第一章-植物基因的结构及其表达调.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一章 植物基因的结构及其表达调控,自从孟德尔用不同表型的豌豆品种进行杂交试验以探探讨生物的遗传规律以来，一部遗传学的发展史反映了人类对基因不断深化认识的过程。特别在分子遗传学诞生以后，有关基因的结构、突变、表达、调节与克隆等方面的研究取得很大的进展。这不但帮助生物学各分支学科找到了深化自己研究问题的思路，同时也为解决医药与农业上的许多难题提供了新的技术与途径。但是目前对基因仍有许多不够了解的地方，还有许多基因尚未被克隆。这有待不同学科研究者的共同努力来完成。下面就近年有关植物中编码蛋白质的核基因的结构，以及表达调控方面的一些进展作一简单的介绍。,第一章 植物基因的结构及其表达调控,1.,基因的结构,1.1 5,上游区,1.2 5,非翻译区,1.3,编码区,1.4 3,非翻译区,2.,基因的表达调控,2.1,器官与组织专一性表达的基因,2.2,受环境因素诱导而表达的基因,2.3,基因表达的调节机理,1.,基因的结构,1.1,5,上游区,1.2,5,非翻译区,1.3,编码区,1.4,3,非翻译区,克隆植物中核基因的方法,在研究一个基因的结构之前，先要克隆到这个基因。目前常用来克隆植物中编码蛋白质的核基因的方法大致有以下几种：,根据蛋白质中所测出的部分氨基酸顺序，合成一段与之相对应的由三联密码组成的寡核苷酸，以此寡核苷酸为探针，从该植物的基因组文库与,cDNA,文库中分别钓出编码此蛋白质的基因与,cDNA,克隆。,根据蛋白质中所测出的氨基酸顺序，合成一对或数对用于聚合酶链式反应,(PCR),的引物，以植物总,DNA,为模板，扩增或分段扩增出所要克隆的基因或基因片段、再以此,DNA,片段为探针，从基因组文库与,cDNA,文库中分别钓出编码此蛋白的基因与,cDNA,克隆。,克隆植物中核基因的方法,克隆植物中核基因的方法,如果基因的产物不明确或蛋白质不易提纯而无法测序，但是知道该基因突变后所出现的表型改变，则可用转座子标签法来分离基因，该法是利用转座子在染色体上能够移动的特性，分离出由于转座因子插入而造成该基因表型改变的突变株，构建突变株的基因组文库，以转座子作探针，从文库中钓出能与转座子探针杂交的阳性克隆。然后以该克隆中转座子的旁邻顺序为探针，从野生型植物的基因组文库中钓出杂交阳性的克隆，这就有可能得到所要克隆的基因。也有用农杆菌中的,T,DNA,作插入突变来克隆基因的，原理相同。,克隆植物中核基因的方法,现在已有许多植物如水稻、番茄与拟南芥等的限制片段长度多态性图谱,RFLP,）被建立，因此可利用这种图谱，通过共分离分析找出与所要克隆基因有紧密连锁关系的分子标记，然后利用染色体步行或染色体着陆,(chromosome landing),策略，找到所要克隆的基因。,克隆植物中核基因的方法,如果有该基因的突变株或该基因受某种因素诱导表达，则可利用,mRNA,的差异显示法或减法克隆策略找到所要克隆的基因。,除以上几种方法外，也有人用其他生物中已被克隆的同源基因的顺序作探针或据此合成引物，从所研究的植物中克隆出同源的基因。在克隆到基因与,cDNA,后，即可对它们进行测序，并将基因的全顺序与相应的,cDNA,顺序作比较，就可以初步了解该基因结构的概况，如基因转录起始点的位置，内含子的数目、位置及其长度，终止密码子与加,po1yA,信号的位置等。通过基因的,cDNA,克隆在细菌细胞中的高表达，以纯化出它所编码的蛋白质，在测出该蛋白质氨基端的部分氨基酸顺序后，即可确定基因的翻译起始密码子，并推测出基因所编码蛋白质中的氨基酸顺序与蛋白质的相对分子质量,Mr,。,近年来，很多科学家对植物基因的结构进行了研究，结果表明它们与其他真核基因的结构很相似。下面将他们对植物基因中,4,个区域结构的研究结果简述如下：,回,1,之目录,1.1 5,上游区,这是指基因转录起始点,5,端上游包括启动子在内的一段很长的区域，其中包含着与基因转录起始与表达调控有关的许多元件。这个区域在结构上有以下几点值得注意。,（,1,）转录起始位点,（,2,）,TATA box,、,CAAT box,（,3,）顺式作用元件,（,1,）转录起始位点,Joshi,曾比较了,79,个高等植物基因启动区的,DNA,顺序，推衍出在基因转录起始点附近的一致顺序,(consensus sequence),是,CTCA,TCA,。当中的一个,A,是转录起始的核苷酸，一般都将此核苷酸编号为,+1,位。转录本中的核苷酸位置均以正数表示，而,A,的,5,上游区非转录核苷酸则以负数表示，,A,的两边通常是嘧啶核苷酸。,（,2,）,TATA box,、,CAAT box,Joshi,的总结中还指出，在转录起始点上游,32,7,核苷酸对,(bp,),处有一段一致顺序,TCACTATATAG,，简称为,TATA box,，这些顺序对,RNA,聚合酶,准确地使基因起始转录是必需的。在,TATA box,上游,-75bp,附近常有一致顺序,GC(T,C)CAATCT,，简称,CAAT box,这些顺序有增强基因特录的作用。在有些植物基因中没有明显的,TATA box,，在另一些植物基团中，,AGGA box,替代了,CAAT box,（,3,）顺式作用元件,在,5,端远上游区域中还存在对基因的表达有增强或阻遏作用的顺序、决定基因在特定时空表达的顺序以及对激素或外界胁迫有应答作用的顺序，由于这些顺序对基因表达起调控作用，因此统称为调控元件，又由于它们与基因位于同一条,DNA,链上，故又称顺式作用元件,(cis,acting element),。有些研究论文中提到的启动子有时也指包括了这些元件在内的很长一段区域,1.2 5,非翻译区,基因的转录起始位点到翻译起始密码子之间的一段顺序被称为,5,非翻译区。该区的,5,端是前体,mRNA,加帽,(7-,甲基鸟嘌呤核苷）的位点。有些基因的,5,非翻译区中还有一些茎环结构。这些茎环结构与翻译起始密码子的旁邻顺序对翻译的效率都有影响。此外在有些值物基团的,5,非翻译区中还鉴定出有内含子存在。如在,Ubiquitin,基因、,Sh,基因、,Actin,基因、,Ashl,基因与,Wx,基因的,5,非翻译区中均有内含子存在，且这些内含子都有增强基因表达的作用。,1.3,编码区,这是指从翻译起始密码列终止密码之间的一段区域，或者说是指这一区域中的所有外显子部分。,（,1,）,Kozak,比较了,47,种植物基因与植物病毒基因中翻译起始位点附近的,23,个核苷酸，除了一个基因例外，其余的都是从,5,端的第一个,AUG,作为翻译起始密码子的。例外的是菜豆的凝集素基因，它的转录本,5,端有,4,个,AUG,，但彼此的读码框不同。可能由于前面,3,个,AUG,的旁邻顺序不适宜核糖体的识别而不被使用，第,4,个,AUG,才是真正的翻译起始密码子。,1.3,编码区,（,2,）关于编码区外显子中,4,种核苷酸的比例，,Murray,统计了,54,种单子叶植物基因与,3,种双子叶植物基因，总结出单子叶植物基因的,AU,含量为,54,，双子叶植物基因中,AU,含量为,43,。主要的差别是发生在密码子的第,3,个碱基上，双子叶植物基因对,A,、,U,、,C,、,G 4,种碱基的选用机率基本相似，而单子叶植物基因则偏向于选择,A,与,U,。,1.3,编码区,（,3,）像其他真核基因一样，植物基因的编码区中也常有数目不等的内含子，而且有些编码区中的内含子也有增强基因表达的作用。,（,4,）有些真核基因中的一个外显子正好对应此基因所编码蛋白质中的一个结构域，因此有人推测在基因演化过程中，一个内含子可能会带着相邻的外显子在基因间飘移，从而构成由不同结构域组成的不同蛋白质分子。,1.4 3,非翻译区,这是指转录本中终止密码子后面的一段顺序，这段顺序中也有一些调控元件，它们对,mRNA,的稳定性和翻译的效率均起重要的调节作用。,（,1,）,Angenon,等分析了,748,种植物基因中围绕终止密码子的,18,个核苷酸顺序，总结出所有,3,种已知的终止密码子都能被植物基因用作翻译终止讯号，但使用的比例则因植物的不同而有差别。单子叶植物基因使用,UGA,作为终止密码的占,46,，,UAA,与,UAG,的分别占,28,与,26,，而双子叶植物首选,UAA,占,46,，而用,UGA,与,UAG,的分别为,36,与,18,，而琥珀密码子,UAG,选用的百分比最低。,（,2,）在,mRNA,末端有,1,或,2,个加,polyA,信号，多数植物基因均为,AAUAAA,，有少数基因其中的个别核苷酸有不同。,2,基因的表达调控,在植物的一个生命周期，即从种子胚到下一代种子胚的形成过程中，要经过许多不同的发育阶段与形成许多不同的组织与器官。这些过程都是与基因时空专一性表达密切相关的。同时，植物的生长与发育也离不开光、温度等外界环境，而干旱、水涝、盐碱、甚至病虫害的侵袭等也会影响植物的正常生长与发育。因此，弄清基因时空表达以及环境因素如何诱导基因表达的分子机理在理论上与实际应用上都有重要的意义。,2,基因的表达调控,2.1,器官与组织专一性表达的基因,2.2,受环境因素诱导而表达的基因,2.3,基因表达的调节机理,2.1,器官与组织专一性表达的基因,一般用于确定某个基因在何种组织中专一表达的方法有以下几种：,（,1,）以基因编码区中的一段顺序为探针，与从不同组织或器官中抽提出的总,RNA,进行,Northern,杂交。,（,2,）将待测基因的启动子,(,包括,5,远上游区,)DNA,与一种报告基因的编码区及,3,端终止区连接，建成融合基因，经转化植物并得到再生植株后，用组织化学或其他分析方法，检测该报告基因在转化植株的何种组织与细胞中表达。常用的报告基因有,GUS,基因，,CAT,基因与,LUS,基因等。,（,3,）将基因所编码的蛋白制备出抗体，对植物的不同组织切片进行免疫原位杂文。近年来用上述方法已初步确定了一些在不同植物的各种组织中专一性表达的基因，现各举一例介绍如下：,在营养器官中：,（,1,）编码,Rubisco,小亚基的,rbcS,基因。主要在叶子的叶肉细胞、叶表面的保卫细胞，中脉与绿色组织细胞中表达。,（,2,）编码富含羟基脯氨酸的糖蛋白的,HRGP,基因。此种糖蛋白是植物细胞壁的主要结构成分，有防御病菌感染的作用，主要在茎的栅状细胞、表皮细胞与滴漏细胞中表达。,（,3,）编码,S,腺苷甲硫氨酸合成酶并参与多胺与乙烯生物合成的,5,Sam-1,基因。主要在维管组织的木质部、韧皮部，厚壁组织与根的皮层中表达。,在生殖器官中：,(,1),P,2,基因。只在雄蕊的成熟花粉与花粉管中表达，它所编码的蛋白与聚半乳糖醛酶有同源性，推测此蛋白参与花粉管萌发与生长时的果胶解聚作用。,(,2),def,基因。它是金鱼草中编码一种转录因子的基因，该基因发生突变后即造成金鱼草的雄性器官转换成不正常的雌性器官，它只在花器官的雄蕊中表达。,(,3),PAL2,基因。它编码苯丙氨酸解氨酶，参与花色素的合成，只在花瓣中表达。,在种子中：,(1),编码大豆贮藏蛋白的的,Gy4,基因。它只在胚乳组织中表达。,(2)O,2,基因。它是玉米中编码一种转录因子的基因，该因子调节玉米醇溶蛋白基因的表达、,O,2,基因只在玉米的胚乳中表达。（奥帕克,-2,（,Opaque,2,），它是辛格尔顿（,Singleten,）发现的）,在种子中：,(3),编码禾谷类,-,淀粉酶的,Amyl,基因。当种子吸水后开始萌发时，该基因在糊粉层中表达。,除了上述几个例子外，近年来还鉴定出了一些专一在果实、块茎与根瘤中表达的基因，此处不一一列举。但要指出的是：,许多组织专一性表达的基因，往往也是发育阶段专一性表达的基因。如一些贮藏蛋白基因。,有些外界因素会改变基因表达的部位。如土豆的,Class patatin,基因，它编码土豆的贮藏蛋白，主要在块茎中表达，在叶与茎中不表达。但当块茎与腋生芽被除去后，该基因即在茎与叶柄中表达。此外蔗糖也可诱导此基因在叶与茎中表达。,2.2,受环境因素诱导而表达的基因,一些非生物性胁迫因素如高温、低温、干旱、水涝、盐碱、重金属离子与创伤以及一些生物性胁迫因素如致病菌的感染与根瘤菌的入侵等均能诱导植物基因的表达，在胁迫因素与基因表达之间有一个很复杂的信号传导过程，这里只介绍几个受这些因素诱导的基因的例子。,2.2,受环境因素诱导而表达的基因,2.2.1,热休克蛋白,2.2.2,低温诱导的基因,2.2.3,水涝诱导的基因,2.2.4,脱水诱导的基因,2.2.5,创伤诱导的基因,2.2.6,病菌感染所诱导的基因,2.2.1,热休克蛋白,当在正常温度中生长的植物突然转到,40,左右温度的环境中时、有一组称为热休克基因很快表达。这些基因所编码蛋白的,Mr,有,80-90kD,，,65-75kD,与,15-30kD,等几种，一些植物中的热休克基因已经被克隆，并鉴定出了它们,5,上游区中的一些调控元件，并同其他生物热休克基因的调控元件在顺序上有很高的同源性。,2.2.2,低温诱导的基因,有报道说将一些植物先在非冰冻的低温中暴露一些时候，再转到结冰的温度环境中时，它们就能在一段时间内耐受这种结冰的环境。研究表明在这种低温处理过程中植物合成了一些蛋白。,Kurkela,等从拟南芥中克隆了冷诱导与,ABA,诱导的基因，并对它的特性进行了研究。玉米,mlip,15,基因编码一个具有,bZIP,结构域的蛋白,低温、,ABA,或盐均能诱导该基因的表达。,2.2.3,水涝诱导的基因,玉米的根部遭到水淹时。有些基因很快就表达，这是植物对厌氧胁迫的一种应答与适应机制，在此种条件下表达的基因有醇脱氢酶基因,Adh,1,、,Adh,2,，蔗糖合成酶基因，醛缩酶基因等。在,Adh,1,基出的,5,上游区鉴定出了与厌氧诱导有关的顺式作用元件以及有关的反式作用因子。,2.2.4,脱水诱导的基因,已在很多植物中克隆出了由于脱水的胁迫而诱导的基因，如大麦与玉米中的,dehydrin,基因、麦根中的,WSP 23,基因与拟南芥中具有跨膜通道结构蛋白的基因等。这些基因不但在植物脱水时被诱导，也能被脱落酸,(ABA),所诱导，,Takahashi,等从水稻中克隆了,Wsi,18,基因。水稻经,0.5 mol,L,-1,甘露醇处理,30 min,后该基因即被诱导表达，但不被,ABA,所诱导。此基因的顺序与,LEA4,基因,(late embryogenesis,abundant gene),有部分同源性。,2.2.5,创伤诱导的基因,当植物受到机械损伤或虫咬受伤后，一些基因往往被诱导表达。已从土豆中克隆出了创伤诱导的蛋白酶抑制剂,基因与番茄中的,extension,基因。土豆蛋白酶抑制剂基因在正常条件下是在种子或块茎中表达的，植物受伤后可在非储藏器官中表达。此种蛋白质性质的蛋白酶抑制剂能抑制多种微生物或昆虫蛋白酶的活性，但很少抑制植物来源的蛋白酶的活性。,2.2.6,病菌感染所诱导的基因,病菌感染植物后，常会诱导一些被称为致病相关基因,(pathogenesis-related gene),的表达。其个有一些是编码水解酶的基因，如几丁质酶基因、,-1,3-,葡聚糖酶基因、以及参与木质素或抗真菌的,phytoalexin,合成的如苯丙氨酸氨解酶基因与,4-,香豆酸,CoA,连接酶基因。这些基因的调控元件已被鉴定，鉴定信号受体与研究信号传导途径是目前的一个研究热点。,2.3,基因表达的调节机理,基因的表达指基因在聚合酶,的作用下转录成前体,RNA,，前体,RNA,经过加工产生,mRNA,，以及,mRNA,翻译成多肽并折叠成有活性蛋白质分子的过程。上述过程的每一步骤都分别有许多包括蛋白质与蛋白质、蛋白质与,DNA,、蛋白质与,RNA,、,DNA,与,RNA,之间的相互作用以及受到许多顺式作用元件与反式作用因子精密的、级联式的调节。,2.3,基因表达的调节机理,2.3.1,转录水平上的调节,2.3.2,转录后的加工,2.3.3,翻译水平上的调节,2.3.1,转录水平上的调节,2.3.1.1,染色质的结构与转录,2.3.1.2,DNA,甲基化,2.3.1.3,转录起始复合物,2.3.1.4,顺式作用元件,2.3.1.5,反式作用因子,2.3.1.1,染色质的结构与转录,染色质由,DNA,与组蛋白组装而成，其最简单的样式是核小体。核小体的核心是由二个相同的拷贝,(,每个拷贝中包含组蛋白,H,2,A,，,H,2,B,，,H,3,与,H,4,),组成的八聚体。,DNA,分子缠绕在组蛋白核心上每个组蛋白核心上绕有二圈,DNA,分子，约长,l46bp,。第,5,种组蛋白,H,1,结合在核小体两端的,DNA,分子上，使链珠状的染色质变成在体积上进一步压缩了的线圈状的染色质。,2.3.1.1,染色质的结构与转录,在某种基因将被转录之前，该基因所在的一段染色质的压缩结构会松散与展开。这就可以用,DNase,处理细胞核，然后以该基因的,DNA,片段作探针与从核中抽提出的总,DNA,，经限制性内切酶切成一定长的片段后进行,southern,杂交来检测。将要被转录的基因的所在区域由于染色质的压缩结构已展开，故能被,DNase,消化。,Southern,杂交结果为阴性。在该基因不被转录的组织中染色质仍维持压缩状态。,DNase,酶不能水解,DNA,，杂交结果则为阳性。,2.3.1.1,染色质的结构与转录,最近有人从酵母中鉴定出一个由多种蛋白亚基组成的,SWI,SNF,复合体，其中包括,SWI 1,（,ADR6,），,SWI 2,（,SNF 2,），,SWI3,，,SNF 5,与,SNF 6,等,5,个基因编码的蛋白质。由于此复合物中的,SWI2,蛋白与,ATPase,以及,helicase,分子中有相似的形状，因此有人推测此复合物可能与核小体,DNA,相互作用，并利用,ATP,水解所产生的能量来改变,DNA,组蛋白的相互作用，并使,1,个或,2,个,H2A,H2B,二聚体从三元复合体中丢失，以使基因得以转录,2.3.1.2 DNA,甲基化,包括植物在内，在所研究过的许多生物中，,DNA,的胞嘧啶碱基，特别是,CpG,顺序上胞嘧啶分子中第,5,位点常被甲基化。在脊椎动物,DNA,上的胞嘧啶有,3,6,被甲基化，而在维管植物,DNA,中，约有,1,3,胞嘧啶是被甲基化了的。对许多基因来说，被甲基化了的,CpG,主要位于,5,上游调控区内。有人推测，由于,CpG,上的,C,被甲基化使,DNA,的大沟上产生了一个突起。因此局部地改变了转录因子所识别的信号，并妨碍转录因子与顺式作用元件的结合而影响基因的转录。,2.3.1.2 DNA,甲基化,用豌豆、小麦、大豆与花椰菜为材料所做的研究表明。顺式作用元件上的胞嘧啶被甲基化后在体外即不能被转录因子所结合。有一些在特定发育阶段才表达的基因，在未表达时，其,5,上游的,CpG,是被甲基化的。当达到发育阶段时，,CpG,上的甲基会被去掉，基因即能表达。这表明甲基化与去甲基化是被某种因素调节的。也有报道指出，核小体中的,H,1,组蛋白在体外优先结合在被甲基化的,DNA,上，这样会更有效地阻遏基因的转录,2.3.1.3,转录起始复合物,RNA,聚合酶,(Pol,),虽然能以小牛胸腺,DNA,为模板合成多聚核糖核苷酸分子。但它不能在体外对启动子有选择性的起始转录，这表明除了,Pol,外，还有其他因子参与有选择性的转录起始。,2.3.1.3,转录起始复合物,通过层析分离法从酵母等细胞中逐步分离与鉴定出了被称为通用转录因子,(general transcription factors,GTFs,),中的,8,种蛋白，它们是,TFA,、,B,、,D,、,E,、,F,、,H,、,I,与,J,。这些,GTFs,能与,Pol,有序地在基因的启动子上组装，以形成在体外能使基因起始转录的起始复合物。其中,TFD,与,TBP,蛋白、,TAFs,（与,TBP,蛋白相联合的因子）一起形成一个多亚基复合物，结合在,TATAbox,上；,TFB,是作为,Pol,与结合在启动子,TATA box,上,TBP,蛋白的桥梁，起转录起始位点的选择作用；,TFF,结合在,Pol,上，对,Pol,所转录出的转录本有激活其延伸的作用；,TFH,具有依赖于,DNA,的,ATPase,的活力与,DNA,解旋酶的活力。,2.3.1.3,转录起始复合物,另外，当起始复合物形成时，结合在增强子元件上的转录因子会与,TFD,蛋白相互作用，以增强,Pol,转录基因的速率；,SRB,多肽是,RNA,聚合酶,B,的抑制蛋白，它能刺激基础转录与被活化了的转录。最近发现,Pol,分子中羧基端结构域（,CTD,）在转录起始中也发挥着重要的作用，,SRB,多肽、,GTFs,以及一些尚未鉴定清楚的蛋白因子都通过,CTD,被锚锭在,Pol,分子上。,Pol,的,CTD,在有些条件下被磷酸化，推测磷酸化后的,CTD,可以使,Pol,与起始复合物中的其他成分解离而离开启动子，因此,CTD,的磷酸化也在转录起始过程中起着控制与调节的作用。,2.3.1.4,顺式作用元件,顺式作用元件是指基因,5,端上游区中那些与基因表达调控有关的一些顺序。除一般基因都有的,TATA box,与,CAAT box,外，在远上游还有一些重要的调控元件，由于这些顺序均与基因处于顺式位置，即在同一条,DNA,链上，故冠以顺式之名以与不一定处于同一条,DNA,上编码转录因子的反式作用因子的基因相区别。,2.3.1.4,顺式作用元件,鉴定出顺式作用元件是研究基因表达调控中很重要的第一步。通常所用的方法是将从转录起始点开始的,5,上游区一定长度的,DNA,片段与报告基因编码区及,3,端区相连接，构建成融合基因，然后用,Exo,外切核酸酶从,5,上游区逐步向,3,端消化，得到,5,各有不同缺失长度的融合基因。通过转化植物再生出含有上述不同缺失长度融合基因突变体的植株，用组织化学方法或其他方法，分析基因的,5,上游区缺失到什么部位就不能使报告基因表达，或失去正确的时空表达专一性，或失去对外界因素胁迫的应答能力。,2.3.1.4,顺式作用元件,找到调控元件存在的区域后，可从区域的,5,端作进一步小范围的缺失突变，或从该区段中间的不同部位造成缺失突变，进一步找出调控元件存在的准确位点。然后可人工合成此位点内的核苷酸顺序，或将此顺序中的个别核苷酸调换，或将这段顺序与突变后的顺序分别连接在基础启动子上游，以检测它们是否能调节报告基因的表达。此外还可用此段顺序与细胞中的核蛋白作体外结合试验，或进行足印分析试验，以弄清足印所显示的顺序是否与用上法所鉴定出的顺序相同。当然也可先用足印分析来确定核蛋白结合的核苷酸顺序。下面介绍一些在植物基因,5,上游区中鉴定出的几种顺式作用元件。,几种顺式作用元件,（,1,）应答光的元件（,3,个）,（,2,）应答激素的元件（,4,个）,（,1,）应答光的元件,从豌豆,rbsS,3A,基因（受光诱导表达）启动子,5,上游区鉴定出,Box,（,GTGTGGTTAATATG,）与,Box,（,AAACTTTATCATTT,）。由于从烟草中分离出的反式作用因子,GT,la,或,B2F,可以结合在此元件上，因此也称此元件为,GT,1,结合位点。如果将,Box,中的某些核苷酸进行突变，,GT,1,蛋白在体外试验中即不能再结合在突变了的,Box,上。因此突变了的,Box,启动子，在体内也不再有使基因转录的作用。,（,1,）应答光的元件,从番茄的,rbsS,3A,基因启动子,5,上游区中还鉴定出,G,box,（,CCACGTGG,）。现在知道很多植物基因启动子的上游区中都存在,G,box,或类似,G,box,的元件,这些元件对多种外界环境信号有应答作用，拟南芥中的转录因子,GBF1,3,能结合在此元件上。,（,1,）应答光的元件,从一些单子叶与双子叶植物受光调节基因的启动子上游区中鉴定出,I,box,（,ATGATAAGG,），并证明此元件对基因的受光调是很重要的的。但在一些非光调基因的启动子上游如,TaMV,35S,启动子上游区中也鉴定出含,GATA motif,的顺序。,有人在讨论近年来对光调元件研究所取得的成果时认为，虽然在许多光调基因的启动子上游区找到了一些顺式作用元件，或在不同的基因中找到了相似的元件，但至今还没有发现一个可通用的光调总开关，对受光诱导的基因来说，,5,上游区中的许多元件都是很重要的。,（,2,）应答激素的元件,应答,ABA,的元件：植物中已知有,100,多种基因可被外源的,ABA,所诱导表达，其中大部分是在种子发育后期表达的某因，或者是受外界环境因素胁迫时在营养组织中表达的基因。,已鉴定出的能应签,ABA,的顺式作用元件有小麦,Em,基因启动子上游区中的,Em1 A,元件,(GGACACGTG,GC),，与从水稻,rab,16A,基因启动子下游鉴定出的,motif I,元件（,CCGTACGT,GGCGC,），以及从其他基因中找到的相似的元件。这些元件中都包含了,G,box,中的核心顺序,(CACGTG),。但是在不同的元件中，核心顺序两边的顺序则不完全相同，因此与之结合的反式作用因子的结构与功能也不会完全相同。,（,2,）应答激素的元件,应答,GA,3,的元件：,淀粉酶基因是受赤霉素（,GA,3,）诱导而表达的。在大麦,Amy 6,4,基因启动子的上游找到,6,个串联重复的,GARE,元件（,GGCCGATAACAAACTCCGGCC,），,GA,3,存在时它可使启动子驱动基因的表达。另外又在,AMY 32b,基因启动子上游找到,3,个功能相互独立而又密切相关的顺序,(TAACAGAGTCTGG),（,GATGATGGTCAAG,）与（,CCTTT,）、后,2,种顺序形成一个与胚乳（,endosperm,）,box,有很高同源性的元件、而,3,种顺序一起则组成了一个对,GA,3,有应答功能的复合元件或偶联元件。后来又在大麦的,AmypHV19,基因的启动子上游找到一个,(TAACAAA),元件。,（,2,）应答激素的元件,应答生长素的元件：已克隆了一些受生长素诱导而表达的基因，如豌豆中,PSIAA4/5,基因，它的启动子上游鉴定出,(T/G)GTCCCAT,与（,C,A,）,ACATGG(C/A),（,A/G)TGT,（,T/C,）（,T/C,）（,C/A,）二种顺序，前者有应答生长素的作用，后者有增强基因表达的功能。能应答生长素的还有大豆的,GmAux,28,基因。其,5,上游有,TCCACGTGTC,元件与大豆中的,SGBFS,基因。,（,2,）应答激素的元件,应答乙烯的元件：在病原相关蛋白基因,PRB,16,的启动子上游区鉴定出,TAAGAGCCGCC,与,GTGACAT,二种顺序，前者与菜豆几丁质酶基因中应答乙稀的元件有部分的同源性。,2.3.1.5,反式作用因子,在基因转录中，除了转录起始复合物之外，还有许多核蛋白起着重要的调节作用，它们与相应的顺式作用元件相互作用以增强或阻遏基因的表达，或者决定着基因表达的组织与发育阶段专一性。这类核蛋白除了称作反式作用因子之外，又叫做转录因子。转录因子可被磷酸化与去磷酸化，磷酸化的状态不但调节着转录因子留在细胞核中还是进入细胞质内，同时还表明它们与信号传导系统有着紧密的联系。下面介绍几组研究得比较深入的植物转录因子。,2.3.1.5,反式作用因子,（,1,）含,bZIP,结构域的转录因子,（,2,）含,homeo,结构域的转录因子,（,3,）,含锌结合（或称锌指纹）结构的转录因子,（,4,）含,MADS,顺序的转录因子,（,5,）与,Myb,或,MyC,蛋白同源的转录因子,（,1,）含,bZIP,结构域的转录因子,bZIP,中的,b,是代表蛋白分子中有一段由很多碱性氨基酸组成的结构域，这可能是蛋白分子与,DNA,结合的区域，,ZIP,指蛋白分子中的亮氨酸拉链结构域，此段结构在蛋白分子中促使二个（同源的或异源的）亚基形成二聚体。只有当单体形成二聚体后它才能与,DNA,结合。,（,1,）含,bZIP,结构域的转录因子,到目前为止发现最多的植物转录因子是含有,bZIP,结构域的蛋白分子，如玉米中调节,22 kD,与,32,kD,醇溶蛋白基因的,O,2,蛋白，小麦中调节,Em,基因的,EmBP,1,蛋白，欧芹中调节,CHS,基因的,CPRF1,，,CPRF2,，,CPRF3,蛋白等。,（,1,）含,bZIP,结构域的转录因子,亮氨酸拉链有二十几个氨基酸残基，其中每隔,6,个氨基酸即到第,7,个氨基酸便是亮氨酸，肽链形成螺旋状，每个螺旋约含,3.5,个氨基酸，疏水的亮氨酸都排列在同一个面上，带电荷的氨基酸则处在另一面，使螺旋具有二性的特点。推测在形成二聚体时，一个单体中此区域的几个亮氨酸与另一个单体中此区域中的几个亮氨酸彼此交替排列，形如拉链。,bZIP,蛋白中还有一段酸性氨基酸富集的区域或脯氨酸富集的区域，起着活化基因转录的作用。,（,1,）含,bZIP,结构域的转录因子,含,bZIP,结构的转录因子都结合在启动子,5,上游区中以,ACGT,为核心的顺式作用元件上，如,CACGTG,（,G Box,）、,GACGTC,（,C Box,）与,TACGTA,（,A Box,）等，一些光诱导表达的基因与,ABA,诱导表达的基因的,5,上游区都含有这些元件。这些元件两边顺序在蛋白结合中也起作用。,bZIP,蛋白是一个大的基因家族，因此不同顺式作用元件之间的细微差别与不同,bZIP,蛋白分子之间的细微差别决定了它们相互作用时亲和力的细微差别，这可能是,bZIP,转录因子对不同基因的表达有精细调控能力的原因。一些资料表明，有些异源二聚体中的一个亚基缺失了具有活化基因表达功能的区域，这种异源二聚体蛋白虽然仍能与原来的顺式作用元件结合，但不能活化基因表达，由于占据着结合位点，实际上起着阻遏基因表达的作用。,（,2,）含,homeo,结构域的转录因子,Homeo,box,最早从控制果蝇发育的一些基因中鉴定出来的，,homeo,结构域含有,60,个氨基酸，蛋白的三级结构分析指出此区域的立体结构是螺旋转角螺旋。玉米中参与叶细胞分化的,kn,1,蛋白是一个转录因子，此蛋白中也含有,homeo,结构域，即也有一般同源异形结构域中最保守的,8,个位置上的氨基酸残基中的,6,个，还含有果蝇,homeo,结构域中螺旋,内,4,个不变的氨基酸残基。后来又从玉米中分离到另外,2,个具有,homeo,结构域的蛋白,ZMH1,与,ZMH2,。最近有报道，从水稻中也克隆到合,homeo,box,的基因。,另外在拟南芥中克隆到,Athb,1,与,Athb,2,基因，它们所编码的蛋白中，除了,homeo,结构域，尚有,bZIP,结构域，推测这二因子可能参与植物发育与外界环境因素（如光信号）相偶联的某一途径的调节。,（,3,）含锌结合（或称锌指纹）结构的转录因子,双子叶植物在暗中生长时，黄化苗的下胚轴长得很长，比在光中生长的幼苗的下胚轴长出,10,倍以上，顶端为未发育好即小而未打开的钩状子叶。而在光中生长的绿色幼苗，其下胚轴较短，顶端的子叶较长而且打开，并含有叶绿体。最近有人用,T,DNA,插人突变方法从拟南芥中分离到一株突变体，它在暗中生长的幼苗形态和细胞分化情况与野生型在光照中生长时的幼苗形态和细胞分化情况相似。,（,3,）含锌结合（或称锌指纹）结构的转录因子,研究者从此突变株中克隆到引起上述变化的突变基因，它的野生型基因编码一个转录因子,Cop1,，此因子参与拟南芥的光形态建成。,Cop1,蛋白共有,658,个氨基酸，第,455,到,494,位氨基酸顺序与已报道的含与,Zn,2+,结合结构域的其他生物的转录因子有高度的同源性，在此区域中，,7,个半胱氨酸与,1,个组氨酸的位置是保守的，它们可能是与,Zn,2+,结合的位置，附近还有,4,个保守的氨基酸包括,2,个异亮氨酸，,1,个苯丙氨酸与一个脯氨酸（,C,X2,C,X15,C,X2,C,，其中,C,代表半胱氨酸，,X,代表其他氨基酸）。,（,3,）含锌结合（或称锌指纹）结构的转录因子,在拟南芥与矮牵牛中也克隆到编码有锌结合结构的转录因子基因,3AF1,与,EPF,1,促进拟南芥花发育的,constans,基因（,CO,）,也是编码一个转录因子，此蛋白中含有二个锌指纹结构域（,C,X2,C,X16,C,X2,C,）。另外矮牵牛中,EPF1,也是一个转录因子，它的锌指纹结构域为（,C2,X2,F,X5,L,X2,H,X3,H,，其中,F,为苯丙氨酸，,L,为亮氨酸，,H,为组氨酸。,（,4,）含,MADS,顺序的转录因子,这是一类参与花发育的转录因子，最早是从金鱼草中克隆到的，叫做,DEFA,基因，以后又从拟南芥中克隆到,Ag,基因，近来又有人利用同源顺序作探针，从水稻等其它植物中克隆到这类基因。由于这类蛋白与人类的,SRF,蛋白以及酵母的,MCMI,蛋自上与,DNA,结合的顺序有很高的同源性，因此研究者将,MCMI,，,AG,，,DEFA,与,SRF,几个缩写字母的第一个字母合并成,MADS,来表示这类蛋白的共同结构特点。,MADS box,是由,60,个氨基酸组成，其中,19,个氨基酸在已知的,22,个具有,MADS,结构蛋白中是保守的，它们位于,MADS box N,端的,2/3,处，而,C,末端的顺序则变化较大。推测,N,端的碱性氨基酸区域是与,DNA,结合的部位，,C,端的氨基酸区域决定与,DNA,结合的亲和力，此蛋白可能也以二聚体形式结合在,DNA,上。,（,5,）与,Myb,或,MyC,蛋白同源的转录因子,有二组参与玉米籽粒花青素合成的转录因子，一组是,Cl,蛋白与,P1,蛋白，它们与动物的,Myb,原癌蛋白有,40,同源性。另一组是,R,，,B,与,Lc,蛋白，它们与,Myc,原癌蛋白有同源性，这一类蛋白的,C,端有一段含酸性氨基酸的区域，在转录中起活化的作用，它们也可能以二聚林的形式与,DNA,结合。,2.3.2,转录后加工,编码蛋白质的核基因经,RNA,聚合酶,作用后，转录成前体,RNA,，其,5,端接着要经过加帽（,m,7,G,）与,3,端加上,polyA,尾巴，同时要将内含子剪接掉，以形成成熟的,mRNA,2.3.2,转录后加工,内含子的剪接是由剪接体参与下，经过二个转酯反应来完成的。在第一个反应中，外显子,1,与内含子之间的磷酸二酯键被内含子中称为分支点顺序上腺嘌呤核苷酸的,2,羟基所割开，同时内含子中,5,端与分支点上的腺嘌呤核苷酸连接，形成新的,2,5,磷酸二酯键。这样就产生了,2,个,RNA,中间体分子，一个是有外显子,1,的,RNA,，另一个是外显子,2,与套素状的内合子。在第二个反应中内含子的,3,端剪接位点被外显子,1,的,3,羟基切开，二个外显子连在一起形成成熟的,mRNA,与另一个游离的套索状内含子，后者即被剪断,2.3.2,转录后加工,剪接体的结构非常复杂，由多种小分子的核糖核蛋白颗粒（,snRNPs,，,U1,，,U2,，,U5,与,U4/U6,）组成，在,SnRNPs,中分别含有各种蛋白因子与,RNA,分子。内含子的,5,端与,3,端的各二个核苷酸是很保守的，在绝大多数内含子中，它们分别是,GU,与,AG,，虽然编码区也有许多,GU,与,AG,，但剪接体能准确地识别内含子两端的,GU,与,AG,并在这二处切开，表明剪接体有很有效的识别机理。有报道说内含子,5,剪接位点附近的顺序与,U1RNA,的,5,端顺序之间有配对的关系。,2.3.2,转录后加工,研究表明动物内含子的分支点顺序（,UUGAC,）与酵母内含子分支点项序（,UACUAAC,）对准确剪接是重要的，推测由于它与,U2 RNA,中的一段顺序有配对关系，因此它能被,U2 snRNF,所识别。但有人对植物内含子中的顺序进行过研究，没有找到保守的分支点顺序。,Goodall,等认为在双子叶植物内含子的剪接中，内含子中富含,AU,顺序对剪接是很重要的，但在单子叶内