生物化学：第八章 基因重组与分子生物学技术.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第八章 基因重组与分子生物学技术,基因工程诞生的技术突破,限制性内切酶（,restriction enzymes,）,1970,年,H.O.Smith,等分离出第一种限制性核酸内切酶。,Werner Arber,理论预见限制酶,Daniel Nathans,用限制酶切得,SV40 DNA,片断,Hamilton O.Smith,得到第一个限制酶,1978,年,Nobel,生理或医学奖,（二）限制性核酸内切酶,可以识别,DNA,的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链,DNA,，被称为,基因工程的手术刀,，广泛使用。已发现多种细菌都含有这类限制,修饰酶体系。,作用,与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源,DNA，,保护自身,DNA。,分类,、,（基因工程技术中常用型）,（二）限制性核酸内切酶种类,类酶识别序列特点,回文结构,(,palindrome),切口：,平端切口,、,粘端切口,GG,A,T,CC,CC,T,A,GG,回文结构,：,II,类限制内切酶要求严格的识别序列和切割位点，大部分,II,类酶识别,DNA,中,4-8bp,具有反转对称的序列。,（二）限制性核酸内切酶作用特点,产生,5,突出粘性末端,(cohesive end):,以,EcoR I,为例：,5GAATT C3,5G OH pTTAAC3,3C TTAAG5,3 CTTAA p,OH G5,产生3突出的粘性末端：,以,Pst,为例：,5CTGCAG3,5CTGCAOH-pG3,3GACGTC5,3Gp-OHACGTC5,产生平末端,(blunt end):,Nru,为例：,5GTTAAC3,5GTTOH-pAAC3,3CAATTG5,3CAAp-OHTTG5,限制性核酸内切酶的种类很多，至今已发现近,1800,多种，可根据它们对,DNA,有不同的识别序列和切割特征选用，从而为基因工程提供有力工具。,限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease),在重组,DNA,技术中有重要地位,配伍末端：,识别序列不同，但切割,DNA,后产生相同类型的粘性末端。,第二节,基因工程操作步骤,一、目的基因的获得,目的基因的筛选和分离可采用以下方法进行：,1,直接从基因组,DNA,中分离：,基因是包含了生物体某种蛋白质或,RNA,的完整遗传信息的一段特定的基因组,DNA,的核苷酸序列,。,原核生物,-,从基因组中直接分离得到目的基因,；,真核生物,-,可用限制性内切酶将基因组,DNA,作不完全酶解，或超声波等机械法切割，将整个基因组,DNA,转变为许多较小的片段，经梯度离心或电泳回收适合于插入载体的片段构建基因文库,将这些片段与克隆载体拼接成重组,DNA,分子，继而转入受体菌扩增，使每个细菌内都携带一种重组,DNA,分子的多个拷贝。,这样由某种克隆载体携带的所有基因组,DNA,的集合称为,基因组,DNA,文库,。,建立基因组文库后，采用适当的筛选方法可从中选筛出含有感兴趣基因的菌株，再进行扩增，将重组,DNA,分离、回收、以获得目的基因克隆。,基因组文库的制作,2,化学合成法,根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。,对于特别长的基因，可以分成几段合成，然后连接在一起。,3.,从,cDNA,文库中筛选,采用一定的方法获取特定基因的,mRNA,，再通过逆转录酶催化合成其互补,DNA,（,cDNA,），除去,RNA,链后，再用,DNA,聚合酶合成其互补,DNA,链，从而得到双链,DNA,。,这样得到的一套,DNA,片段的克隆称为,cDNA,文库。该文库包含细胞表达的各种,mRNA,信息。采用标记的目的基因探针，从,cDNA,文库中就可直接筛选到连续编码的目的基因，可用于生产某些蛋白质。,将某一种基因,DNA,用适当的限制酶切断后，与载体,DNA,重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组,DNA,的种群，称为,G,文库,(genomic DNA library),。,将某种细胞的全部,mRNA,通过逆转合成,cDNA,，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为,C-,文库,(cDNA library),。,4,利用,PCR,合成,PCR,是一种在体外利用酶促反应简便迅速扩增特异序列的基因组,DNA,或,cDNA,的专门技术。如果知道待扩增目的基因片段两侧或附近的,DNA,序列，据此合成互补引物，可进行目的基因扩增。,可以直接从染色体,DNA,扩增，也可用,RNA,为起始模板，称,反转录,PCR,（,RT-PCR,）,。其基本过程为：分离、纯化,mRNA,，利用反转录酶合成单链,cDNA,；杂合双链中的,RNA,用碱或,RNaseH,消化，剩下的,cDNA,为模板，由,DNA,聚合酶,催化合成双链,cDNA,。应用,PCR,技术可把极微量生物材料中的,DNA,扩增至足够使用量。,二、基因载体的选择和构建,有多种限制性内切酶的单一酶切位点以便外源基因插入；,本身的分子量不宜太大，可容纳较大的外源,DNA,片段，拷贝数高、易与宿主,DNA,分离；,在宿主细胞中能独立地自我复制，并在传代时稳定地保存；,有遗传标记可用于重组体的筛选。,此外，对克隆表达载体需要在载体的克隆位点上游加上强启动子序列，下游加上终止密码子等，使载体不至于失去控制。,三、目的基因和载体的连接（切、接）,通常采用,限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease),，简称限制酶，分别对载体,DNA,和目的基因进行切断，以便于重组。,限制酶目前已经发现,400,多种，所识别的顺序往往为,4-8,个碱基对，且有,回文结构,。,由限制酶切断后的末端可形成,平端、,3-,突出粘性末端和,5-,突出粘性末端,三种情况。形成粘性末端,(cohesive end),者较有利于载体,DNA,和目的基因的重组。,载体和目的基因的重组,即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的,DNA,分子。,DNA,连接酶有两种：,T4 DNA,连接酶，是从噬菌体,T4,感染的大肠埃希菌中分离纯化获得的；大肠埃希菌,DNA,连接酶，是直接从大肠埃希菌中分离纯化的连接酶。,（一）黏性末端连接法及平端连接：,当载体,DNA,和目的基因均用同一或两种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。由于黏性末端的单链间碱基配对，退火后两者互补黏合，再加入,DNA,连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。,较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。,载体,DNA,与目的基因的连接,（二）同聚物加尾法,即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得黏性末端时，可采用此方法。,此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，分别在目的基因和载体,DNA 3-OH,末端加上同聚核苷酸如,A,或,T,，制造出相互配对的黏性末端，用连接酶连接。,（三）人工接头法,人工接头是含有,1,2,种限制酶切位点的人工合成的寡核苷酸链。将人工接头磷酸化后连接到目的基因或载体,DNA,平端，使之引入新的酶切位点，连上接头后，再用相应的限制酶切割及连接黏性末端。,四、重组,DNA,分子导入受体细胞（转）,重组,DNA,需导入宿主细胞才能进行增殖或表达。重组质粒可通过,转化,（,transformation,）方式导入宿主细胞，即将大肠杆菌用,CaCl,2,处理，增加细菌细胞壁的通透性，再与重组质粒,DNA,短暂温育，质粒,DNA,即可导入宿主细胞。,如果是用,噬菌体作为载体的重组体，则需要用外壳蛋白进行包装，使之成为具有感染能力的噬菌体，再通过,转染,(transfection),方式将重组噬菌体,DNA,导入大肠杆菌等宿主细胞。,近年来发展的将重组,DNA,分子导入哺乳动物细胞的方法包括利用脂质体包装重组,DNA,，效率高且不损伤受体细胞；,电穿孔,DNA,转染技术；,DNA-,磷酸钙沉淀法；,基因显微注射技术等。,五、重组,DNA,的筛选（筛）,重组体的筛选是指从大量的菌落或菌斑中选择和鉴定出含有目的基因的阳性菌株。分为直接选择法和非直接选择法：,（一）,直接选择法,针对载体携带某种或某些标志基因和目的基因而设计的筛选方法,，其,特点是直接测定基因或基因表型。,如果重组质粒携带有某种抗药性标志基因，如,amp,r,，只有含这种抗药性基因转化的细菌才能在含有该抗生素的培养板上生存并形成菌落。,对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用,插入灭活法,进行筛选。如,pBR322,中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。,1.,抗药性标志选择,(,插入失活法,),抗药性标记选择,目 录,氨苄青霉素抗性基因,四环素抗性基因,当宿主细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。转化或转染的外源基因表达产物可弥补基因缺陷性宿主菌的性状，可以利用营养突变菌株进行筛选，即标志补救。,2.,标志补救,pUC18/19,质粒是以,pBR322,为基础改造的,-,半乳糖苷酶,的启动子及,链,的,DNA,序列,，作为筛选标志,突变型,lac E.coli,可表达该酶的片段（酶的,C,端区）。当宿主和转入载体同时表达、两个片段时,，通过片段互补机制形成具有活性的,-,半乳糖苷酶，可使人工底物,X-gal,转变为蓝色。,LacZ,基因编码的,肽链与失去了正常氨基端的,半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为,互补；,如果插入的外源基因是在载体,lacZ,链基因内，则会干扰,lacZ,的表达，利用,lac E.coli,为转染或感染细胞，在含,X-gal,的培养基上生长时会出现白色菌落。这一现象可用于重组体筛选，又称蓝白斑实验,。,互补筛选,目 录,U6,3.,分子杂交法,用与外源,DNA,互补的核素标记探针与重组子,DNA,进行杂交筛选。将待测核酸样品结合在硝酸纤维膜上，再与溶液中的标记探针杂交。含有目的基因的重组,DNA,与探针结合，而被放射性核素标记。利用这种方法可以直接选择并鉴定目的基因。,根据反应条件的不同可以分为斑点杂交、,Southern,印迹杂交、,Northern,印迹杂交、原位杂交等多种方式。,原位杂交,目 录,Southern,印迹,目 录,五、重组,DNA,的筛选（筛）,（二）免疫学方法筛选,这是利用特异抗体与目的基因的表达产物（作为抗原）之间相互作用进行筛选，而不是直接去鉴定靶基因。免疫学方法又可分为酶免疫检测分析、放射免疫方法等。,放射免疫方法,针对,所要研究的蛋白质预先制备其相应的抗体，再用放射性核素标记该抗体。将转化细菌菌落转移至硝酸纤维素薄膜上，加入标记抗体进行结合,反应,，,即,可能得到显示抗体所结合的特异蛋白质的区带，从而选择出产生该蛋白质的菌落。,鸡的,肌球蛋白的克隆和检出,目 录,放射性抗体检测法,六、克隆基因表达,基因工程的最终目标是进行目的基因的表达。克隆的目的基因在受体细胞表达生物活性蛋白质需要正确的基因转录、有效的蛋白质翻译和适当的转录、翻译后加工的过程。,分为原核表达体系和真核表达体系。,运用,E.coli,表达有用的蛋白质必须使构建的,表达载体,符合下述标准,：,含,E.coli,适宜的选择标志,；,具有能调控转录、产生大量,mRNA,的强,启动子，,要表达的外源基因编码区不能含有插入序列，外源基因位于启动子下游,；,含适当的翻译调控序列，如核糖体结合位点和翻译起始点等,；,含有设计合理的，以确保目的基因按一定方向与载体正确衔接,。,（一）原核表达体系,由于原核细胞和真核细胞的转录、翻译及翻译后加工体系的不同，用原核表达体系表达真核蛋白质时存在一些不足之处。,例如由于缺乏适当的翻译后加工机制，,E.coli,表达体系表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进行糖基化修饰。因此，在实际操作中应充分考虑这些差别。,真核表达体系如酵母、昆虫及哺乳动物细胞表达,体系,，,具有许多优点,：,该体系能识别和除去外源基因的内含子，剪接加工成成熟的,mRNA,；,该体系表达的蛋白在翻译后加工的机会较多（如糖基化修饰），可提高产品的生物学活性及免疫活性,；,用作受体的动物细胞，都是用缺陷的病毒基因组如,SV40,等转化的细胞，能稳定传代,；,使经转化的哺乳动物细胞将表达产物分泌到培养基中，其提纯工艺简单,。,（二）真核表达体系,但操作技术难、费时、不经济是哺乳类动物细胞表达体系的缺点。如何将克隆的重组,DNA,分子导入真核细胞是关键步骤。常用于细胞转染的方法有：磷酸钙转染、,DEAE,葡聚糖介导转染、电穿孔、脂质体转染及显微注射等。,1.,什么是基因重组技术？它包含那些内容？,2.,列举常用的基因工程工具酶的特性和用途。,3.,叙述常用的基因工程载体的种类、特点和用途。,4.,怎样获得目的基因或核酸序列的克隆？有那些,方法？要经过那些基本步骤？,5.,怎样能在大肠杆菌中获得真核基因的表达产物？,第三节,分子生物学常用技术,一、核酸分子杂交与探针技术,（一）分子杂交,把异源的,DNA,分子，或者,DNA,与,RNA,放在一起，加热使,DNA,分子解开成单链后，在缓慢降温复性过程中，只要,DNA,或,RNA,的单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，就可以在不同的分子间形成，这种现象称为,核酸分子杂交,（,nucleic acid molecular hybridization,）。,核酸分子杂交主要应用于：,对特定,DNA,或,RNA,顺序进行定性和定量检测；,测定特定,DNA,序列的限制性内切酶图谱，以判断是否存在,DNA,序列缺失、插入等重排现象；,RNA,结构的初步分析；,特定基因克隆的筛选；,用末端标记人工合成寡核苷酸探针检查基因的特定点突变。,（二）探针技术,经过特殊标记的核酸片段，它具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，在研究和诊断中用于检测核酸样品中特定的基因。探针可以是人工合成的寡核苷酸片段，也可以是,DNA,、,cDNA,或,RNA,片段。常用放射性核素、生物素或荧光染料来标记探针。,进行核酸检测时，使待测核酸变性，成两条单链，变性,DNA,固定于支持物上，与含有标记探针溶液共温浴进行杂交，在碱基配对的前提下，探针与具有互补序列的,DNA,片段结合，使杂交链显示识别标记，而被检测确定，以此确定待测核酸是否与探针的序列具有同源性，从而达到鉴定靶核酸性质的目的。探针还可以用于基因工程中阳性克隆的筛选，遗传病的产前诊断，肿瘤的分子诊断、分类、分型和预后以及传染性流行病病原体的检测等。,二、,分子印迹,技术,20,世纪,70,年代后期出现的分子检测技术,，,是指将分离的生物大分子如核酸、蛋白质等转移到固相支持物并加以检测分析的技术，这个过程类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为,“,blotting,”,。目前这种技术广泛应用于,DNA,、,RNA,、蛋白质、抗原、受体糖蛋白等多种生物大分子的研究。,印迹法基本过程包括：生物样品凝胶电泳分离、分离后的样品转移到固相支持物上、检测分析等三大部分组成。,分子印迹技术的种类,（一）,DNA,印迹技术：,又称为,Southern,杂交，即,DNA-DNA,杂交分析。,（二）,RNA,印迹技术：,又称为,Northern,杂交，即,RNA-DNA,杂交分析。,（三）蛋白质印迹技术：,又称为,Western,杂交，或免疫印迹技术，即利用抗原,-,抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。,是由,Edwen Southern 1975,年创立，进行,DNA,片段的检测，被称为,Southern blotting,，即,DNA,印迹,。,其,基本过程是用某种限制性内切酶消化靶,DNA,，经琼脂糖凝胶电泳后，放入碱性溶液中使,DNA,变性，然后将变性的单链,DNA,从凝胶中按原来的位置和顺序经过一定的方法吸印转移到硝酸纤维素（,nitrocellulose,，,NC,）薄膜上，固定后再与标记的核酸探针杂交，并显示杂交信号,。,DNA,印迹技术主要用于基因组中特异基因的定位与检测等。还可用于分析重组质粒和噬菌体。,（一）,DNA,印迹技术,又称为,Northern blotting,。其基本过程与,Southern,印迹技术相同，先用乙二醛等变性剂处理,RNA,，消除,RNA,的二级结构，然后采用合适的条件凝胶电泳，再将,RNA,转移到,NC,膜上，固定后就可进行杂交显影。,RNA,印迹技术目前主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异,mRNA,的表达水平，也可以比较不同组织和细胞中的同一基因的表达情况，被认为是目前最可靠的,mRNA,水平分析方法之一。,（二）,RNA,印迹技术,蛋白质在电泳之后也可以固定于膜上，再与溶液中的其他蛋白分子相互结合，目的蛋白最常用的是用抗体来检测，因此也称为，也被称为,Western bloting,（蛋白质印迹）。,蛋白质印迹技术用于检测样品中特异性蛋白质的存在，细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质的相互作用的研究。,（三）,蛋白质的印迹分析,将样品蛋白质用聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子量大小分开，用电转移方法定向将蛋白质转移到,NC,膜或其他膜上。印迹在膜上的特异抗原的检出依赖于抗原抗体的结合反应。反应时能与特异性一抗结合的二抗常用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素或放射性核素标记，后者催化某些底物反应后产生示踪信号，能通过放射自显影、底物显色或化学发光,X,片显影来检测蛋白区带的信号，找出能和抗体特异性结合的抗原蛋白。,三、,PCR,技术,（一）,PCR,的概念,PCR,(polymerase chain reaction),即,聚合酶链反应技术,，是指利用耐热,DNA,聚合酶的反复作用，通过变性,-,延伸,-,复性的循环操作，在体外迅速将,DNA,模板扩增数百万倍的一种操作技术。,理论上可在,2,小时内将一个,DNA,分子扩增到,10,6,10,9,倍，从而大大提高了对其进行分析研究的速度。,PCR,技术的创建,一、最初的理论描述,Khorana,Khorana(1971),等最早提出核酸体外扩增的设想：,“,经,DNA,变性，与合适的引物杂交，用,DNA,聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成,tRNA,基因。,”,但由于当时基因序列分析方法尚未成熟，热稳定,DNA,聚合酶尚未报道以及引物合成的困难，这种想法似乎没有实际意义。加上,70,年代初分子克隆技术的出现提供了一种克隆和扩增基因的途径，所以，,Khorana,的设想被人们遗忘了,二、,PCR,技术的发明,Kary Mullis,1985,年，,Kary Mullis,在,Cetus,公司工作期间，发明了,PCR,Mullis,要合成,DNA,引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板,DNA,而烦恼,1983,年,4,月的一个星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上,PCR,技术的创建,PCR,从构想成为现实,1983,年,12,月，,Mullis,用同位素标记法看到了,10,个循环后的,49 bp,长度的第一个,PCR,片断；,1985,年,10,月,25,日申请了,PCR,的专利，,1987,年,7,月,28,日批准（专利号,4,683,202,），,Mullis,是第一发明人；,1985,年,12,月,20,日在,Science,杂志上发表了第一篇,PCR,的学术论文，,Mullis,是共同作者；,1986,年,5,月，,Mullis,在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习,PCR,的方法。,PCR,技术的创建,94,变性,55,退火,Mullis,的构思,1983,年,有关,PCR,反应,5,5,3,3,XX,延伸,（,DNA,聚合酶）,5,5,72,94,55,PCR,循环,普通,PCR,仪、梯度,PCR,仪,全新,4,通道实时荧光定量,PCR,仪,1988,年第一台,PCR,仪问世，,PCR,逐步实现自动化,1989,年美国,Science,杂志列,PCR,为十余项重大科学发明之首，比喻,1989,年为,PCR,爆炸年。,1993,年，,Mullis,因此项技术荣获诺贝尔化学奖。,PCR,技术的发展,PCR,仪的变迁,三个水浴锅，用手移动 （,Mullis,等人当时用的）,电加热块 自来水冷却 （,PE,，,1988,）,电加热块 内置循环液冷却 （,PE,，,1989,）,三个加热块 机械手 （,Strategene,，,1994,）,半导体制冷和加热（,MJ,PE,BioMetra,Eppendorf,）,空气加热,(Roche),梯度,PCR,仪,实时荧光定量,PCR,仪,Lab-on-chip,式的,PCR,仪,(,芯片,PCR),全新,4,通道实时荧光定量,PCR,仪,普通,PCR,仪、梯度,PCR,仪,1,st,cycle,2,nd,cycle,3,rd,cycle,过 程,变 性,退 火,延 伸,（一）,PCR,反应体系,PCR,反应系统应包括：,1,耐热,DNA,聚合酶（,Taq,酶）,这是由耐热细菌体内提取的一种,DNA,聚合酶，可保证在,95,0,C,，,30,分钟以上不会变性失活。,2,模板,DNA,即待分析的目的,DNA,，其长度不宜大于,10kb,。,3,一对特异性引物,为了保证,DNA,聚合酶能够对两条互补链均能进行延伸，需要两种引物，分别位于两条互补模板,DNA,链的,3-,端。,4,四种脱氧核糖核苷酸,4,种,dNTP,的终浓度相等,，用作底物的,dNTP,S,。,5,缓冲溶液,保证,DNA,聚合酶催化时所需的适当的溶液,pH,值，,含有,Mg,2+,的缓冲液,。,PCR,反应时，一般采用,变性,-,退火,-,延伸,三步循环，也可采用,变性,-,延伸,两步循环。,1,变性,通常将反应系统加热至,95,，,30,60,秒，使模板,DNA,完全变性成为单链，并消除引物自身和引物之间存在的局部双链。,（二）,PCR,反应过程,2,退火,通过降低反应温度至,55,，使两种引物能与两条解开的,DNA,互补链的,3,端黏合，以提供,DNA,聚合酶催化聚合所需的,3-OH,。,3,延伸,将反应温度提高到约,72,，在耐热,DNA,聚合酶的催化下，根据模板,DNA,提供的碱基顺序，合成两条互补链，从而使模板,DNA,扩增一倍。,按照上述步骤重复操作约,30,次，即可将模板,DNA,扩增数百万倍。,PCR,的反应原理,（三）几种常见的,PCR,衍生技术,1.,反转录,PCR,技术（,RT-PCR,）,是将,RNA,的反转录反应和,PCR,联合应用的一种技术，原理是：提取组织或细胞中的总,RNA,，以其中的,mRNA,作为模板，在反转录酶作用下生成,cDNA,，再以,cDNA,为模板进行,PCR,扩增，而获得目的基因或检测基因表达。,RT-PCR,使,RNA,检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量,RNA,样品分析成为可能，该技术是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的,RNA,进行定性定量分析的有效方法。,2,.,原位,PCR,技术,原位,PCR,就是在组织细胞里进行,PCR,反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的,PCR,技术的优点。,3.,实时,PCR,技术,又称为荧光定量,PCR,。该技术在常规,PCR,基础上运用荧光能量传递技术，加入荧光标记探针，使得在,PCR,反应中产生的荧光信号与,PCR,产物量成正比，对每一时刻的荧光信号进行实时分析，计算出,PCR,产物量，根据动态变化数据，可以精确计算样品中原有模板的含量。,（四）,PCR,的主要用途,-,分子克隆、基因诊断、肿瘤机制研究、法医,1.,目的基因的克隆,PCR,技术可用于快速方便地获得目的基因，包括利用特异性引物以,cDNA,或基因组,DNA,为模板获得已知的目的基因片段；利用简并引物从,cDNA,文库或基因组文库中获得具有一定同源性的基因片段；利用随机引物从,cDNA,文库或基因组文库中随机克隆基因。,2.,基因的体外突变,利用,PCR,技术可以随意设计包含突变序列引物在体外进行基因的嵌合、缺失、点突变等改造。,3.DNA,的微量分析,PCR,技术能快速敏感地扩增被测试的目的基因，只需微量,DNA,模板，是,DNA,微量分析的最好方法。,四、,DNA,序列分析技术,DNA,碱基序列测定即,DNA,一级结构的测定，目前常用的方法为,Maxam-Gilbert,建立的,化学裂解法,和,Sanger,建立的,双脱氧末端终止法,。,四、,DNA,序列分析技术,DNA,碱基序列测定即,DNA,一级结构的测定，目前常用的方法为,Maxam-Gilbert,建立的,化学裂解法,和,Sanger,建立的,双脱氧末端终止法,。,Sanger,在双脱氧链终止法中独创性地使用了特异引物，在,DNA,聚合酶的作用下进行延伸反应。正常的体外合成体系中，,DNA,聚合酶在引物的引导下，沿模板链,3,5,方向，利用,4,种,dNTP,聚合互补新链。如果在体系中加入,2,3,-,双脱氧核苷三磷酸（,ddNTP,），当它们掺入正在合成的新链,DNA,后，由于其缺少脱氧核糖的,3,位羟基，因而不能与后续,dNTP,形成磷酸二酯键，新链合成中断。,双脱氧末端终止法的主要操作步骤有：,1,获得待测,DNA,片段的单链模板,一般采用基因工程的方法以获取一定数量的单链待测,DNA,模板。可将待测,DNA,片段与噬菌体,M,13,DNA,进行重组，然后将其导入大肠杆菌进行增殖，,M,13,噬菌体,一般以单链,DNA,形式透出细胞再感染新的细菌，故此可获得单链,DNA,模板。,2,合成寡核苷酸引物,在待测,DNA,片段的,3-,端合成一段互补的寡核苷酸引物，其顺序可为待测,DNA,片段,3-,端的一段已知顺序，也可为一段,M,13,噬菌体的顺序。可利用,DNA,合成仪自动合成。,3,模板,-,引物杂交,将待测单链,DNA,模板与寡核苷酸引物混合，并在适当温度条件下进行保温处理，使引物与,DNA,单链模板的,3-,端进行杂交。,4,互补链的延长和终止,将上述杂交混合液分为四份，每份混合液中均加入,DNA,聚合酶，四种,dNTP,S,，一种带放射性同位素标记的脱氧核糖核酸（如,-,32,P-dATP,）。此外还需分别加入一种双脱氧核糖核酸（,ddATP,，,ddGTP,，,ddCTP,或,ddTTP,）。然后在适当温度条件下延伸互补链，就可得到四组分别以,A,、,G,、,C,、,T,、终止的长短不一的互补链的混合物。因在互补链合成时，如掺入的是双脱氧核糖核酸，由于缺乏,3-,和,2-OH,，故可导致互补链合成终止。,5,电泳分离,将四组含有长短不等的反应混合物在同一聚丙烯酰胺凝胶板上进行电泳，即可将只相差一个核苷酸的寡核苷酸链分离开。,6,放射自显影,将电泳凝胶与,X,光胶片压在一起，于低温下自显影数天，即可得到放射自显图谱，通过该图谱即可直接读出核苷酸的排列顺序。,目前,DNA,序列分析基本实现自动化，使,DNA,测序速度大大加快。人类基因组计划是在,1986,年由美国学者提出的，它的最终目的是测定总长度约,1.7,米，由近,30,亿个核苷酸组成的人基因组,DNA,全序列，它的实施将会为认识疾病的分子机制以及诊断和治疗提供重要的依据。,在人类基因组计划起步阶段，采用的还是传统,Sanger,双脱氧终止法和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行,DNA,序列分析，基本上还是手工运作。,在,20,世纪,90,年代中期对,Sanger,双脱氧终止法进行改进，采用荧光素代替放射性核素标记，被荧光标记的反应产物经毛细管电泳分离后，通过四种激光激发不同大小,DNA,片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定,DNA,碱基排列顺序。这种方法使,DNA,测序速度大大加快，也促使了人类基因组计划的提前完成。,第四节,分子生物学技术进展,一、生物芯片技术,采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（,CCD,）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。,一、生物芯片技术,相对于传统核酸,/,蛋白质印迹技术，生物芯片技术具有简便、自动化程度高、检测目的分子数量多及高通量等优点，能广泛应用于基因表达谱分析、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等，为“后基因组时代”基因功能的研究及现代医学科学研究及诊断学的发展提供了强有力的工具。根据芯片上的固定的探针不同，生物芯片包括基因芯片（也称,cDNA,微阵列）、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片等。,（一）基因芯片,包括,DNA,芯片和,cDNA,芯片，是指将许多特定的,DNA,片段或,cDNA,片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待检测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用激光共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一探针位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果，该技术亦称为,DNA,微阵列。,（一）基因芯片的应用,DNA,序列分析,；,基因表达水平的检测，其原理是基于双色荧光探针杂交系统的应用,；,基因诊断，从正常人的基因组中分离出,DNA,与,DNA,芯片杂交就可以得出标准图谱，从患者的基因组中分离出,DNA,与,DNA,芯片杂交就可以得出病变图谱,；,药物筛选,；,给药个性化,；,此外，基因芯片在新基因发现、药物基因组图、中药物种鉴定、,DNA,计算机研究等方面都有应用价值。,（二）蛋白质芯片,蛋白质芯片基本原理是将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片，利用蛋白质分子间的亲和作用，用标记了荧光素的蛋白质或其他成分与芯片结合，经漂洗将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去，再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，由此达到测定各种蛋白质功能的目的。,广泛应用于蛋白质表达谱、蛋白质功能、蛋白质相互作用的研究，在临床疾病诊断和新药开发的筛选上也有很大的应用潜力。,二、基因组学相关技术,基因组是泛指一个生命体、病毒或细胞器的全部遗传信息，在真核生物，是指一套染色体（单倍体）,DNA,。,1986,年美国科学家,Thomas Roderick,提出了概念，是指对所有基因进行基因组作图（包括遗传图谱、物理图谱、转录本图谱），核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一门科学。,因此，基因组研究应该包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学，又被称为后基因组研究。,（一）结构基因组学,结构基因组学是基因组学的一个重要组成部分和研究领域，它是一门通过基因作图、核苷酸序列分析确定基因组成、基因定位的科学，根据使用的标志和手段不同，作图有三种类型，即构建生物体基因组高分辨率的遗传图、物理图谱、序列图谱和转录本,图,：,遗传图谱，通过遗传重组所得到的基因线性排列图称为遗传,连锁图,；,物理图谱，物理图谱是利用限制性内切酶将染色体切成片段，再根据重叠序列把片段连接成染色体，确定遗传标志之间物理,距离的图谱,；,（一）结构基因组学,序列图谱，为人类基因组的全部核苷酸排列顺序。是最详细和最准确的物理图谱。,转录图谱，利用,EST,作为标记所构建的分子遗传图谱被称为转录图谱。通过从,cDNA,文库中随机调取的克隆进行测序所获得的部分,cDNA,的,5,或,3,端序列称为表达序列标签（,EST,），一般长,300,500bp,。转录图谱即为基因图谱，是编码蛋白质的序列在基因组中的位置。,（二）功能基因组学,鉴定,DNA,序列中的基因，即对基因组序列进行注释，包括鉴定和描述推测的基因、非基因序列及其功能；,同源搜索设计基因功能，通过核苷酸或氨基酸序列的同源性比较，可以推测基因组内相似功能的基因，同源基因在进化过程来自共同的祖先；,实验性设计基因功能，对基因进行缺失或剔除是采用最常用的实验方法，结合缺失或剔除后观察到的表型变化即可推测基因功能；,描述基因表达模式,：,转录组是指一个细胞内的一套,mRNA,转录产物，包含了某一环境条件、某一生命阶段、某一生理或病理状态下，生命体的细胞或组织所表达的基因种类和水平；,蛋白质组是指一个细胞内的全套蛋白质，反映了特殊阶段、环境、状态下细胞或组织在翻译水平的蛋白质表达谱。蛋白质表达模式的描述主要是通过基因转录组分析和蛋白质组分析进行的。,三、蛋白质组学相关技术,研究包括蛋白质的表达模式、结构蛋白质组学、翻译后修饰、蛋白质胞内分布及移位、蛋白质与蛋白质相互作用等方面的研究，其中蛋白质翻译后修饰的研究已成为目前蛋白质组学研究工作中的重要部分。,（一）蛋白质组的分离技术,双向凝胶电泳技术（,2-DGE,）,:,原理是第一向进行等电聚焦（,IEF,），根据蛋白质的等电点不同对蛋白质进行初次分离，蛋白质沿,pH,梯度移动至各自的等电点位置，随后再沿垂直方向按照分子量的不同进行分离，即进行,SDS-PAGE,，对蛋白质进行再次分离。,（二）蛋白质组的鉴定技术,质谱技术是目前在鉴定蛋白质的多种方法中发展最快、最具潜力的技术，具有高灵敏度、高准确度、自动化等特点。它的原理是使样品分子离子化后，根据不同离子间的质荷比（,m/z,）的差异来分离并确定其相对分子质量。,蛋白质芯片技术：主要用于蛋白质间相互作用和差异显示蛋白质组的研究，是一种在高密度的方格上含有各种微量纯化的蛋白质，并能够高通量地测定这些蛋白质的生物活性，以及蛋白质与生物大分子之间地相互作用。,蛋白质信息组学：蛋白质信息组学在蛋白质组分析中起重要作用，是蛋白质组学研究水平的标志和基础。蛋白质组数据库被认为是蛋白质组学知识的储存库，包含所有鉴定的蛋白质信息，如蛋白质的顺序、核苷酸顺序、双向凝胶电泳、三维结构、翻译后的修饰、基因组及代谢数据库等。,四、酵母双杂交技术,1989,年，,Song,和,Field,建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即,DNA,特异结合域（,BD,）与转录激活域（,AD,）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的,BD,区与,AD,结合后则特异地激活被,BD,结合的基因表达。,四、酵母双杂交技术,酵母双杂交系统由三个部分组成：,与,BD,融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称。,与,AD,融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白（,prey,）。,带有一个或多个报告基因的宿主菌株。,常用的报告基因有,HIS3,，,URA3,，,LacZ,和,ADE2,等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中,BD,来源的不同主要分为,GAL4,系统和,LexA,系统。,四、酵母双杂交技术,应用在以下几方面：,检验一对功能已知蛋白间的相互作用。,研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域。通常需对待测蛋白做点突变或缺失突变的处理。其结果若与结构生物学研究结合则可以极大地促进后者的