酶的分离和纯化.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,第二章 酶的分离和纯化,Isolation and Purification of enzyme,方法概括,原料处理：包括组织破碎、缓冲液抽,粗分级：一般采用硫铵沉淀、乙醇沉淀或其他方法,细分级：一般采用离子交换层析、凝胶层析、亲和层析和电泳,1,.,2,.,第一节,原料选择及预处理,动物原料,：动物组织或脏器（活体取出）,充分脱血,-10,-50,保存,植物原料,：植物原料,磨碎,加入缓冲液抽提,植物原料特点：,1,）纤维含量高,2,）酚酶活力高,3,）缓冲液,pH,易被细胞内物质改变,微生物原料,：菌体培养,做酶活,时间曲线,确定最大酶活时间,3,.,细胞破碎,微生物细胞破碎一般采用,1,）,化学法：碱；去垢剂；有机溶剂；酶解；冰冻复融,2,）,物理法：热处理；渗透压；减压；声波振荡,3,）,机械法：加磨料；研磨；挤压,4,）,缓冲液抽提,抽提缓冲液的加入要少量多次，植物酶抽提时可加,5mM,的,Vc,4,.,第二节 酶的粗提,沉淀,核酸沉淀：,a,）,MnCl,2,、硫酸鱼精蛋白、链霉素可使核酸沉淀，离心除掉（,b,）加入核酸酶将其降解,杂蛋白沉淀：根据目的酶的特性方法各异,选择性沉淀（盐析）：最常用的方法,5,.,沉淀过程中随时监测蛋白浓度和酶活力,讨论：,（,a,）盐的加入速度合适,（,b,）蛋白质开始沉淀处的硫铵浓度与蛋白浓度有关,（,c,）硫铵浓度表示法；饱和度,254.1M,（,d,）硫铵饱和溶液,pH7,，若目的酶易酸变性必须用缓冲液,（,e,）硫铵溶液密度较高（,1.24,），故需较大离心力,此步可除去,75%,以上的杂蛋白，且可使蛋白浓缩,6,.,透析与浓缩,1,）,透析袋处理：,透析袋,0.5M EDTA,煮半小时,蒸馏水煮半小时,反复八次,带橡皮手套用镊子拿取,2,）,透析除盐：,200,倍于被透析物；,4,小时换一次透析液；监测电导值,Sephadex G25,除盐：柱长,50cm,；上样小于床体积的,20%,3,）,浓缩：,a,）火棉胶,b,）聚乙二醇（,PEG,）,c,）超滤（,3-5kg/cm,2,）,d,）冻干,7,.,透析技术原理图,8,.,超滤技术原理图,9,.,第三节 酶的精制,一、层析技术（,chromatography,）,1,）,分配层析,：物质在两相中的分配系数不同,a,）纸层,b,）薄层,(,比纸层灵敏,100,倍但剥板困难,),c,）柱层,2,）,吸附层析,（,absorption chromatography,）,：吸附剂对通过它的物质吸附力不同，吸附力包括离子引力、疏水作用、范德华力和氢键,a,）薄层,b,）柱层,填料一般为硅胶、氧化铝、磷酸钙、活性白土和羟基磷灰石；常用羟基磷灰石,;,带正电,稳定范围,pH5.5-10,吸附量,1mg/g,湿剂,10,.,纸层,11,.,薄层,12,.,3,）,离子交换层析,（,ion exchange chromatography,）,：交换剂上带电荷，可根据样品的电荷予以分离,a,）阳离子交换层析,b,）阴离子交换层析,c,）离子交换剂的类型：离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶,d,）实验室常用的离子交换剂：阴离子交换剂,DEAE-Cellulose,、,DEAE-Sephadex,；阳离子交换剂,CM-Cellulose,、,CM-Sephadex,e,）离子交换剂的预处理：去杂质；溶胀；除小颗粒；改型,阳离子交换剂：,碱,水,酸,水,平衡,阴离子交换剂：,酸,水,碱,水,平衡,13,.,f,）柱层析：床体积等于,2-5,倍束缚样品需要量；,径,高,=115,；,上样量不超过柱体积的,10%,（,*,注意上样方法）；洗脱方法有两种,不连续梯度洗脱和连续梯度洗脱；分布收集器收集每管,2-3ml,g,）交换剂后处理：饱和,NaCl,水,酸或碱,水,平衡,14,.,连续梯度洗脱,梯度混合器,15,.,离子交换层析,阳离子交换剂,阴离子交换剂,16,.,Anion exchange chromatography,17,.,4,）,凝胶层析（分子筛层析）（,gel filtration chromatography,）,：根据分子量大小予以分离,a,）凝胶预处理：凝胶,浸入洗脱液,轻轻搅拌,加热,90-100,（水浴加热）,b,）层析柱准备：,2.5100,柱；稠胶灌柱；,2-3,个床体积的缓冲液平衡；流速,16-18ml/h,c,）层析：兰葡聚糖（分子量,210,6,）验柱并求外水体积（,V,0,）；上样量,1-5%,；,恒压洗脱；流速,16-18ml/h,d,）凝胶后处理：,0.5N NaOH+0.5N NaCl,处理后,4,保存,长时间不用可采用乙醇脱水保存或低温干燥保存,18,.,凝胶过滤层析原理图,19,.,Gel filtration chromatography,20,.,5,）,亲和层析,（,affinity chromatography,）,特异性结合,a,）关键：配体；配体与支持物的连接方法；吸附、洗脱条件,b,）支持物的选择：非特异性吸附作用低；液体流动性好；较宽的,pH,、离子强度；丰富的化学基团；有效的多孔性,常用琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶和受控多孔玻璃球,c,）配体的选择：有亲和力但不易过大,d,）配体与支持物的连接：载体结合法；物理吸附法；交联法；包埋法（先活化支持物上的功能基团再将配体连上去）,e,）,吸附剂的衍生物：支持物,+,空间臂,f,）,层析条件的选择：蛋白质,+,配体 蛋白质,-,配体复合物,起初配体浓度恒定，随蛋白浓度增加平衡右移（逐渐保留特性），故亲和力较低也能成功的亲和。,g,）洗脱：更高亲和力的物质置换；剧烈改变环境条件,21,.,亲和层析原理,22,.,Affinity chromatography,23,.,二、,超离心技术,利用物质的沉降系数、质量、浮力因子等方面的差别用强离心力进行分离,F=,w,2,r,（,F,相对离心力,RCF,；,RCF,以,g,的倍数表示）,RCF=,w,2,r/980,w=,(,转数,/,分）,/30,RCF=1.11910,-5,r(,转数,/,分,),2,离心机：,a),桌式：,3000,转,/,分 红血球、酵母细胞等粗沉淀物,b),高速离心机：,20000,25000,转,/,分 一般实验使用但病毒、小细胞器或单个分子不能沉降,c),超速离心机：,75000,转,/,分 分子生物学必备；能分级只有在电镜下才能看得见的亚细胞器,24,.,二、电泳（,electrophoresis,）技术,1,）,原理：,M=d L/E t,M:,迁移率,L:,颗粒泳动距离,t:,通电时间,E:,电势差,迁移率与下列因素有关：,a,）样品带电状态、分子形状与大小,b,）电场强度,c,）缓冲液,pH,的和离子强度,d,）支持介质的阻力、吸附作用,2,）电泳类型：,a,）纸电泳,b,）醋酸纤维薄膜电泳,c,）琼脂糖电泳,d,）聚丙烯酰胺凝胶电泳,25,.,PAGE,和,SDS-PAGE,聚丙烯酰胺凝胶电泳：,Acr+Bis,；,TEMED,，,0.4%,；过硫酸胺,0.01-0.03%,；,等电聚焦,(isoelectric focusing),：两性电解质在电场作用下建立一个,pH,梯度分离蛋白质,电泳检测：,a,）考马斯亮兰（氨基黑）染色法,b,）荧光染色法,c,）特异酶检测,d,）其他染色法,26,.,盘状电泳（,A,）和平板电泳（,B,）,27,.,第四节,提纯过程中的定量,蛋白质浓度：,1,）双缩脲法：,Cu,+,与肽键及酪氨酸残基络合显色；测定浓度,0.5-10mg/ml,2,）,Lowry,法：双缩脲法的改进，,Cu,+,与蛋白质在碱性溶液中络合，此络合物还原,Folin,试剂，测定浓度,20-400g/ml,3),紫外吸收法：,Tyr,、,Trp,、,Phe,在,280nm,有最大光吸收，此方法因上述三种氨基酸含量不同测定结果有误差,测定浓度,0.1-0.5mg/ml,4,）,Bradford,法,:,该法是根据蛋白质与考马斯亮蓝（,coomassie brilliant blue,）结合产生的蓝色物质在,595nm,有最大光吸收来测定蛋白质浓度的。该方法简单、快速、可靠、灵敏度高，可测定,1-10,m,g,的蛋白质。,酶活力：检测目的酶的活力,目的蛋白（非酶）检测较困难,28,.,纯化倍数,=,回收率,%=,100,29,.,酶的提纯过程记录格式,步骤,总体积（,ml,）,蛋白总量（,mg,）,总活力（,u,）,比活力（,u/mg,）,回收率,（,%,）,提纯,倍数,粗抽提液,50,热变性除杂,硫铵分级沉淀（,30%-50%,）,DEAE-,纤维素,离子交换,凝胶过滤,SephadexG-100,1000,1000,250,25,10,12000,8000,750,35,9.2,5000,48000,2730,1820,1700,0.416,0.80,3.67,52,185,100,96,55,36.4,34,1.00,1.44,8.83,125,444,30,.,第五节,酶蛋白分子量的测定,渗透压法,超速离心法,凝胶层析法,SDS-,聚丙烯酰胺电泳法,31,.,渗透压法,M,为蛋白质的摩尔质量（分子量），,R,为气体常数（,0.082,升,大气压,/,摩尔,/,度），,T,为绝对温度。为了测定蛋白质的分子量，分别取几个不同的蛋白质浓度,c,，测出对应的渗透压,，然后以,/c,对,c,作图，并作延长线外推至,c=0,，得到的,y,轴截距即为,lim/c,的值，代入上式可求得分子量,M,。,渗透压法适合测定分子量范围在,10,000,100,000,的蛋白质。其优点是实验装置简单，测定也较为准确；缺点是要求蛋白样品纯度高，否则测出的将是溶液中各种蛋白的平均分子量。,32,.,超速离心法,M,：分子量,S,：沉降系数,R,：气体常数,T,：绝对温度,D,：扩散系数,：溶质分子微分比容,：介质密度,33,.,SDS-,聚丙烯酰胺电泳法,M,被测蛋白分子量,a,，,b,常数，用已知分子量蛋白作标准曲线求得,de,酶蛋白的泳动距离,do,小分子染料的泳动距离,亚基分子量,34,.,SDS-PAGE,的分子量标准曲线,35,.,凝胶层析法,M,被测蛋白分子量,a,，,b,常数，用已知分子量蛋白作标准曲线求得,Ve,酶蛋白洗脱体积,Vo,空体积（可用蓝葡聚糖求得）,36,.,凝胶过滤分子量标准曲线,37,.,思考题,下表是一种酶的各个纯化步骤的总蛋白和总活性单位数。,从表中给出的信息计算每一纯化步骤得到的酶溶液的比活；,哪一纯化步骤最有效（即相对纯度增加最大）；,哪一纯化步骤效率最低？,按照表中的,6,个步骤纯化的酶是纯化的酶，表中结果是否有指示？有没有别的方法评价酶的纯度？,38,.,39,.,作 业,请说明酶纯化过程中常用的分离技术。从肝细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液,300mL,含有,150mg,蛋白质，总活力为,360,单位。经过一系列纯化步骤以后得到的,4mL,酶制品（含有,0.08mg,蛋白），总活力为,288,单位。整个纯化过程的收率是多少？纯化了多少倍？,40,.,后面内容直接删除就行,资料可以编辑修改使用,资料可以编辑修改使用,41,.,主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等,公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！,42,.,致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、,PPT,设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求,43,.,感谢您的观看和下载,The user can demonstrate on a projector or computer,or print the presentation and make it into a film to be used in a wider field,44,.,后面内容直接删除就行,资料可以编辑修改使用,资料可以编辑修改使用,45,.,主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等,公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！,46,.,致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、,PPT,设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求,47,.,感谢您的观看和下载,The user can demonstrate on a projector or computer,or print the presentation and make it into a film to be used in a wider field,48,.,