详细介绍抗体的分离纯化备课讲稿.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,2016.12.05,抗体的制备、纯化及其应用,1,12/,12,/2016,抗体的分离和纯化,2,12/,12,/2016,抗体的分离纯化,无论是将抗体用于研究还是用于检测或临床治疗，均需对抗体进行分离与纯化。,分离：将抗体从其存在的体液或培养液中分离出来并加以初步纯化。,纯化：提高分离出来的抗体的纯度，并将其中的杂质控制在所需的低水平。对治疗性抗体尤为重要。,3,12/9/2016,一、样品处理,分子类型,产量,特定的污染物,来源：野生型,人类血清,多克隆的,IgG,，,IgM,，,IgA,，,IgD,，,IgE,IgG8-16mg/ml,，,IgM0.5-2mg/ml,；,IgA1-4mg/ml,；,IgD10-400mg/ml,；,IgE0.4mg/ml,白蛋白，转运蛋白，,a,大球蛋白,和其它血清蛋白,杂交瘤细胞悬浮培养物,单克隆,多达,1mg,苯酚红，白蛋白，转运蛋白，,牛,IgG,，,a,大球蛋白和其它血清蛋,白，或者病毒,无血清的杂交瘤细胞悬,浮培养物,单克隆,1-4mg/ml,白蛋白，转运蛋白，常常取决于,培养基的情况,腹水,单克隆,1-15mg/ml,酯类，白蛋白，转运蛋白，脂蛋,白，内源的,IgG,和其它的宿主蛋白,蛋清,IgY,3-4mg/ml,酯类，脂蛋白,来源：重组表达,胞外蛋白，表达到上清里面,挂有表达标签的的,抗体，抗体融合蛋,白，,Fab,，或者其片段,取决于表达系统,宿主来源的蛋白，如大肠杆菌中,的蛋白等，通常污染物较少,胞内表达,取决于表达系统,来自宿主的蛋白，如大肠杆菌或,者噬菌体等,天然和重组型抗体主要污染物来源的总结,4,12/9/2016,在样品纯化前要做的主要工作有：,除去某些杂质，如脂蛋白或者苯酚红等。,除去大量的杂志，如粗品中的含量大的杂蛋白等。,更换缓冲液并除盐，把样品换到合适的缓冲液中（,PH,和盐浓度），并除去没有用处的小分子。,5,12/9/2016,纯化前除去特定的杂质,脂蛋白,脂蛋白和其它含脂物质能够阻塞色谱层析柱，最好能在纯化前除去，腹水通常含有高浓度的脂蛋白。,方法一：,在二价离子存在的情况下，硫酸右旋葡糖酐能够沉淀脂蛋白，沉淀可以通过离心除去。,步骤如下：,1每毫升样品中加入0.04ml 10%的硫酸右旋葡糖酐和1ml 1M的CaCl,2,；,2混合15分钟；,310,000g离心10分钟；,4丢弃沉淀；,5使用脱盐柱将样品换到适合纯化的缓冲液中；,注意：离心通常能够避免过滤时造成的蛋白非特异性吸附，血清蛋白样品可以通过玻璃绒毛过滤以除去酯类。,6,12/9/2016,步骤如下:,1.加入固体PVP到样品溶液中,至最终浓度为3%(w/v);,2.在4度搅拌4小时;3.17,000g离心;4.丢弃沉淀;,5.使用脱盐柱将样品换到适合纯化的缓冲液中;,方法二,:,PVP(,聚乙烯吡咯烷酮,),能产生一个,pH,值依赖的沉淀效应,PVP,在,pH=7.0,时能够沉淀,b-,脂蛋白和球蛋白,但是脂蛋白不能够在低于,pH4.0,时沉淀。,7,12/9/2016,苯酚红是一种在实验室细胞培养中的pH指示剂,虽然并不直接的影响纯化,但是苯酚红可能结合到某些纯化介质上,应该尽可能早的被除去。苯酚红能够在pH7时结合在阳离子柱上。,苯酚红,注意：使用脱盐柱除去苯酚红,并且把样品转移到合适的缓冲液中以做进一步纯化,。,8,12/9/2016,血清、腹水、细胞悬浮物或者细胞裂解物的净化,离心或者过虑是实验室净化样品最常用到的手段，这些方法适用于任何来源的少量样品。,注意：离心或者过虑后马上进行色谱层析纯化。,离心用于除去大多数颗粒物质，如细胞碎片。如果在离心后样品仍然混浊，可以再选用一次5um的滤膜过滤，再用滤膜再次过滤。,注意：,对于少量的样品或者蛋白能吸附在滤膜上，可以用10000g离心15分钟。,对于细胞样品，可以在40000到50000g离心15分钟，若样品需要短处理时间，可以减少到10到15分钟。,离心时使用冷冻功能，并且在冷室或者离心机中提前预冷转子。,血清样品可以在离心之后用玻璃绒毛过滤以除去剩余的酯类。,一、离心和过滤,9,12/9/2016,过滤能除去颗粒物质。醋酸纤维素膜和,PVDF(,聚偏氟乙烯,),膜能够有效的减少对蛋白的非特异性吸附。在色谱层析前，依照色谱层析的胶粒大小选择合适的滤膜孔径，这些列在下表中。,滤膜通常的孔径大小,色谱层析柱中柱材的颗粒大小,1um,90um,或者更大,0.45um,30,或者,40um,0.22um,3,，,10,，,15um,，或者需要更加干净的样品时采用,选择滤孔大小,注意：,用一个预跑来检测目标蛋白的收率，因为有时候样品可能被滤膜表面非特异性吸附。,过滤器可能会饱和就是滤膜有一个特定的载量，因此在建立一个纯化步骤时，需要考虑这些。,10,影响离心法的因素,离心机的,种类,、,离心方法,、,离心介质,以及,密度梯度,（一）离心速度,低速离心一般用离心速度，即转子每分钟的转数表示，如,5000r/min,等。,高速离心和超速离心时，往往以相对离心力（,RCF,）表示，如,60000g,等。,相对离心力是指颗粒所受到的离心力与地心引力之比值。即：,12/9/2016,11,（二）离心时间,依据离心方法的不同，离心时间的概念也有差别。,常速离心、高速离心和差速离心的离心时间，是指颗粒从离心管中样品液的液面完全沉降到管底的时间，即沉降时间；,密度梯度离心的离心时间，是指形成界限分明的区带时间，即区带形成时间；等密度梯度离心所需的离心时间，是指颗粒完全到达等密度点的平衡时间，即平衡时间。,离心时间过长或过短，都会影响颗粒在离心管内的预期位置，降低分离效果。,12/9/2016,12,12/9/2016,（三）温度,为防止欲分离物质在离心过程中的聚集、变形和失活，离心温度一般控制在,4,左右。,离心速度较低或者物质的耐热性较好，也可以在室温条件下进行。,超速离心和高速离心，转子高速旋转会发热而引起温度升高，必须采用冷冻系统。,（四）,pH,离心介质的,pH,必须是处于待分离物质稳定的,pH,范围内，必要时可用缓冲溶液。,pH,过高或过低都可能引起生物活性物质的变性、失活，还可能引起转子和离心机其它部件的腐蚀，应加以注意。,13,12/9/2016,第二节 沉淀分离,如果样品中含有大量的低分子污染物,使用脱盐柱作为第一步色谱层析制备样品。,增加盐浓度能够增强蛋白间的疏水相互作用,疏水性的不同导致了一个选择性沉淀。,使用沉淀法去除大量的杂质低分子污染物,一、盐析法,在物质的水溶液中添加一定浓度的中性盐，使物质的溶解度减小而沉淀析出，这一过程称为,“,盐析,”,。,优点：成本低，不需要昂贵的设备；,操作简便，安全；,对许多生物活性物质具有稳定作用；,对,pH,、温度要求不严格。,缺点：分离效果有限,14,12/9/2016,沉淀剂,使用的典型条件,样品类型,备注,硫酸铵,下文有叔,大于1mg/ml蛋白,特别使免疫球蛋白,用于稳定的蛋白,不会变 性,上清可以直接上到 HIC,（疏水层析柱）,减少了脂蛋白含量,右旋硫糖苷,加入0.04 ml of 10%右旋硫糖苷和1 ml of 1 M CaCl2/ml混匀 15 min并10 000 g离心,可用于高脂蛋白的样品,例如腹水,沉淀脂蛋白,乙烯聚合物,加入3%(w/v)后搅拌4 小时,并17000g离心,可用于高脂蛋白的 样品,例如腹水,可以选择右旋硫糖苷,PEG(Mr 4000),最多到20%,血浆蛋白,没有变性,上清可以直接 过离子交换或亲和柱,完 全除去比较困难,丙酮(冷的),在0摄氏度最多到 80%,在最高转速离 心后收集小球,可能会不可逆的使蛋白变 性,适合于小肽的制备或 者制备电泳样品,聚乙烯亚胺,0.1%(w/v),沉淀聚集的核酸蛋白,硫化精蛋白,1%(w/v),沉淀聚集的核酸蛋白,硫酸链霉素,1%(w/v),沉淀核酸,辛酸,1:15(w/w),抗体含量应该大于 1mg/ml,沉淀血清或者腹水中的大 量蛋白,仅把免疫球蛋白留在溶液中,常用的沉淀剂,15,12/,12,/,2016,蛋白质在水溶液中的溶解度是由,蛋白质亲水基团、与水形成水化膜的程度、以及所带有电荷的情况,决定的。,当中性盐加入蛋白质溶液中，盐离子对水分子的亲和力大于蛋白质，于是减弱甚至消除蛋白质分子周围的水化膜。同时，盐离子所带的电荷中和部分蛋白质分子表面电荷，更加导致其溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。,（一）盐析的基本原理,16,12/,12,/,2016,常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等,硫酸铵最为常用,，其优点是：溶解度大；温度系数小；密度小，有利于析出蛋白的离心分离；蛋白沉淀物在,2 mol/L,3 mol/L,硫酸铵溶液中稳定，低温下可保存一年；价廉易得；分离效果比其它盐好。,但硫酸铵缓冲能力比较弱，,pH,难控制；铵离子干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。,高浓度盐析法,是粗纯样品的常用方法。,（二）盐类和浓度的选择,硫酸铵沉淀通常作为蛋白浓缩纯化的第一步。这个方法通常可以有效的除去大量白蛋白、铁传递蛋白和其它大量可溶杂质。,17,饱和硫酸铵溶液:,100ml蒸馏水中加入100g硫酸铵,搅拌溶解;,1M Tris Hcl pH8.0;作为第一步纯化的缓冲液,所需溶液,:,1.,过滤,(0.45um),或者,10,000g 4,度离心,;,2.,在,10,份样品中加入,1,份,Tris Hcl,pH8.0,以保持,pH,值,;,3.,温和搅拌,逐滴加入硫酸铵溶液到,50%,饱和度,搅拌一小时,;,4.10,000g,离心,20,分钟,5.,去除上清,用等体积的硫酸铵重悬洗涤沉淀两次,(,例如,不能够重悬蛋白或者进一步沉淀蛋白的溶液,),再次离心,;,6.,用少量下步中所用缓冲液重悬沉淀,;7.,硫酸铵可以在,superdex,G25,中得到除去,;,*,通过调整硫酸铵浓度既可以沉淀目的分子,又可以沉淀杂质。,离心后丢弃脂蛋白,样品可以通过玻璃绒毛以出去脂类,。,一些抗体可能被直接使用固体硫酸铵所破坏,硫酸铵沉淀应该尽可能的使用液体,在重悬时尽可能避免气泡的产生。,在硫酸铵沉淀后,使用,HIC,作为后续步骤是最方便的。,通常,可重复的纯化过程,应该避免使用硫酸铵沉淀,而选择用,proteinG,或,proteinA,Sepharose,柱子。通常,盐沉淀应该在蛋白浓度低于,1mg/ml,时进行。加入等体积的饱和溶液,(,甚至,35%-40%),能够减少铁转移蛋白和白蛋白的污染。,硫酸铵沉淀,18,12/,12,/,2016,（三）影响盐析的因素,1.,蛋白质的浓度,过高过低都不好，一般认为,2.5%,3.0%,蛋白质浓度比较合适。,2.pH,蛋白质所带的净电荷越多，溶解度越大。盐析时溶液,pH,常选择接近蛋白质等电点，使蛋白质的净电荷接近零。,3.,温度,盐析一般对温度要求并不严格，可在室温下进行。但对温度敏感的物质，要求在,0 4,进行，防止蛋白质变性。,4.,离子强度,离子强度越高，蛋白质溶解度越低，盐析也越易发生。不同蛋白质发生盐析所需要的离子强度不同,19,12/,12,/,2016,蛋白质用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的方法有：,透析法,超滤法,葡聚糖凝胶,G50,层析法。,（四）脱盐,20,12/,12,/,2016,第三节 离子交换层析法,离子交换层析法,（,ion exchange chromatography,，,IEC,）,是利用离子交换剂上可交换离子与组分中的离子发生可逆交换时结合力的差别，而进行分离的一种技术。,广泛应用于很多生命物质的分析、制备和纯化等。,优点：,重现性好，简单易行；,分辨力强，回收率高；,具有多孔性，表面积大、交换容量大；,具有亲水性，对大分子的吸附不牢固，层析条件温和，不致引起物质变性或失活。,21,12/,12,/,2016,离子交换法的,固定相是离子交换剂,；,若担体带有正电荷，可吸附着负电荷分子，则为阴离子交换法；不带净电荷的分子，以及阳离子则直接流出，不会被吸附上去。,这些被固相单体所吸附的离子，统称为,counter ion,（抗衡离子），因为其电荷与担体上的电荷相反,(counter,是,相反,的意思,),离子交换剂为人工合成的惰性高分子聚合物，其上带有许多可电离基团，根据这些基团所带电荷的不同，可分为阴离子交换剂和阳离子交换剂。它可分三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。,一、基本原理,22,12/,12,/,2016,阳离子交换反应：,R-A,-,H,+,+Y,+,R-A,-,Y,+,+H,+,阴离子交换反应：,R-B,+,OH,-,+X,-,R-B,+,X,-,+OH,-,R,代表离子交换剂的高分子聚合物基质，,A,-,和,B,+,分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团，,H,+,和,OH,-,分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子，,Y,+,和,X,-,分别代表溶液中的离子基团。,23,12/,12,/,2016,离子交换层析对物质的分离通常是在一根充填有离子交换剂的玻璃管（,1.5 cm15 cm,）,中进行的。,含有预被分离的离子的溶液通过离子交换柱时，各种离子即与离子交换剂上的荷电部位竞争结合。,任何离子通过柱时的移动速率取决于与离子交换剂的亲和力、电离程度和溶液中各种竞争性离子的性质和浓度。,24,12/,12,/,2016,25,12/,12,/,2016,两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的理化性质和在特定,pH,条件下呈现的离子状态。,大多数蛋白在生理,pH,（,pH6,8,）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化,，极端的,pH,下蛋白会变性失活，应尽量避免。,洗脱可采用改变溶液的,pH,或离子强度，也可同时改变,pH,与离子强度的方法。改变,pH,可能对蛋白的稳定性有较大的影响，,一般采用改变离子强度的梯度洗脱,。,用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。,26,12/,12,/,2016,三、技术要点,（一）离子交换剂的选择和处理,两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的理化性质和在特定,pH,条件下呈现的离子状态。,大多数蛋白在生理,pH,（,pH6,8,）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的,pH,下蛋白会变性失活，应尽量避免。,处理的目的：使交换剂充分溶胀，使其颗粒的孔隙增大，让具有交换活性的电荷基团充分暴露出来，再用酸碱浸泡，除去杂质并使其带上需要的反离子。,（二）装柱和加样,选择平衡缓冲液的离子强度和,pH,时，首先要保证待分离物质的稳定；其次是使离子交换剂与待分离物质有适当的结合，而不与样品中杂质结合，以达到分离的目的。,溶液的离子强度常用不影响蛋白质吸附到交换剂上的最高离子强度液，常用的离子强度为,20 mmol/L 50 mmol/L NaCl,。,27,12/,12,/,2016,（三）洗脱和收集,洗脱可采用改变溶液的,pH,或离子强度，也可同时改变,pH,与离子强度的方法。改变,pH,可能对蛋白的稳定性有较大的影响，一般采用改变离子强度的梯度洗脱。,用一定盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。,（四）离子交换剂的再生与保存,使其带上所需的平衡离子。,28,12/,12,/,2016,四、影响交换容量的因素,离子交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小以及分离的样品组分的质量大小：,一般离子交换剂的孔隙应尽量让样品组分进入，使样品组分与离子交换剂作用面积增大。充分暴露电荷基团增加有效交换容量；,离子强度：,溶液中离子强度增大时，离子对交换剂上的束缚位点就会增强竞争作用，降低有效交换容量；,pH,：,弱酸型离子交换剂随着,pH,的增大，电荷基团解离增加，交换容量加大。但弱碱型离子交换剂的交换容量随着,pH,的下降而增大。,带有强电荷基团的离子交换剂在任何,pH,的溶液中都处于解离状态，所以交换容量基本与,pH,变化无关。,29,12/,12,/,2016,第四节 凝胶层析（,gel chromatography,）凝胶排阻层析（,gel exclusion chromatography,）分子筛层析（,molecular sieve chromatography,）,是以各种多孔凝胶为固定相，当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。,该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高，不需要有机溶剂、不改变样品生物学活性，,除常用于分离纯化蛋白质、核酸、多糖、激素等物质外，还可以用于测定蛋白质的相对分子质量，以及样品的脱盐和浓缩等。,30,12/,12,/,2016,31,12/,12,/,2016,凝胶是一种不带电的具有三维空间的多空网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。,一、基本原理,32,12/,12,/,2016,（,1,）蛋白质混合物上柱,;,（,2,）洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内，大分子则被排阻于颗粒之外,;,（,3,）小分子被滞留，大分子向下移动，大小分子开始分开,;,（,4,）大小分子完全分开,;,（,5,）大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在行进中。,33,12/,12,/,2016,如果两种以上不同相对分子质量的分子都能进入凝胶颗粒网孔，但由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此也可以分离开来。,凝胶层析中物质的分子量不是唯一的分离依据，有些物质的分子量相同，但由于分子的形状不同，再加上各种物质与凝胶之间存在着非特异性的吸附作用，故仍然可分开。,34,12/,12,/,2016,二、常用凝胶,凝胶是一类不溶于水，在水中有较大膨胀度和较好分子筛功能的化合物。常用的有：,葡聚糖凝胶（,dextran,）,聚丙烯酰胺凝胶（,polyacrylamide,）,琼脂糖凝胶（,agarose,）,聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶,另外还有多孔玻璃珠、多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等。,35,12/,12,/,2016,第五节 亲和层析法,亲和层析是利用某些生物分子之间专一可逆结合特性的一种高度专一的吸附层析类型。,配体是发生亲和反应的功能部位，也是载体和被亲和分子之间的桥梁。,配体本身必须有两个基团：,一个能与载体共价结合，连接后的配体对互补分子的亲和力不会改变,一个能与被亲和分子结合。,36,12/,12,/,2016,亲和层析法有点像在钓鱼，鱼是我们所要的分子,(B),杂夹在一堆蛋白质当中，鱼饵是与,B,具有专一性的分子,(A,上图,1),；,A,与,B,的专一性很高，只会在样本中与,B,结合，而排除其它杂质,(,上图,2),；若把结合在吸着剂上的,B,溶离下来，就可以得到均质的,B(,上图,3),。,37,12/,12,/,2016,38,12/,12,/,2016,二、载体和配体的选择,（一）载体,理想的载体应具备以下特性：,1.,高度的亲水性，使固相配体易与水溶液中的生物大分子物质接近。,2.,惰性载体，非特异吸附性极低。,3.,具有相当量的化学基团可供活化，而且容易和配体结合，不改变载体和配体的基本性质。,4.,具有较好的理化稳定性，不易受到周围条件（如,pH,、离子强度、温度、变性剂和去污剂等）的影响。机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速。,5.,具有均匀的多孔网状结构，能使被亲和的大分子自由通过而增加配体的有效浓度。,常用的载体有纤维素、琼脂糖凝胶、交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和多孔玻璃等。,39,12/,12,/,2016,（二）配体,优良的配体须具备以下特性：,1.,配体与待分离的物质有适当的亲和力。,2.,配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性，不与其它组分有非特异性吸附作用。,3.,配体必须具备与载体共价结合的功能基团，而且这种结合不能严重影响配体间的亲合力及结合特异性。,4.,配体应具有较好的稳定性，能够耐受偶联以及洗脱时可能的较剧烈的条件，可以多次重复使用。,40,12/,12,/,2016,亲和层析中部分蛋白配体,配基,纯化的物质,蛋白,A/,蛋白,G,各种免疫球蛋白,单克隆抗体,各种抗原、蛋白,A,抗原,特异性单克隆抗体、特异性多克隆抗体,核苷酸,核苷酸结合蛋白、核苷酸酶,血凝素,糖蛋白,蛋白酶抑制剂,蛋白酶,脂肪酸,脂肪酸结合蛋白、清蛋白,糖,血凝素、糖,苷,甘酶,生物素,亲和素、生物素结合蛋白,肝素,凝血因子、酯酶、,DNA,聚合酶、连接组织蛋白酶,钙调蛋白,钙调蛋白结合酶,Triazine,染料,脱氢酶、激酶、多聚酶、干扰素、限止酶等,41,12/,12,/,2016,一种可应用的亲和纯化标签：,6,组氨酸标签,组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍、锌和钴等金属离子,在中性和弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结合,在低,pH,下用咪唑竞争洗脱,42,12/,12,/,2016,抗体纯化填料选择要点,一、填料种类的选择,1,）血清中的抗体含量,备注：,Protein A/G,通常结合抗体的重链，而,protein L,通常结合抗体的轻链。重链和轻链都有亚型之分，不同亚型对,protein A/G/L,的结合能力不同。其中,protein L,结合,kappa,链，不同物种血清总抗体中,kappa,链的比例不同。,43,12/,12,/,2016,2,）,protein A/G/L,的结合特异性,Binding Affinities of recombinant Protein L,Protein A,and Protein G Immunoglobulin binding domains,备注：上面这张表来自于,pierce,的说明书，给出了重要信息，对于不同抗体，,Protein A/G/L,的结合能力不同。通常我们推荐首选,protein A,填料，这种填料使用最广泛，有耐碱性的填料可以选择。只有当,protein A,填料结合不好，才选择,protein G,填料。,L,不到最后要考虑。因为,protein L,虽然在上表中看起来可以结合很多种类的抗体，其实它只结合,kappa,链，而,kappa,链本身还有进一步的亚型之分，所以对于单抗来说，不结合,protein L,填料的概率是比较大的。,44,12/,12,/,2016,二、结合条件的优化,1,）,protein A,的结合条件,备注：亲和填料选定以后，需要考虑结合条件，洗脱条件的优化。只有经过优化，才能获得最高的纯度的同时保持抗体的活力,特别需要优化的是,pH,。相对而言,proteinA,对抗体的结合需要稍高一点的,pH,具体选择见上表。,45,12/,12,/,2016,由,protein A/G,对鼠抗,igG1,的亲和力表，我们可以知道，这两种填料对小鼠,igG1,的结合，,protein G,要大于,protein A,因此做鼠抗的纯化，可以优先考虑,protein G,亲和填料。如果使用,protein A,填料，下图的结合,pH,依赖性可供参考。,2,）,protein A,结合鼠抗,igG1,的,pH,依赖性,46,12/,12,/,2016,四、抗体结合亲和填料的选择,1,）首选,protein A,protein A,有耐碱形式的突变体，它更加稳定，脱落更少。因此，在,proteinA,可以结合的情况下，它的一些纯化性质比,protein G/L,更加清楚，首选,protein A,亲和填料。选择,protein A,亲和填料，需要配套选择,pH8.5-9.0,的结合缓冲液，实现更好的结合。,2,）次选,protein G,羊抗体和,protein A,结合性质不好，小鼠的,igG1,和,protein A,结合也不好，此时可以选择,protein G,人的抗体和,protein A/G,结合都不错，但考虑到盐浓度，,pH,梯度等影响，选择,protein G,操作更简单，方便，只要使用,PBS,对样品进行一定程度的稀释，就可以很好的和,protein G,亲和填料结合。,47,12/,12,/,2016,3,）,protein L,的选择,在,protein A/G,的结合效果都不好的时候，,protein L,是一个很好的补充,它结合抗体的,kappa,轻链。对于多抗来说，需要判断,kappa,和,lamda,轻链的比例，如果,lamda,轻链的比例占优势，使用,protein L,纯化，将损失较多的目的抗体。对于单抗来说，如果不管是鼠抗，还是兔抗，,kappa,链都占有优势，可以尝试,protein L,纯化。这种填料纯化的纯度也很不错，但是请注意的是：,kappa,轻链也有多种亚型，并不是每一种都可以和,protein L,结合。,4,）,thiophilic resin,的选择,有一些单抗，对于,protein A/G/L,的结合都不好，在优化了,pH,、盐浓度之后，还是解决不了问题。此时我们推荐尝试亲硫胶纯化（,thiophilic resin,）。这种填料和抗体之间的结合并不是十分特异，基本上通过缓冲液中的硫酸根的桥联作用和目标分子上的巯基发生作用。要提高纯度的话，推荐使用盐的梯度洗脱（硫酸盐从,500 mM,逐渐降低）。这种填料的优势在于，洗脱条件非常温和（可以,PBS,洗脱），对于不稳定的抗体来说，有重要价值。,48,12/9/2016,THANKS!,49,