基因分析技术简介.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,陶慧卿,基因分析技术,简介,1,在生物、医学、农牧业领域的应用,2,测序的应用,基因组,DNA,测序,cDNA,测序,未知序列测序,已知序列再测序,3,双脱氧链终止法的,原理,Sanger,双脱氧链终止法的最大特点是引入了双脱氧核苷三磷酸（,2,3-ddNTP,）作为链终止剂。,ddNTP,可以在,DNA,聚合酶的作用下和多核苷酸链的,3,羟基形成磷酸二酯键，但却不能再与下一个核苷酸缩合，结果使得多核苷酸链的延伸终止。,4,双脱氧链终止法测序的主要步骤,扩增待测,DNA,片段，使其变性，获得单链,DNA,模板。,选择一条与,DNA,单链互补的短链引物，将引物用放射性同位素标记。,引物先同单链模板复性。,在四个反应管中分别加入待测,DNA,单链模板、互补引物分子、四种的,dNTP,、,DNA,聚合酶,(Klenow,酶,),以及不同的,ddNTP,进行聚合反应。,5,6,双脱氧链终止法测序与,PCR,的区别,测序只用一条引物，,PCR,需要两条引物,测序产物线性增长，,PCR,产物指数增长,测序需要,dNTP,和,ddNTP,，,PCR,只用,dNTP,测序产物是一系列长度相差一个碱基的片段，,PCR,产物只有一条带,7,1,、,商品化测序试剂盒,-,荧光染料标记,ABI PRISM,BigDye v3.1,和v1.1试剂盒,2,、,自动化测序仪,ABI PRISM,310,、,3100,和,3730,全自动遗传分析仪,双脱氧链终止法的发展,8,BigDye v3.1,试剂盒的反应体系及条件,反应体系,：,单链,DNA,模板,引物,DNA,聚合酶,Mg2+,4,种,dNTP(dATP,dGTP,dCTP,和,dTTP),4,种不同的荧光标记的,ddNTP,(ddATP,ddGTP,ddCTP,和,ddTTP),循环条件,：,96 1min(96 10s 50 5s 60 4min),25,个循环,4,保温,9,10,ABI Prism 310 Genetic Analyzer,capillary,Syringe with polymer solution,Autosampler tray,Outlet buffer+,Injection electrode-,Inlet buffer,11,Autosampler Tray,Sample Vials,Electrode,Capillary,See Technology section for more information on CE,电进样及电泳,12,荧光激发和检测,13,2025/5/13 周二,14,影响测序质量的因素,测序成功的前提：,PCR,本身是成功的,PCR,产物一定要经过纯化后再测序,测序引物比,PCR,引物靠后一些,(Nested primers),在测序反应过程中反应体积不要有波动（蒸发）,选择合适的测序产物纯化方法,15,SNP,筛查,单核苷酸多态,(SNP),是基因组中最为丰富的遗传多态，是决定个体差异的最主要的遗传基础。,多态形式主要包括单碱基替代、插入或缺失，一般也包括微小片断插入,/,缺失。,由于很多,SNP,位点本身就是功能多态位点，使得,SNP,在疾病易感基因的相关性研究中有着广泛的应用。,16,SNaPshot,Multiplex System,17,18,SNaPshot,试剂盒的反应体系及条件,反应体系,：,单链,DNA,模板,引物,DNA,聚合酶,Mg2+,4,种不同的荧光标记的,ddNTP,循环条件,：,(96,10 sec 50,5 sec 60,30 sec)25,循环,4,保温,19,方法特点,分型准确：该技术也称小测序技术，其准确度仅亚于直接测序。,多位点同时检测：可以同时检测达,12,个位点，而,Taqman,一次仅能检测一个。,不受样本量的限制,:,而,Taqman,对少量样本不适合。,20,注意事项,1,同一反应管中，不同位点的引物长度必须不同，最好能相差,4-6,个碱基。,2,引物与模板互补部分（有效引物）的,Tm,值至少要,50,。,3,为了改变引物的长度，区分不同的位点，可以在引物的,5,端加,poly(dT),、,poly(dA),、,poly(dC),或者,poly(dGACT),尾巴。这四种尾巴理论上不容易形成二级结构，并且都经过实验验证。小心：,poly(dT),有可能与真核基因,3,端的,poly(dA),尾巴互补。,4,在引物设计的时候，如果,+,链,DNA,的序列不理想，难以设计出最佳引物，请使用,-,链,DNA,设计引物。,21,微卫星多态,(STR),分析,微卫卫星多态位点是一种短核苷酸串连重复多态（,short tandom repeat,STR,）,重复单元通常为,2-5bp,由于这种重复序列在,DNA,复制过程中不稳定，所以突变很高，从而导致这种标记位点的多态性很强，杂合度很高，正因为这种特点，微卫星多态在遗传分析中有着广泛的应用,.,22,荧光,引物,荧光,PCR,产物,荧光激发与检测识别记录,结果,PCR,电泳,数据处理,STR,分析,实验,原理及,步骤,23,肿瘤和正常组织微卫星标志一致，为,MSS,24,肿瘤和正常组织微卫星标志出现缺失，为,MSI-H,25,Thank you!,26,2025/5/13 周二,27,