第三章-核酸扩增技术课件说课讲解.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,目 录,第三章 核酸扩增技术课件,大纲要求：,掌握PCR的原理和反应过程,掌握PCR反应体系,掌握PCR产物,的检测,熟悉实时荧光定量PCR的原理和方法,了解,以PCR为基础的相关技术,Special,二、教学内容,第一节 聚合酶链式反应,第二节 以,PCR为基础的相关技术,第三节 PCR产物的检测,第X节 实时荧光定量PCR,现在位置 P169,基础知识,遗传中心法则,现在位置 P169,+,基础知识,基础知识,DNA加热变性,DNA冷却复性,一、,核酸分子杂交的基本原理,基础知识,DNA变性(denaturation),定义：,在某些理化因素作用下，DNA分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。,基础知识,基础知识,融解温度（Tm）定义：,在DNA热变性时，其A260的升高达最大值一半时的温度。,基础知识,melting temperature，,DNA复性,定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称,复性或杂交,。,热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，此过程称为,退火(annealing),。,基础知识,基础知识,基础知识,dNTP,d,A,TP,d,C,TP,d,G,TP,d,T,TP,d,N,TP,PCR概念：在,体外,特异地,复制,一段,已知序列的DNA片段,的过程。,第一节 聚合酶链式反应,现在位置 P169,一、,PCR,的原理和反应过程,PCR反应,重复,进行,DNA复制,的过程，使DNA得以,扩增,，每一次复制包括3个步骤：,变性,（denaturation）,退火,（annealing）,延伸,（extension）,现在位置 P125,变性（denaturation）,将待复制的双链 DNA,经,加热,至94,95,）左右一定时间后，DNA双螺旋的氢键断裂，使之成为单链分子，作为反应的,模板,（template)，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；,现在位置 P170,退火（annealing）,温度降低至寡核苷酸（oligonucleotide）,引物,的,融点温度,以下（4070），使,引物,能与,模板,互补结合，形成杂交链；,现在位置 P125,延伸（extension）,将温度升至,72,左右，使反应体系中的,DNA聚合酶,按照,模板链的序列,以,互补,的方式依次把,dNTP,加至,引物的3端,，使杂交双链不断延伸，以至形成新的DNA 双链。,现在位置 P125,PCR,的基本反应过程,变性,95,C,延伸,72,C,退火,Tm-5,C,现在位置 P170,（40-70,C）,PCR,的扩增效率,现在位置 P170,循环次数,：0123 n,产物数量,：2 2 2 2 2,0,1,2,3,n,每一次循环后，一分子模板被扩增为两个分子,每个循环所产生的DNA片段，即为下一个循环的模板,PCR产物量以指数形式增长,模板DNA,特异性引物,耐热DNA聚合酶,dNTPs,Mg,2+,二、PCR体系基本组成成分,现在位置 P170,模板DNA,特异性引物,耐热DNA聚合酶,dNTPs,缓冲液,二、PCR体系基本组成成分,现在位置 P170,模板,(template),模板,就是将要被复制的核酸片段，包括基因组DNA、RNA、质粒DNA和线粒体DNA等。,在用,RNA,作为模板时，须先将 RNA,逆转录,为cDNA，再以cDNA作为PCR反应的模板进行扩增反应。,现在位置 P125,耐热DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶,（Taq DNA polymerase）是从一种生活在热泉（8090）中的水栖噬热菌（Thermus aquaticus）中提取的，有很高的耐热稳定性。TaqDNA聚合酶的作用是,催化DNA合成,，即在模板指导下，以,dNTP,为原料，在,引物的3-OH,端,加上dNTP,在二者间生成3，5-磷酸二酯键，使DNA链沿,53,方向延伸。,现在位置 P170,dNTPs,即dATP、dCTP、dGTP和dTTP四种脱氧核苷三磷酸的混合物。,反应体系中,4种核苷酸的浓度必须一致,四种核苷酸间浓度的不平衡会增加反应时DNA聚合酶错配的机率。,浓度过高会加快反应速度，但导致非特异性扩增,降低在dNTP浓度会提高反应的特异性,一般为20200umol/L,现在位置 P170,镁离子浓度,镁离子浓度在扩增反应中是一个至关重要的因素，因为镁离子对于,反应系统本身,、,稳定核苷酸,和,提高Taq DNA聚合酶的活性,有直接的影响。,Mg2+浓度过,低,使,酶活力降低,Mg2+浓度过,高,又会使酶催化,非特异性扩增,。,一般为1.5mmol/L,现在位置 P172,引物(Primer),引物是,化学合成,的,已知序列的寡核苷酸(oligonucleotide)分子,。,引物决定PCR扩增,产物的特异性,和,长度,。,现在位置 P170,引物设计时必须遵循的原则（6条）,用于,PCR反应的引物需要,二条,，分别设在被扩增目标片段的,二端,，并分别与模板正负链,序列互补,。,引物的长度一般以,1825,个核苷酸,为宜,引物过,长,容易产生寡核苷酸的链内互补，形成,发夹状结构,，,引物过,短,则会,降低扩增的特异性,；,现在位置 P171,引物设计时必须遵循的原则,二条引物之间（尤其在3端）的序列,不可有互补,，以免形成引物二聚体；,引物的,碱基组成应平衡,，避免出现,嘌呤、嘧啶碱基堆积,。,CG,的比例一般为,4555,%。,现在位置 P171,PCR扩增中的退火温度是根据引物的Tm值而决定的，,二条引物的Tm值不能差别太大,。,根据需要，合成引物时,在其5端可以加修饰成分,如加入,酶切位点,，用,生物素、荧光素、地高辛等标记,，引入,突变位点,，引入,启动子序列,，引入,蛋白质结合DNA序列,等。,现在位置 P171,引物设计时必须遵循的原则,三、反应条件,1、温度,变性温度：一般把变性温度定在,9597,之间，以使模板DNA和产物,双链完全打开,。,退火温度：退火温度决定PCR反应的特异性，退火温度的设定取决于引物的,Tm,，通常PCR的退火温度应,低于引物Tm5,左右。,延伸温度：一般为,72,，在这个温度下,TaqDNA聚合酶具有较高的酶促活性,，有利于DNA的复制。,现在位置 P172,2、时间,PCR循环中每个步骤所需的,时间,取决于,所扩增片段的长度,。,以长度为2001000bp的扩增片段为例，循环中变性、退火和延伸三个步骤的持续时间,一般均为30秒1分钟,。,在模板（尤其是基因组DNA）进行,第1次变性时应给予足够长的时间,（57分钟，根据变性温度高低而异）以使模板彻底变性，然后再进入循环。,时间,过长,会,降低扩增的特异性,。,现在位置 P173,3、循环次数,循环次数一般为,2045,次。,PCR扩增效率呈S型曲线，有平台效应,平台效应的原因：,初始模板量,引物二聚体和反应产物抑制扩增,反应体系的组份被消耗,引物与模板DNA间竞争,现在位置 173,四、PCR技术的质量控制,硬件方面,实验室规范化设置,软件方面,样本采集,核酸提取,扩增,产物分析,测定结果的报送,现在位置 P173,（一）实验室的规范化设置,临床基因扩增检验实验室必须包括,四个工作区域,：,试剂贮存和准备区,；,标本制备区,；,扩增反应区,；,产物分析区,。,这四个区域必须,互相独立,，并严格,按照上述顺序设置,。,每一区域都必须,配置专用仪器,，所用物品、试剂和耗材不得从某一个区域移至另一个区域使用。,现在位置 P174,（二）PCR技术的质量保证,PCR技术用于临床检验的质量保证主要涉及,基因扩增检验全过程,的质量保证、,室内质量控制,和,室间质量评价,。,现在位置 P129,（二）PCR技术的质量保证,样本采集,核酸提取,扩增,产物分析,测定结果的报送,现在位置 P129,（一）目的基因的克隆,（二）基因的体外突变,（三）DNA和RNA的微量分析,（四）DNA序列测定,（五）基因突变分析,四、,PCR,的主要用途,现在位置 P,第二节,以PCR为基础的相关技术,（一）逆转录PCR技术,（二）巢式,（三）,定量PCR技术（）,（四）多重PCR技术,（五）PCR诱导定点突变,（六）原位PCR技术,（七）差异显示PCR技术,（X）免疫PCR技术,现在位置 P174,以PCR为基础的相关技术,（一）、逆转,录PCR,逆转录PCR（reverse transcription PCR,RT-PCR,）是以细胞内,总RNA,或,mRNA,为材料进行体外扩增的技术。,由于耐热的DNA聚合酶不能以RNA或mRNA作为模板，因此,首先必须将总RNA或mRNA作逆转录，以生成与之互补的cDNA,，然后,再以cDNA作为模板进行PCR扩增,，得到所需的目的基因片段。,RT-PCR主要用于,克隆cDNA,、,合成cDNA探针,、,检测RNA病毒和分析基因表达,等。,现在位置 174,（二）、巢式,PCR,巢式PCR（nested PCR）是对靶基因进行,二次扩增,。,二次扩增所用的引物不能相同，第二次扩增所用的引物必须位于第一次扩增所用引物的,内侧,先用第一对引物扩增出一个较大的片段，再用第二对引物进行第二次扩增,第二次扩增的模板是第一次扩增的产物,现在位置 174,（二）、巢式,PCR,现在位置 174,引物1,引物2,nest,要扩增的目标基因,（三）、定量,PCR,相对定量PCR,定量PCR（实时荧光PCR）,现在位置 175,（四）多重PCR技术,多重PCR（multiplex PCR）即在,同一反应体系,中加入,多对引物,，以,同时扩增一份DNA样品中多个不同序列的靶片段,。,现在位置 P179,（四）多重PCR技术,多重PCR必须满足的两个条件：,PCR反应条件适合所有被扩增的DNA片段,同一反应内各扩增片段的大小应不同，以便检测时能通过电泳将各片段充分分离,现在位置 P179,（四）多重PCR技术,现在位置 P179,（四）多重PCR技术,现在位置 P179,（五）PCR诱导定点突变,DNA重组技术使我们能够首先用各种方法对克隆的DNA片段进行突变，在对产生的突变作DNA序列分析以后，再对突变体的特殊功能作进一步研究。,现在位置 P180,（六）原位PCR技术（in situ PCR）,组织固定处理,细胞内的DNA或RNA,，并以其作为靶序列进行PCR反应的过程称为原位PCR。,原位PCR与普通PCR的,主要区别,在于,模板的制备,。经脱蜡处理的组织切片或滴加在载玻片上的细胞悬液都可作为扩增样品，所有步骤均,在载玻片上,进行。,现在位置 P134,（六）原位PCR技术（in situ PCR）,进行PCR时，加入地高辛标记的的dUTP，使扩增产物带有地高辛。PCR结束，加入酶标抗地高辛抗体，再加入底物显色。,现在位置 P134,（六）原位杂交PCR,原位杂交PCR,与,原位PCR,的唯一区别：,扩增结束后，用寡核苷酸探针与扩增产物作原位杂交。,现在位置 P134,（七）差异显示PCR（defferential display PCR,DD-PCR）,现在位置 P182,一种以,逆转录PCR,为基础的研究,基因表达差异,的技术。,DD-PCR主要用于,肿瘤,和多种,疾病的分子遗传学研究,，是目前筛选基因表达差异最有效的方法。,（X）免疫PCR（immuno-PCR,IPCR）,结合PCR技术和抗原抗体反应,用于检测抗原（蛋白质）,固相载体上包被有抗体1,抗体2上标记有DNA，作为PCR的模板,现在位置 P134,（X）免疫PCR（Immuno-PCR,IPCR）,第一步：,载体抗体1-,抗原PCR,现在位置 P134,（X）免疫PCR（immuno-PCR,IPCR）,IPCR的灵敏度是ELISA的100-10000倍,现在位置 P134,第三节,PCR产物的检测,Detection of the PCR product,第三节 PCR产物的检测,PCR完成以后，必须对扩增产物进行检测,有效性和正确性,：通过对PCR产物进行电泳分离，观察扩增条带的有无、扩增片段的大小等判断PCR反应的有效性和正确性。,PCR产物定量,：（专门章节讲,）,序列是否正确,：测序,现在位置 P185,一、,PCR,限制性片段长度多态性,是根据突变序列是否位于限制性内切酶的酶切位点内而设计的对,PCR产物,作限制性片段长度多态性分析的技术。,若,点突变,处于某一,限制性内切酶的酶切位点,内，可,在突变点二侧设计引物,，使,PCR产物含有该突变序列,。,一种,检测点突变,的技术，应用十分广泛。,现在位置 P185,基因组中某个基因在,同种生物的不同个体,中，同时和经常存在的两种或两种以上的变异型，以至于用某种,限制性核酸内切酶,消化基因组的某段序列时，会呈现,不同长度的消化片段,，形成生物群体的多态性，这种多态性称为,限制性核酸内切酶片段长度多态性,(restriction fragment length polymorphism,RFLP),EcoR,I,5-GAATTC-3,5-NNNNNNN,GAATTC,NNNNNN-3,5-NNNNNNN,G AATTC,NNNNNN-3,P1,P2,5-NNNNNNN,GAATTC,NNNNNN-3,5-NNNN,G AATTC,NNN-3,5-NNNNNNN,G,T,ATTC,NNNNNN-3,EcoR,I,5-NNNNNNN,G,T,ATTC,NNNNNN-3,EcoR,I,+,_,+,_,RFLP的优缺点,RFLP用于检测点突变,可以确定点突变的位置,二、等位基因特异性寡核苷酸,Allele specific oligonucleotide,ASO,是用,寡核苷酸探针,和,PCR产物,进行,杂交,以检测,点突变,的方法。,被检基因片段经PCR扩增并经电泳分离后转移到膜上，分别与经,标记,的含有,正常序列和突变序列,的,寡核苷酸探针,杂交。,PCR产物仅与,完全互补,的探针杂交,现在位置 P185,野生型基因DNA,突变型基因DNA,野生型基因DNA探针,突变型基因DNA探针,野生型基因DNA探针,突变型基因DNA探针,结论：不存在点突变,野生型基因DNA探针,突变型基因DNA探针,结论：存在点突变,DNA片段在琼脂糖凝胶上电泳分离,膜上固定DNA片段,在缓冲液中将标记的探针加到膜上,DNA片段从琼脂糖凝胶上转印到膜上,杂交信号的检测,ASO的优缺点,用于检测,点突变,由于探针的序列是已知的，可以确定,点突变的位置,缺点是,成本相对较高,，检测一个点突变即需要,一对引物,和,一对寡核苷酸探针,现在位置 P185,三、单链构象多态性,单链构象多态性,（Single strand conformation polymorphism,SSCP,）当DNA分子以单链存在时，能在空间内自发地形成二级结构，这种二级结构的空间构象取决于DNA分子本身的的碱基构成，即使一个碱基的差别也会形成不同的二级结构。,SSCP用于检测,点突变,缺点：不能确定突变的位置,现在位置 P186,三、单链构象多态性,突变DNA,的PCR产物经,变性,后产生与,正常DNA,空间构象不同的两条单链,。在,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,中时，,不同构象的单链片段,具有,不同的电泳迁移率,，从而能,区别正常与突变的DNA,。,只适合于检测,200bp,以内的DNA靶基因片段,实验的关键是控制各种条件以,避免在操作过程中DAN单链分子复性为双链,。,现在位置 P186,四、变性梯度凝胶电泳,现在位置 P186,DNA分子的物理特性之一是当DNA分子被加热至其融点温度时双链被打开。,融点温度取决于DNA分子本身的序列,，不同序列的DNA分子具有不同的融点温度。,变性梯度凝胶电泳技术正是利用了DNA分子的这一特性。,在设计引物时使,被扩增目的片段的二端,含有,不同的Tm值,，一端较高，另一端相对较低。,将这一,PCR产物,在由,变性剂形成梯度,的聚丙烯酰胺凝胶上,电泳,，当其泳动至相应位置时，,片段于Tm值较低一端的双链被部分解链,，如此形成的构象至使该片段的,电泳迁移率大大降低,。,现在位置 P186,变性剂浓度由低到高,Tm值低,Tm值高,变性梯度凝胶电泳的优缺点,变性梯度凝胶电泳技术用于检测,点突变,缺点：不能确定突变的位置,现在位置 P186,Tm值的大小取决于DNA分子的长度和其序列中的G/C含量,双链DNA可以结合荧光染料（SYBR Green I）,DNA复性时，荧光最强，随温度上升，荧光变弱，形成融点曲线。,正常序列和突变序列因不同Tm而产生不同的融点曲线。,五、融点曲线分析,现在位置 P137,温度,荧光强度,温度,荧光强度,优点：,PCR产物不需要纯化，可以直接分析,可以进行大批量样本分析，成本低,结果重复性可达100%,缺点：,不能确定突变的位置,五、融点曲线分析,现在位置 P137,PCR产物的序列分析主要用于,分子克隆,时对于,目的基因扩增片段的序列鉴定,对,致病基因检测,时分析扩增片段中,点突变的位置和性质,。,六,、PCR产物,的序列分析,现在位置 P137,DNA自动测序,采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。,DNA自动测序结果举例,目 录,PCR产物序列分析的优缺点,优点：,可以确定点突变的位置和性质,缺点：,成本贵,PCR产物分析方法的比较,用于,突变位置,突变性质,RFLP,点突变,能确定,不能确定,ASO,点突变,能确定,能确定,SSCP,点突变,不能确定,不能确定,DGGE,点突变,不能确定,不能确定,融点曲线,点突变,不能确定,不能确定,测序,点突变,能确定,能确定,拓展：,PCR技术,在分子诊断中的应用,分子诊断,的定义就是用分子生物学技术通过检测被检测基因的存在与否、结构变化或表达异常，确定受检者有无基因水平的变化，并以此作为确认疾病的依据。分子诊断不仅能在疾病早期对患者作出确切的诊断，也能判别致病基因的携带者，确定个体对疾病的易感性并对疾病的分期、分型、疗效监测和预后作出判断。因此，分子诊断已成为检验医学的一个重要组成部分。,现在位置,目前分子诊断最常见的应用：,(1)鉴定位于众多正常细胞背景下的少量癌细,胞；,(2)鉴定具有发病风险的个体，以便及时采取,有效的预防措施；,(3)确定对特定治疗可能敏感的患者，避免不,必要的治疗干预；,(4)选择复发风险高、能从初期治疗中受益的,患者；,(5)鉴定对治疗有产生严重毒性反应风险的患者。,两个对照组,1、阴性对照,水,2、阳性对照,诊断策略,1、直接诊断策略,直接诊断就是用分子生物技术检测基因的缺失、重组或是点突变等遗传缺陷。进行直接诊断的前提必须了解被检基因的正常结构和序列。,2、间接诊断策略,间接诊断实际上就是对家系进行连锁分析，以确定被检个体的同源染色体中哪一条与致病基因连锁，从而判断被检个体患病的可能性。,间接诊断策略的遗传标记,（1）限制性片段长度多态性,（2）可变数目串联重复（variable tandem repeat,VNTR）和短串联重复（short tandem repeat,STR）,（3）单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）：,（1）限制性片段长度多态性 （PCR-RFLP),儿童型脊髓性肌萎缩症,(spinal muscularatrophy，SMA)是一种常见的神经系统常染色体隐性遗传病，SMN基因为其主要致病基因，约986 的患者有SMN基因第7、第8外显子或单纯第7外显子的纯合缺失或突变。,检验流程,外周静脉血,提取DNA,设计引物,PCR扩增,PCR扩增产物酶切,电泳检测,PCRRFLP技术简单易行，只要对常发生基因缺失的第7、第8外显子设计引物进行PCR扩增、酶切即可。它是通过琼脂糖凝胶电泳后判断有无特异性酶切条带来做出诊断，因而有特异性较高，重复性好，快速，经济，需模板量少等优点。对I、型SMA患者而言，其第7、第8外显子的缺失诊断率分别达100 和917，因而可以避免因创伤性检查肌活检所带来的痛苦，对其家系的遗传咨询及产前诊断都具有重要意义。,2）可变数目串联重复和短串联重复（STR）,亲子鉴定,作业,1.运用分子检验技术如何确诊被检者是否患病，其检验流程如何？图示之,2.PCR引物的设计原则是什么？如何设计引物？,此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢,