检验核医学：体外放射分析.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,体外放射分析,竞争放射分析,*,放射免疫分析,*放射受体分析,竞争性蛋白结合分析,非竞争放射分析,免疫放射分析,酶放射分析,放射酶促分析,*非标记免疫分析技术,放射免疫分析,（,Radioimmunoassay RIA,）,以,标记物,与,被测物,及,特异性结合试剂,发生,竞争结合反应,，从而对被测的极微量物质作,定量分析,。,RIA,的特点,：,灵敏度高 可达,10,-9,0,-15,g,特异性强,应用范围广,操作简便,标记抗原,Ag*,与特异性抗体,Ab,为有限量,Ag,增多，,Ag*-Ab,减少（竞争性抑制,),标准曲线：,以不同浓度的标准抗原进行结合反应，测定标记抗原,-,抗体复合物的结合率，以标记抗原的浓度为横坐标，结合率为纵坐标即为竞争性抑制标准曲线，通过测定未知样品的结合率，从标准曲线中即可求出抗原的含量。,二、放射免疫分析的基本试剂要求,标准品,化学结构,化学纯度,免疫活性,含量标定,运输与保存,特异结合试剂,高亲和力,K,10,8,/M,高特异性,其他 高滴度,标记物,高比活度,SA370GBq/mmol,（,10Ci/mmol,）,125,I2180Ci/mmol,3,H10Ci/mmol,生物活性与免疫活性,放射化学纯度,稳定性,三、放射免疫分析的分离方法,分离方法的基本要求,尽可能使结合与游离部分完全分开,分离效果稳定，不受外界干扰,非特异性结合尽可能小,操作简便、分离迅速、适应大量样品分析、,重复性好,分离部分适应自动化测量和数据处理,常用分离方法,双抗体法,-,免疫分离法,非特异性沉淀法,吸附分离法,固相抗体法,其他 葡萄球菌,A,蛋白沉淀法、,RIA,的基本步骤,加样,孵育,分离结合和游离部分,测放射性,cpm,数据处理,加样法,典型加样法,:,抗体、抗原及标准抗原或样品同时加样,.,顺序加样法,:,先加抗体和非标记抗原或样品，孵育一定时间后再加入标记抗原。,孵育,不同分析对象,反应达到平衡所需孵育时间和温度不同,有的随温度降低而亲和力,(KA),提高，分析灵敏度也提高，有的则温度对,KA,的影响不大。,温度降低将使达到平衡的时间延长，所以选用什么孵育温度应衡量所需的灵敏度及临床需要检验报告的缓急来选定。时间到达后转入冰浴等待分离。,分离结合和游离部分,选择适当的一种分离方法，将结合和游离部分分开。,测放射性,125,I-,抗原，通常都可直接用,NaI,闪烁计数器测量,cpm,值，,H-,抗原，往往需要将样品转化为均相。,由于各样品及标准品的测量效率相同，,RIA,通常都不必换算成,dpm,。,数据处理,将实测结果,(,放射性单位,),在标准曲线上换算成标本中待测物的量。,由于系统中有生物制剂，可变因素多，所以标准曲线应和待测样品同时测定。,测量到的结果最后需换算成待测物的量或浓度，现已有各种计算机软件供选用。,应当尽可能选用较先进的软件，使换算结果更为可靠，,RIA,的实验设计考量,对于已经选定抗体和标记抗原的系统,:,考虑合适的体积、缓冲液、孵育时间、分离方法、样品预处理方法,考虑如何选定抗体和抗原的用量，使标准曲线对多数待测样品得到满意的,精密度,。,如果多数样品含量都很低，则是如何提高零剂量的精密度亦即,灵敏度,。,四、放射免疫分析的质量控制,质控目的：,对分析误差进行经常性的检查,误差及分类,系统误差（单向性，规律性）,随机误差（双向性、统计性质）,过失误差（严重失真、无规律性）,误差来源,试剂（标准品变性、标记抗原脱标、抗体变性、分离试剂失效等）,样品（采集、制备、贮存不当）,操作,分析器具与设备,放射性测量,质控内容：,实验室内质控 实验室间质控,标准曲线的质量检查,各未知样品分析结果的可靠性检查,整批实验的精密度检验,批内漂移的检验,整批实验偏差检验,长期漂移的检验（批间质控）,质控指标,灵敏度,（,sensitivity),精密度（,precision),准确度（,accuracy),特异性（,specificity,),稳定性（,stability),临床有效性（,clinical effectiveness),灵敏度（,sensitivity,),在确定的可信限内，测定方法的最小可测量。其定义是能与零剂量（,B,0,）具有统计学差别的最小剂量,.,方法,1,“0”,剂量点结合率的均值减去其二倍标准差所对应的剂量值,.,方法,2,“0”,剂量点结合率降低,10%,后的结合率对应的剂量值为最小可测剂量,如反应参数采用,B/B0,，则应以,B/B0=90%,时对应的剂量为最小可测量,测定,10,个或,10,个以上的“零”标准管，求出各管的结合率（,B/T%,）和,10,个管结合率的均数和标准差，用均数减去两个标准差，求其相对应的浓度，即为最小检出值,。,精密度（,precision),是指同一样品重复测定的实测量的离散程度。离散程度越小，则能区别的样品量差别越小，也就是分析系统的精密度越高,.,通常以复管的变异系数,(CV),表示。,CV=,SD,/,均数,100(%),CV%10%,准确度（,accuracy),准确度是指样品的测定值偏离真值的程度,(,偏倚,Bias,),，,由于实际样品的真值是未知的，常用的估计准确度的方法是测定实际样品外加标准品的回收率。,回收率计算,如：一样品测得其的含量为,ng/ml,加入,ng,的标准，测得含量为,50.25ng/ml.,计算其回收率,回收率,(50.25-45)/5100%=105%,要求：,质控样品,(QC pools),已知含量的样品，专门为质控而制作，预先分装，妥善保存，可供多次使用。,每批实验选高、中、低含量的三个样品，与未知样品同样处理，,测定结束后计算每种含量,QC,样品的实测含量及其均值。如果没有明显偏差，则应和期望值相近，在期望值均值,2,S,D,的范围内。,如果,QC,样品测定值都向同一侧超出均值,2,S,D,的范围，则强烈提示本批实验有,系统偏差,，应当舍弃后重做。,特异性（,specificity),交叉反应的检测,干扰物质抑制结合率,50%,所需浓度与待测物本身抑制,50%,所需浓度之比即为衡量交叉反应的参数,对,cGMP,的,RIA,ATP,无抑制作用，即交叉反应极小，,cAMP,抑制结合率,50%,所需浓度为,cGMP,的,100,倍，通常就说,cAMP,对该,cGMP,抗体的交叉反应为,1:100.,可疑数据,“,去消,”,检验,如检测大鼠心肌,肾上腺素受体（正常对照）,10,例其数据为：,29.40 34.22 27.47 32.05 32.73,35.17 27.17 22.13*30.10 34.10,t=2.05,（,t2.18 p0.05,）,免疫放射分析法,I,mmunoradiometric assay,IRMA,1968:Miles&Hales,原理,过量标记抗体,与非标记抗原形成复合物，用,免疫吸附剂,(ImAd),除去多余的游离抗体，复合物的放射性与非标记抗原的量呈,正相关,。,免疫放射分析的标准曲线,线性回归法,五参数,logistic,法,一、,IRMA,的主要特点,属于非竞争性抗原抗体结合反应,抗原抗体复合物的量与所加非标记抗原的量呈正相关,在低剂量区不会有不确定因素，,RIA,则剂量低到一定程度就会有不确定因素出现，影响灵敏度,IRMA,的非特异结合对低剂量区影响大，因此对分离条件的要求特别严格。,IRMA,和,RIA,低剂量区的不确定因素示意图,.,当待测物分子数少到一定量，,RIA,可能出现,1,或,0,两种情况，也就是和零剂量无法分开，,IRMA,则没有这种情况,二、免疫放射分析的基本方法,双抗体夹心法,标记第三抗体法,生物素,亲合素系统,(biotin,avidin system,，,BAS),双抗体夹心法,ImAd-Ab,1,(,过量,)+Ag ImAd-Ab-Ag,+*Ab,2,ImAd-Ab,1,-Ag-*Ab,2,双抗体夹心法,IRMA,示意图,双抗体夹心法,（,1,）固相抗体先与抗原结合，再与标记抗体结合。,(,过剩,),（,2,）抗原先与标记抗体结合，再与固相抗体结合。,（,3,）抗原与固相抗体和标记抗体同时反应,标记第三抗体法,ImAd-Ab,1,+Ag+Ab,2,ImAd-Ab,1,-Ag-Ab,2,+*Ab,3,ImAd-Ab,1,-Ag-Ab,2,-*Ab3,标记第三抗体法,IRMA,示意图,标记第三抗体法,抗原先与两种亚型的单克隆抗体结合，再与过量的标记第三抗体结合。,生物素,125,I,亲合素标记的,IRMA,示意图,1.,被测抗原性质,抗原分子有两个以上的抗原决定簇,2.,结合在固相抗体上的抗原稳定性,在反应中,抗原有从固相抗体上分离的倾向,抗原浓度高时尤甚,故高浓度区的准确性较差,.,三、影响免疫放射分析方法的主要因素,3.,反应时间和温度,提高温度可缩短反应时间,但剂量反应曲线也会受到不同程度的抑制,4.,标记抗体浓度,增加标记抗体可缩短反应时间,扩大测量范围,但非特异性结合也随之增加从而使灵敏度会下降,.,5.,固相物的洗涤,第一次洗涤,第二次洗涤,6.,血清、电解质和其它溶质的非特异性效应,血清效应,:,指血清中的有关成份,(,如,IgM,或,2,微球蛋白能非特异性抑制抗原抗体特异性结合的效应,.,反应温度越高,血清效应越明显,.,IRMA,的主要缺点：,一个实用的,IRMA,系统必需至少有两株抗体，因此，,IRMA,的应用目前还主要限于肽类和蛋白质，很多小分子半抗原不能应用。,IRMA,反应系统对缓冲液,pH,及离子强度的要求较严格，应当更严格地加以控制,.,在某些系统中可能出现“倒钩”现象，也就是待测抗原的量很高时，复合物反而降低,.,IRMA,倒钩效应,倒钩效应,:,抗原剂量增加大一定程度时,再增加抗原,测定的复合物放射性浓度反而下降,.,五,.IRMA,与,RIA,的异同点,1,标记物,在,RIA,中核素,标记抗原,，在,IRMA,中核素,标记抗体,。,抗原有不同种类，根据其化学结构，标记时需用不同的核素和不同的方法。抗体为蛋白质，有利于碘化标记，不同抗体标记方法基本相同。标记抗体的比活度高，提高了分析的灵敏度。,2,反应速率,反应速度与反应物的浓度呈正比,.,在,IRMA,中标记抗体是过量的，而且不存在竞争性结合复杂的反应，所以反应速度较,RIA,快。,RIA,中抗体量是微量的，使用高亲和力的多克隆抗体,.,在,IRMA,中应用亲和力较低的单克隆体,3,反应模式,RIA,为竞争抑制，测得放射性的量与受检抗原呈反比。,IRMA,为非竞争结合，剂量反应曲线为正相关的关系。,4,特异性,IRMA,一般均应用针对不同位点的单克隆抗体，其交叉反应率低于应用多克隆抗体的,RIA,。,5,标准曲线,标准曲线的工作浓度,:,RIA,的工作范围为,2,3,个数量级,RIMA,可达,3,个数量级以上。,线性回归法,五参数,logistic,法,6,分析误差,RIA,中加入的抗体和标记抗原都是定量的，加样误差可严重影响测定结果。,IRMA,中标记和固相抗体在反应中都是过量的，只有受检标本的加样误差才会影响分析结果。因此，,IRMA,的批内和批间变异均比较小。,7,其它,RIA,可以测定大分子量与小分子量的物质，双位点,IRMA,只能测定在分子上具有,2,个以上抗原表位的物质。,几种非放射性标记分析技术,酶标记免疫分析法,免疫化学发光法,时间分辨荧光免疫分析法,一 、酶标记免疫分析法,原理：酶标记抗原,/,半抗原或抗体，与待测抗体或抗原反应后，酶使相应底物产生有颜色得产物。,ELIS,（,Enzyme-linkedimmunosorbent assay,）,二、免疫化学发光法,（,Immunochemiluminometric Assay ICMA,）,原理：用,化学物质,标记抗体,/,抗原，与待测抗体,/,抗原反应经适当处理后能发生化学反应，同时以光子形式释放出能量。发光强度与待测物浓度相关。,常用的化学发光物质,:,异鲁米那,N-,甲基,-,氮蒽，,三 时间分辨荧光免疫分析法,(Time-resolved Fluoimmunoassay),原理：利用,特种荧光物质为,标记,常用的特种荧光物质：,稀土金属铕（,Eu,）的络合物,蛋白质,该物质在,340nm,波长紫外线激发下发射波长为,613nm,的光子。,退激后分子不破坏，可反复激发。既有放大效应，又可保留样品供其他分析或重复测量。,思考题,放射免疫分析,(RIA),的基本原理是什么？其主要技术特点与基本试剂要求是什么？,RIA,的主要质控指标和意义是什么？,IRMA,与,RIA,的原理有何不同？,IRMA,的技术特点有哪些？,