,.,3.,该技术采用天然胶原海绵作为培养基质,同时培养的,组织接近液面,促进气液交换,保证癌细胞的生长增殖,.,4.,具有较高的标本可评价率,据报道为,90-100%.,HDRA,技术历史和现状,1.,Hoffman,等人于,80,年代末期建立基于胶原海绵的立体,组织培养技术,后应用于原代瘤组织体外药敏检测,至今已有,10,余年的历史。,2.,目前该技术主要在日本和美国进行大量的临床应用,研究,公开发表文献,50,余篇。,3.2002,年,Singh,等人在头颈部肿瘤中的研究表明,该技,术能够评价患者预后,从而指导肿瘤化学治疗。,胃肠癌生存预后,Kaplan miere,生存曲线,四、胶滴肿瘤药敏检测技术,胶滴肿瘤药敏检测技术,（,collagen gel droplet culture drug-sensitivity test,，,CD-DST,）,突出特点是能够排除成纤维细胞对实验的干扰，在体外对抗癌药物的特异性杀伤作用做出客观评价，细胞用量少，标本培养成功率高，采用图像软件系统分析结果，客观准确。这是目前日本科学家提出的很有发展前景的研究技术。,体外药敏检测技术的临床应用及要面临的挑战,药敏检测技术在肿瘤体外药敏检测技术在临床上的应用是提高肿瘤化疗水平的重要工具，该技术的应用必然要在某些肿瘤的治疗技术、治疗观念和疗效等方面产生较大的影响，最终使医生在使用常规化疗方案时能够综合考虑该患者体外药敏实验的结果，用药更加准确，使患者得到更加合理有效的治疗，尽可能降低无效治疗的机会。,然而，作为一种新的药敏检测技术的应用势必要有一个广大医生认识、认可、接受乃至修正的过程，甚至该技术会受原有药敏检测技术和不合理经营的影响。,肿瘤研究工作精深繁复，耗费巨大，病例资源稀缺，要想在肿瘤治疗的道路上走得更远，,无私合作,，,精诚团结,，,高效利用和节约资源,，才会有所建树。,Thank you for your attention!,对肿瘤的个体化治疗的一些思考,人类对个体化医学的认识和发展，得益于在细胞分子水平对疾病发病、演进及治疗反应的深入研究。一旦解读了这些分子差异，患病个体就可利用这些信息获得更为特异、有效的治疗，个体化医学将对药物研发途径及临床医疗实践产生重大影响。,现代临床肿瘤学中存在相当多的不确定性，这对患者和医师而言均十分不利，两者均不得不经常面对许多无奈。患者希望医师能够给予关于疾病的准确答复，诸如根治性手术后肿瘤复发的危险，某种化疗方案对已发生转移的肿瘤疗效如何等等。,对肿瘤学家而言，常常只能借助于大样本的前瞻性临床试验的结果估计患者在治疗中的风险或受益情况。不同肿瘤患者接受化疗常出现治疗反应及药物毒性的明显差异。基因组的可变性，如编码关键代谢酶复合体、药物作用靶分子及药物转运分子的基因组等发生改变，是导致这一现象的重要因素。,在美国，大多数卵巢癌患者接受,联合铂类药物（,platinum-based regimen,）,和紫杉醇类衍生物的治疗。但有效率最好也仅,70,，提示至少,30,的卵巢癌患者承受铂类药物化疗的毒性作用而无明显的益处。对单用紫杉醇类药物（,paclitaxel,taxol,）的有效率为,50,，提示一半的患者并不能从中获益。并且，第一疗程铂类药物化疗可能会延误其他有效化疗药物的选择和应用，也可能降低患者的生理贮备。,许多针对特异性分子靶的新型化疗药物正试用于各种癌症，以期增加疗效、降低毒性。尚不清楚是否所有患者均对这些新型化疗药物同样有效，或是否同一患者对所有这些新型药物均有效。,个体化医学意味着在正确的时间为诊断正确的患者提供,“,量身定做,”,的适宜治疗。选择哪些患者可能从辅助治疗中获益，避免那些无效患者承受药物相关的不良反应。对患者而言，他们可以因此而接受更加安全有效的治疗；对药物工业而言，意味着效率、产量及更优质药物品种的增加；对整个社会而言，意味着可以对有限的医疗资源进行配置，物尽其用。,个体化医学在患病个体的细胞分子档案与临床资料间建立一条纽带，可以让医师及研究者做出正确的决定，可以让患者有机会根据自己的病情决定未来的健康生活方式。传统的经验医学正逐渐淡出历史的舞台，而代之以更为精确的分子标记辅助诊断及更高效的细胞分子生物学水平指导下的治疗技术手段。,