第四章基因工程的主要技术及其原理.pptx

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1TAE,电泳缓冲液中,摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。(冷却到,60,加入,100l,得,0、5mg/ml EB,并摇匀。),用胶带将制胶板两端封好,插入适当梳子,将溶解得琼脂糖(约,50,)倒入,室温冷却凝固,充分凝固后撕掉两端得胶布,将凝胶置入电泳槽中,加,1TAE,电泳缓冲液至液面覆盖凝胶,1-2mm,小心垂直向上拔出梳子。,(4),用移液器吸取总,DNA,或质粒样品,4l,于点样板上,再加入上样缓冲液,loading buffer,混匀后,小心加入点样孔。,打开电源开关,调节电压至,3-5V/cm,可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动,电泳约,30min-60min,。,将凝胶放入,EB,染液中染色,5-10min,用清水稍微漂洗。,将染色后得凝胶置于紫外透射检测仪上,盖上防护观察罩,打开紫外灯,可见到发出荧光得,DNA,条带。,实验步骤,结果与分析,图,2,基因组,DNA1%,琼脂凝胶电泳图,结果与分析,图,2,PCR,产物琼脂凝胶电泳图,(1,、,2,、,3,、,4,为,PCR,产物,M,为,DL2000Marker),琼脂糖凝胶电泳装置,实验步骤,制 胶,90,以上熔化,凝胶温度,35-43,EB,1,2,3,1,、孔深,2,、预留尺寸,3,、梳子宽度,1+2=,胶得厚度,3,大家学习辛苦了，还是要坚持,继续保持安静,-,+,加缓冲液,拔梳子,最好在电泳槽中,-,+,点 样,-,+,电 泳,紫外,电泳结果分析,DNA,空间结构,电压,EB,脉冲电场(,PFGE,)解决大分子,DNA,电泳问题,Blotting,定义:,印迹法(,blotting,)就是指将样品转移到固相载体上,而后利用相应得探测反应来检测样品得一种方法。,1975,年,Southern,建立了将,DNA,转移到硝酸纤维素膜(,NC,膜)上,并利用,DNA,RNA,或者,DNA-DNA,杂交检测特定得,DNA,片段得方法,称为,Southern,印迹法。,而后人们用类似得方法,对,RNA,与蛋白质进行印迹分析,对,RNA,得印迹分析称为,Northern,印迹法,对单向电泳后得蛋白质分子得印迹分析称为,Western,印迹法,对双向电泳后蛋白质分子得印迹分析称为,Eastern,印迹法,(1)Southern,印迹杂交法,限制性内切酶酶切,检测杂交信号,提取,DNA,Southern,法可用于检测特异得,DNA,序列片段,进行基因定位、分子量测定等。,Southern Blot Part I:Gel electrophoresis followed by transfer to a membrane,DNA Cleaved with a restriction enzyme,Smear of restriction fragments,80,度烘烤,1-2h,Southern Blot Part II:Hgybridization of DNA on membrane to specific probe,DNA stained with ethidium bromide,autoradiograph of hybridized membrane,Southern Blot,Northern Blot probed with,b,-globin,Undifferentiated,cells,+differentiation factor,Note:Make northern just like a Southern,except run out RNA samples rather than DNA,Measures the,steady-state,level of mRNA transcript from a given gene,Smear of RNA transcripts,核酸杂交技术就是目前研究核酸结构、功能常用手段之一,不仅可用来检验核酸得缺失、插入,还可用来考察不同生物种类在核酸分子中得共同序列与不同序列以确定它们在进化中得关系,其主要应用如下图所示:,核酸杂交及其应用示意图,、,变性、复性与杂交。粗细线分别代表不同,DNA,。,A,就是杂化双链,、,突变体得鉴别。,B,代表天然,DNA,;,C,就是,B,得缺失突变体;虚线框内就是已缺失得部分;,D,就是显示从天然,DNA,链鼓出小泡,、,粗线代表探针,粗线上得,X,表示放射性标记,在核酸杂交得基础上发展起来得一种用于研究与诊断得非常有用得技术称探针技术,(Probe),。,探针技术在遗传性疾病诊断上已开始应用。,例如诊断地中海贫血或血红蛋白病,可以由已确诊得病人白细胞中提取,DNA,这就就是诊断探针。用诊断探针检查,不但可以对有症状患者进行确诊,还可以发现一些没有症状得隐性遗传性疾病。如从胎儿得羊水可以提取到少量,DNA,后,再用探针技术对此进行产前诊断各种遗传性疾病已在临床上开展。,杂交与探针技术就是许多分子生物学技术得基础,在生物学与医学得研究中,以及临床诊断中得到了日益广泛得应用。,Western blot,实验技术,Making a probe,Use the known amino acid sequence of a protein,Synthesise a short DNA sequence,in vitro,AA:phe met trp glu cys asn,Codons:,UU,U,C,AUG UGG GA,A,G,UG,U,C,AA,U,C,Probe:,AA,A,G,TAC ACC CT,T,C,AC,A,G,TT,A,G,-P,32,A short sequence of a protein is used to design a set of,oligonucleotides for use as a probe to recover the gene that encoded,the protein、One of the probe sequence will be a perfect match for the,gene,Western Blot,基本原理,在电场得作用下将电泳分离得多肽从凝胶转移至一种固相支持体,然后用这种多肽得特异抗体来检测。,Western Blot,一般流程,蛋白样品得制备,SDS,聚丙烯酰胺,凝胶电泳,转膜,封闭,一抗杂交,二抗杂交,底物显色,通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白,水溶液提取法,针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中得蛋白质。稀盐与缓冲系统得水溶液,对蛋白质稳定性好、溶解度大、就是提取蛋白质最常用得溶剂。,细胞裂解液,:,50 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L Nacl,5 mmol/L EDTA,1%NP40,0、05%PMSF,2g/mL Aprotinin,0、5g/mL Leupeptin,pH8、0,有机溶剂提取法,对于分子中非极性侧链较多得蛋白质可用有机溶剂提取,包括乙醇、,丙酮与丁醇等。,通过层析或电洗脱法制备目得蛋白,蛋白样品得制备,蛋白样品得定量,Bradford,法,考马斯亮蓝,G-250,有红、蓝两种不同颜色得形式,在一定浓度得乙醇与酸性条件下,可配成淡红色得溶液,与蛋白结合后形成蓝色化合物,该化合物在,595nm,处有最大吸收值,化合物颜色深浅与蛋白得浓度高低成正比。,(,上样量,),试剂:考马斯亮蓝工作液,0、1N,盐酸,双蒸水,蛋白标准液(将,10mg/ml,蛋白溶液稀释至,4、0mg/ml,3、5mg/ml,3、0mg/ml,2、5mg/ml,2、0mg/ml,1、5mg/ml,1、0mg/ml,0、5mg/ml,。),管号,0,1,2,3,4,5,6,7,8,ddH2O,80,70,70,70,70,70,70,70,70,蛋白标准液,0,10,10,10,10,10,10,10,10,样品,10,10,10,10,10,10,10,10,10,HCL,10,10,10,10,10,10,10,10,10,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,原理,:,SDS,就是一种离子性得界面活性剂,它有强离子性得硫酸根离子也带有疏水,性得长碳链,、,当,SDS,与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺,基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用,、,大多数蛋,白质与,SDS,得平均结合量就是,1:1、4(,以重量为单位,),而蛋白质结合固定,比例之,SDS,後,由於,SDS,带强负价,使蛋白质原先得带电价微不足道,且,每单位重量之蛋白质带电价一致,(charge density),所以决定不同蛋白得泳动速率就只剩下分子大小一项因素,丙烯酰胺与,N,N-,亚甲双丙烯酰胺,SDS,配胶得,Tris,缓冲液,TEMED,过硫酸铵,(,时间,),Tris-,甘氨酸电泳缓冲液,凝胶成份,凝胶浓度与蛋白分离范围,凝胶浓度(),线性分离范围(,KD),15,12-43,10,16-68,7、5,36-94,5、0,57-212,转膜,膜的选择,尼龙膜,硝酸纤,维素膜,封闭非特异性抗体结合麻烦,简单快速封闭非特异性抗体结合,价格昂贵,价格便宜,特殊要求下的选择,需要更高的蛋白结合率,（尼龙膜：,480g/cm,2,；硝酸纤维素膜：,80g/cm,2,）,目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱,需要更大的机械强度,转膜,半干法,将凝胶与固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿,润滤纸之间,电转,10,30min,。,湿法,将凝胶与固相基质夹在滤纸中间,浸泡在转移装,置得缓冲液中,电转,45min,或过夜。,转膜后检测,丽春红,S,染色,蛋白带出现后,于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤,膜,换水几次。,印度墨汁染色,只用于放射性标记抗体或放射性标记,A,蛋白探针得,Western,印迹过程。,封闭,脱脂奶粉(,5,),BSA,Western Blot,膜封闭液(生物试剂公司提供),一抗、二抗孵育,把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中,根据滤膜面积以,0、1ml/cm2,得量加入加入一抗溶液与滤膜温育。,37,一小时,4,过夜。,倒掉一抗溶液,用,PBS,漂洗液滤膜,3,次,每次,10min,。,加入用封闭液配制得二抗,摇床上缓慢摇动,37,一小时,4,过夜。,倒掉一抗溶液,用,PBS,漂洗液滤膜,3,次,每次,10min,。,二抗与底物反应显色,辣根过氧化物酶法(,HRP,),碱性磷酸酶法(,AP,),化学发光显色法,(,HRP,),Western Blot,常见问题分析,SDS-PAGE,电泳,胶不平？,凝胶漏液？,胶板洗刷干净,加入,APS,与,TEMED,得量要合适,加入试剂后摇匀,使其充分混合,防止部分胶块聚合不均匀,温度合适,受热不均匀导致胶聚合不均匀,两块玻璃板底部要对齐,条带比正常得窄？,“,微笑,”,或,“,倒微笑,”,条带？,凝胶聚合不均匀,灌胶时候尽量混合均匀,动作轻缓,拔梳子要迅速,清洗加样孔要小心,以免把上样带扭曲,样品盐浓度过高会挤压其她条带导致宽窄不一,纯化样品,调整盐浓度,胶板底部有气泡会影响电泳效果,应赶走气泡。同时注意电泳槽装置就是否合适,转膜及抗体检测,凝胶肿胀或卷曲？,条带歪斜或漂移？,单个或多个白点？,转膜缓冲液过热,？,可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡,5-10min,电转仪长期使用导致海绵变薄,“,三明治,”,结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通得草纸,确保膜与胶块之间没有气泡,缓冲液中离子浓度太低,电流或电压太高。转膜过程注意降温,背景太高,膜没有均匀浸湿,膜或者缓冲液污染,封闭不充分,抗体与封闭剂出现交叉反应,抗体浓度过高,原原因,对,策,转膜前用,100%,甲醇将膜完全浸湿,拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液,检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应,杂交前检测一抗、二抗的工作浓度,Western blot is similar in concept to northern,except use polyacrylamide and run out proteins,Southern,Northern,and,Western analyses,免疫化学检测法,Using antibodies to detect a clone,重组体得转化,利用物理方法导入、转化,1、,质粒得,Ca2+,诱导转化,(,E、coli,),2、,质粒得原生质体转化,3、,质粒得高压电穿孔法转化,4、,显微注射法转化,利用生物方法导入、转染,1、,细胞噬菌体,DNA,得转染,2、,动物病毒,DNA,得转染,3、,植物病毒,DNA,得转染,大肠杆菌感受态细胞得制备,在不含抗生素得,LB,平板上涂布大肠杆菌,DH,5,于,37,培养过夜,(16-20h),;,挑一个单菌落接种于,25mL,无菌得,LB,培养液中,37,中速震荡培养,3h,;,将上述菌液在冰浴,5,分钟,然后在,4,4000rpm,离心,10,分钟,;,将细菌沉淀用,5mL,预冷得,CaCl,2,(,0、1M,)重悬,冰浴一会后于,4 4000rpm,离心,10,分钟;,将细菌沉淀用,1mL,预冷得,CaCl2,(,0、1M,)重悬,取,200uL,用于细菌转化,其余菌液加入,20%,得无菌甘油,摇匀后于,-20,保存备用,;,感受态细胞得转化,(1)取2L连接产物,加入80L感受态细胞,混匀,冰上放置30min。,(2)将反应管快速转移42水浴中,热击90s。,(3)将反应管快速转移至冰上2min,(4)加入500-800 L LB液体培养基。,(5)37,150 rpm复苏1、5 h。,(6)取100L菌液涂布于LB固体培养基上(含100g/mL得Amp),(7)37下培养16-24 h。,Transforming,E、coli,with rebinant DNA,Growth of Bacteria,PCR,技术及其应用,目 录,PCR,得概念,PCR,技术得创建,PCR,得原理,PCR,得反应体系与方法,PCR,得类型与应用,多聚酶链式反应,(,PCR,:,Polymerase Chain Reaction),Polymerase:DNA,聚合酶,基因组,DNA,引物,DNA,聚合酶,DNA,片段体外扩增,PCR,技术得创建,Kary B、Mullis,(穆利斯(美),Khorana(1971),等提出在体外经,DNA,变性,与适当引物杂交,再用,DNA,聚合酶延伸,克隆,DNA,得设想。,1983,年,Mullis,发明了,PCR,技术,使,Khorana,得设想得到实现。,1988,年,Saiki,等将耐热,DNA,聚合酶(,Taq,)引入了,PCR,技术,1989,年美国,Science,杂志列,PCR,为十余项重大科学发明之首,比喻,1989,年为,PCR,爆炸年,Mullis,荣获,1993,年度诺贝尔化学奖。,PCR,技术简史,PCR,的最早设想：,本世纪,60,年代末、,70,年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，,Korana,于,1971,年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过,DNA,变性，与合适的引物杂交，用,DNA,聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆,tRNA,基因”。,PCR,技术,PCR,技术简史,DNA,得复制,核酸体外扩增得设想,聚合酶链反应得发明,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,5,3,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,3,5,解旋酶,解链酶,DNA,解旋解链,合成引物,子链延长,PCR,技术,PCR,技术简史,DNA,得复制,核酸体外扩增得设想,聚合酶链反应得发明,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,5,3,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,3,5,DNA,解旋解链,合成引物,子链延长,GGAUCG,5,AUCGCG,5,引物酶,引物酶,RNA,引物,RNA,引物,PCR,技术,PCR,技术简史,DNA,得复制,核酸体外扩增得设想,聚合酶链反应得发明,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,5,3,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,3,5,DNA,解旋解链,合成引物,子链延长,GGAUCG,5,AUCGCG,5,TAGCGCTATCGCATCGACGCT,3,ATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,3,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,PCR,技术,PCR,技术简史,PCR,得改进与完善:,Mullis,最初使用得,DNA,聚合酶就是大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,得一个片段,其缺点就是:,此酶不耐高温,90,会变性失活,每次循环都要重新加。,PCR,技术,其,PCR,产物特异性较差,合成得,DNA,片段不均一。,引物链延伸反应在,37,下进行,容易发生模板与引物之间得碱基错配,此种酶催化得,PCR,技术虽较传统得基因扩增具备许多突出得优点,但由于酶不耐热,在,DNA,模板进行热变性时,会导致此酶钝化,每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期,给,PCR,技术操作程序添了不少困难。这使得,PCR,技术在一段时间内没能引生物医学界得足够重视。,PCR,技术,PCR,技术简史,94,55,37,PCR,技术简史,1988,年初,Keohanog,改用,T4 DNA,聚合酶进行,PCR,其扩增得,DNA,片段很均一,真实性也较高,只有所期望得一种,DNA,片段。但每循环一次,仍需加入新酶。,PCR,技术,Taq DNA,聚合酶得特点:,耐高温,在,70,下反应,2h,后其残留活性大于原来得,90%,在,93,下反应,2h,后其残留活性就是原来得,60%,在,95,下反应,2h,后其残留活性就是原来得,40%,。,在热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶。,大大提高了扩增片段特异性与扩增效率,增加了扩增长度,(2、0Kb),。由于提高了扩增得特异性与效率,因而其灵敏性也大大提高。,PCR,技术,PCR,技术简史,Taq,DNA,聚合酶(,thermus aquaticus),酶活性,(%),温度,(,),40 50 60 70 80 90 100,100,80,60,40,20,1988,年,Saiki,等将耐热,DNA,聚合酶(,Taq,)引入了,PCR,技术,72,94,55,PCR,循环,PCR,技术得原理,1 PCR,技术得基本原理,无细胞分子克隆法:在微量离心管中,加入适量得缓冲液,微量得模板,DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成,DNA,得引物,通过高温变性、低温退火与中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段得基因拷贝数放大一倍,一般样品就是经过,30,次循环,最终使基因放大了数百万倍,;,扩增了特异区段得,DNA,带,。,加热,变 性,复性,复温,DNA,得变性与复性,加热或强酸、碱性作用可以使,DNA,双螺旋得氢键断裂,双链解离,形成单链,DNA,这称为,DNA,得变性。,解除变性得条件后,变性得单链可以重新结合起来,形成双链,其原有得特性与活性可以恢复,这称,DNA,复性,也叫退火。,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,得基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（）,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复,1,3,步,25,30,轮,目得,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,单链,与引物复性,DNA,变性,形成,2,条单链,子链延伸,DNA,加倍,PCR,技术,PCR,得基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,得特点,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（）,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复,1,3,步,25,30,轮,目的,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,单链,与引物复性,子链延伸,DNA,加倍,DNA,变性,形成,2,条单链,模板,DNA,95,PCR,技术,复习,PCR,得基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,得特点,95,50,引物,1,引物,2,DNA,引物,PCR,技术,PCR,得基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,得特点,50,引物,1,引物,2,DNA,引物,72,Taq,酶,Taq,酶,PCR,技术,PCR,得基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,得特点,72,第,1,轮结束,95,第,2,轮开始,PCR,技术,PCR,得基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,得特点,95,50,72,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR,技术,PCR,得基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,得特点,72,第,2,轮结束,PCR,技术,PCR,得基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,得特点,重复,30,轮后,2,30,=1,073,741,824,模板,DNA,第,1,轮扩增,第,2,轮扩增,第,3,轮扩增,第,4,轮扩增,第,5,轮扩增,第,6,轮扩增,PCR,技术,2 PCR,技术得特点,1,)高度得灵敏性,30,轮循环,扩增量达,2,30,个拷贝(,10,9,拷贝),PCR,产物每轮循环增加一倍,2,)特异性,引物,引物,引物得序列及其与模板结合得特异性就是决定,PCR,反应结果得关键。,引物设计得最大原则就是最大限度地提高扩增效率与特异性;同时尽可能减少非特异性扩增。,引物设计:,(,1),序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。,(,2,)引物长度以,15-40 bp,为宜。,(,3,),碱基尽可能随机分布,G+C,占,50-60%,。,(4)引物内部避免形成二级结构。,(5)两引物间避免有互补序列。,(6)引物3,端为关键碱基;5,端无严格限制。,3,)操作简便易行,PCR,扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出,1g,基因组,DNA,中仅含数个拷贝得模板序列。,通常得,DNA,扩增法就是分子克隆法,首先要构建含有目得得基因得载体,然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选,;,这种方法,要经过,DNA,内切、连接、转化与培养等相关得过程,操作复杂,一般需要数周时间。,目得基因,载体,复制子,宿主细胞,扩增,扩增,提取,DNA,分子,4,)用途广泛,生命学科,医学工程,遗传工程,疾病诊断,法医学,考古学,PCR,得反应体系与方法,PCR,管加热使模板变性,退火使引物与模板,DNA,互补,延伸需将反应温度升至中温,(72),在,Tap,多聚酶得作用下,以,dNTP,为原料,以引物为复制得起点,合成新链。,如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火与中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段得基因拷贝数放大一倍,一般样品就是经过,30,次循环,最终使基因放大了数百万倍,;,将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段得,DNA,带。,1,反应体系,标准的,PCR,反应体系,4,种,dNTP,混合物 各,200umol/L,引物 各,10,100pmol,模板,DNA,0,.,1,2ug,Taq DNA,聚合酶,2,.,5u,Buffer,（,Mg,2+,）,1,.,5mmol/L,PCR,技术,PCR,技术得基本过程,(1),模板,DNA,dNTP,引物,Buffer,预变性,模板,DNA,dNTP,引物,Buffer,TaqDNA,聚合酶,94,o,C5,2,基本过程,PCR,技术得基本过程,(2),Taq,酶,模板,DNA,dNTP,引物,Buffer,循环仪,94,55,72,Taq,酶,模板,DNA,dNTP,引物,Buffer,72 5,7 min,循环,25,35,次,琼脂糖凝胶电泳,PCR,技术得基本过程,(3),1,),PCR,反应成分,(,1,),模板,单、双链,DNA,均可。,不能混有蛋白酶、核酸酶、,DNA,聚合酶抑制剂、,DNA,结合蛋白类。,一般,100ng DNA,模板,/100,L,。,模板浓度过高会导致反应得非特异性增加。,3 PCR,反应条件,(,2,)引物浓度,0、1-0、5,mol/L,浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。,(,3,),Taq,DNA,聚合酶(,thermus aquaticus),0、5-2、5 U/50,l,酶量增加使反应特异性下降,;,酶量过少影响反应产量。,(,4,),dNTP,dNTP,浓度取决于扩增片段得长度,四种,dNTP,浓度应相等,浓度过高易产生错误碱基得掺入,浓度过低则降低反应产量,dNTP,可与,Mg,2+,结合,使游离得,Mg,2+,浓度下降,影响,DNA,聚合酶得活性。,(,5,),Mg,2+,Mg,2+,就是,DNA,聚合酶得激活剂。,0、5mmol/L-2、5mmol/L,反应体系。,Mg,2+,浓度过低会使,Taq,酶活性丧失、,PCR,产量下降;,Mg,2+,过高影响反应特异性。,Mg,2+,可与负离子结合,所以反应体系中,dNTP,、,EDTA,等得浓度影响反应中游离得,Mg,2+,浓度。,2,)循环参数,变性,使双链,DNA,解链为单链,94,o,C 20-30,秒,(2),退火,温度由引物长度与,GC,含量决定。,增加温度能减少引物与模板得非特异性结合,;,降低温度可增加反应得灵敏性。,(,3,)延伸,70-75,一般为,72,延伸时间由扩增片段长度决定,(,4,)循环次数,主要取决于模版,DNA,得浓度,一般为,25-35,次,次数过多:扩增效率降低,错误掺入率增加,经典循环参数(,500bp,以内),94 30s,55 45s,72 1min,94 5min,30,次,72 7min,42 forever,1,)不对称,PCR,目得:扩增产生特异长度得单链,DNA,。,方法:采用两种不同浓度得引物。分别称为限制性引物与非限制性引物,其最佳比例一般就是,0、010、5M,关键就是限制性引物得绝对量。,用途:制备核酸序列测定得模板,制备杂交探针,基因组,DNA,结构功能得研究,PCR,得类型,高浓度引物,低浓度引物,2),反向,PCR,(reverse PCR),就是用反向得互补引物来扩增两引物以外得,DNA,片段对某个已知,DNA,片段两侧得未知序列进行扩增。,可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知,DNA,片段得序列;用于仅知部分序列得全长,cDNA,得克隆,扩增基因文库得插入,DNA,;建立基因组步移文库。,已知序列,未知序列,未知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,3,)多重,PCR,(复合,PCR,),用于检测特定基因序列得存在或缺失。,电泳,引物,1,2,3,4,1,2,3,4,DMD,:人类肌营养不良基因,A,:无外显子,8,12,17,19,对应条带,说明病人外显子,8,19,缺失,B,:病人,A,中未扩增外显子带得强度为,C,得一半,提示为区域缺失携带者,C,:正常人,DMD,基因外显子得一般扩增形式,多重,PCR,检测,DMD,基因缺失,4,),LP-PCR,(,Labelled primers),利用同位素、荧光素等对引物进行标记,用以直观地检测目得基因。,特别适合大量临床标本得基因诊断,可同时检测多种基因成分,病毒,1,病毒,2,病毒,3,病毒,4,标记引物,观察,PCR,产物,5,),PCR,固相分析法,模板,生物素化引物,PCR,扩增,探针,亲和固相介质,检测探针信号,可用于基因芯片得制作,6,),逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR,扩增,基因,mRNA,蛋白质多肽链,7),荧光定量,PCR,(,real-time PCR),通过荧光染料或荧光标记得特异性得探针,对,PCR,产物进行标 记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应得软件可以对结果进行分析,计算待测样品得初始模板量。,荧光定量,PCR,仪,光定量,PCR,仪就是一种带有激发光源与荧光信号检测系统得,PCR,仪,通常配有电脑系统及相应得分析软件。,荧光定量实时,PCR,与普通,PCR,得比较,实时在线监控,对样品扩增得整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产物得增加,直观地瞧到反应得对数期,降低反应得非特异性,使用引物与荧光探针同时与模板特异性结合,提高了,PCR,反应,得特异性,增加定量得精确性,全程监控,准确得算法进行定量,结果分析更加快捷方便,无需跑胶,全新,4,通道实时荧光定量,PCR,仪,普通梯度,PCR,仪,PCR,技术得应用,1),基因克隆,重组,DNA,质粒,DNA,基因片段,大肠杆菌,胰岛素,重组体,+,胰岛素,基因,基因工程产品,5,5,Bam H I,Bam H I,Bam H I,Bam H I,GTCC,GGAC,CCTG,CAGG,GTCC,GGAC,CCTG,CAGG,CCTG,GGAC,GTCC,CAGG,质粒,DNA,目的基因,限制性核酸内切酶,2),基因检测,A,内源性病变基因,正常人,A,病 人,病原微生物基因,正常人,(-),病 人,(+),遗传病得诊断,基因缺失、插入或置换等,地中海贫血,珠蛋白链合成不平衡,A,正常人,病 人,正常,病人,ASO,探针法,A,C,T,G,ASO,探针,正常,病人,PCR-ASO,检测基因点突变,:,主就是利用,PCR,技术扩增靶基因得适当片段,然后用人工合成得含突变位点得标记寡核苷酸探针杂交,探针杂交,NC,膜,探针,正常人,突变纯合子,突变杂合子,PCR-RFLP,法:,限制性内切酶,恶性肿瘤(癌基因或抑癌基因),Ras,基因,突变,限制性内切酶,正常,突变,电泳,HLA,系统基因分型,PCR-RFLP,法,PCR-SSO,法,PCR-SSCP,PCR-SSP,3),基因配型,PCR-SSP,1 2 3 4 5 6 7 8,PCR,1 2 3 4 5 6 7 8,引物特异性,(序列特异性引物,-PCR,技术),