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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Click to edit title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2004 McGraw-Hill Ryerson Ltd.,14-,*,Click to edit Master title style,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2004 McGraw-Hill Ryerson Ltd.,14-,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2004 McGraw-Hill Ryerson Ltd.,14-,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,Allison Anne Welder,Ph.D.,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,Click to edit title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Click to edit title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2004 McGraw-Hill Ryerson Ltd.,14-,*,Click to edit Master title style,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2004 McGraw-Hill Ryerson Ltd.,14-,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2004 McGraw-Hill Ryerson Ltd.,14-,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,Allison Anne Welder,Ph.D.,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,Click to edit title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验三:,PCR,扩增检测乙肝病毒,乙肝病毒(,HBV,)感染引起的乙型肝炎,我国发病率很高,,HBV,的检测极其重要。,HBV DNA,存在就可以引起乙肝的传染,乙肝病毒基因是乙肝病毒的核心成分,是病毒复制的发动机。,PCR,技术可以检测出极微量的病毒,是判断其传染性最直接、最可靠的证据。,PCR,技术已成为公认的对病毒性肝炎的诊断、疗效观察及预防研究工作最理想的方法之一。,一、实验目的,1.,掌握,PCR,技术扩增的原理,2.,熟悉,PCR,扩增检测乙肝病毒的基本操作过程。,二、实验原理,聚合酶链反应,(Polymerase Chain R,eaction),简称,PCR,是在体外条件下利用,DNA,聚合酶、催化一对引物间的特异性,DNA,片段合成的基因体外扩增技术,它包括三个基本过程:,1.,变性:加热使双链,DNA,变为单链,2.,退火:急速降温使引物和互补模板,在局部形成杂交链,3.,延伸:耐热,DNA,聚合酶按,5,3,方向催化以引物为起始点的,延伸反应,模板,DNA,高温变性,低温退火,引物,适温延伸,经过,25-35,次循环后,目的片段扩增,2,n,倍,两条子代,DNA,一,次,循,环,Tap,酶,5,3,3,5,3,5,5,3,5,3,三、主要器材及试剂,1.,主要器材:,9700,型,PCR,仪,电泳槽、电泳仪,紫外分析仪,台式高速离心机,2.,主要,试剂,:,HBV-PCR,定性检测试剂盒,PCR,反应管,HBV,阳性标本,DNA,提取液,四、操作步骤,1.,标本处理:取患者血清,40,l,,加入,DNA,提取液,40,l,,沸水浴,10,分钟,,10000,转离心,5,分钟,取上清液,4,l,做,PCR,反应。,2.,加样:,加入提取好的标本,4,l,,,6000,转离心,10,秒。,取试剂盒中,PCR,反应管,TapDNA,聚合酶,10,扩增缓冲液,4,种,dNTP,混合物,引 物,(,小分子,DNA,片段,),Mg2+,三个,扩增步骤温度及时间,温度 时间,变性,93 45,(首次,5,),退火,55 45,延伸,72 60,(末次,5,),循环次数:,25,次,3.PCR,仪上扩增:,PCR,仪上扩增,加入标本,离心,6000,转离心,10,秒,4.,电泳检测:,制备,2%,琼脂糖凝胶,2%,琼脂糖的制备:,电泳槽的准备:,称取,0.8g,琼,脂糖,40mlTBE,电泳缓冲液,(,PH8.0),煮沸溶解,加入,冷却,60,左右,加入,溴乙啶,EB20,l,倒胶,加样:取扩增后的产物,10 ul,点样于凝胶孔,取样,点样,电泳:点样端接“,-”,,稳压,,50V,,电泳,30,分钟。,五、结果观察:紫外分析仪下观察,出现橙黄色条带则为,HBV,阳性,HBV,阳性,HBV,阴性,HBV,阳性对照,HBV,阴性对照,正极,负极,点样孔,五、注意事项,1.,试剂盒内阳性标本及,DNA,提取液使用前需充分融化离心。,2.,反应液的表面为固体封盖剂,电泳取样时从反应管底部吸液。,3.EB,为强致癌物,操作过程应注意防护。,4.,注意无菌操作,以免出现假阳性。,Thank you!,
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