人类细胞质、RT-PCR的原理、方法、琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用.ppt

按一下以編輯母片標題樣式,按一下以編輯母片文字樣式,第二層,第三層,第四層,第五層,*,人类,细胞质、,RT-PCR,的,原理、方法、琼脂糖凝胶电泳结果分析及其,应用,分离提纯RNA的目的,分析不同发育时期基因的表达状况,获得新基因,研究基因的拼接,分析相应的蛋白产物,RNA,提取的原理,在哺乳动物,中,，,rRNA,占,总量的,80%-85%,，,tRNA,和,核内小,分子,RNA,占,10-15%,，而,mRNA,只占,1-5%,。,rRNA,由,28S,、,18S,、,5S,等几类组成，这些,RNA,分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行,分离,mRNA,分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数,mRNA,分子（除血红蛋白、有些组蛋白,mRNA,以外,）在,3,端存在,20-250,个多聚腺苷酸,(polyA),。利用此特点，用,oligo(dT),亲和层析柱,分离,mRNA,。,RNA,分离的最关键因素是尽量减少,RNA,酶的污染。但,RNA,酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性,RNA,酶外，环境中也存在大量,RNA,酶。因此在提取,RNA,时，应尽量创造一个无,RNA,酶的环境，包括去除外源性,RNA,酶污染和抑制内源性,RNA,酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（,DEPC,）去除外源性,RNA,酶，通过,RNA,酶的阻抑蛋白,Rnasin,和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性,RNA,酶,。,1,、异硫氰酸胍法：,GuSCN,是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性,Rnase,的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总,RNA,。,特点：需低温操作，但价格经济。,2,、,Trizol,试剂,（商品化产品）,特点：在室温下可以提取细胞总,RNA,，,具有简单、快速、提取量大、纯度高的优点。,3,、,mRNA,提取试剂盒,真核细胞,mRNA,的,3,末端有,ploy(A),尾，利用寡聚,dT,纤维素结合,mRNA,，将其从细胞总,RNA,中分离出来。,RNA,提取的方法,Trizol,法,Trizol,是一种新型总,RNA,抽提试剂，可以直接,从细胞,或组织中提取总,RNA,。其含有苯酚、异硫氰酸,胍等,物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶,。在,破碎和溶解细胞时能保持,RNA,的完整性，因此对,纯化,RNA,及标准化,RNA,的生产十分有用。,Trizol,法,Trizol,的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制,RNA,酶活性，因此,Trizol,中还加入了,8,羟基喹啉、,-,巯基乙醇等来抑制内源和外源,RNase,。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，,RNA,选择性地进入无,DNA,和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收,RNA,；用乙醇沉淀中间层可回收,DNA,；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质,。,Trizol,法,Trizol,试剂可用于小量样品（,50100mg,组织、,5,106,细胞）也适用于大量样品（,1g,组织、,107,细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总,RNA,无蛋白质和,DNA,污染，可用于,Northern blot,，,dot blot,，,ployA,筛选，体外翻译，,RNase,保护分析和分子克隆。,RNA提取的一般步骤,破碎组织,分离RNA,沉淀RNA,洗涤RNA,融解RNA,保存RNA,1,、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行,可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织,加入-ME可以抑制RNA酶活性,2,、分离RNA,一,半用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开,。,3,、,沉淀RNA,一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇,。,4,、,洗涤RNA,使用70乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。,5,、,融解RNA,一般使用TE,(,缓冲液）,。,6,、保存RNA,应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存也应该如此。,琼脂糖凝胶电泳的原理,琼脂糖凝胶电泳主要是应用琼脂糖凝胶作为支,持物的电泳法，借助琼脂糖凝胶的分子筛,作用核,酸片段因其分子量或者分子形状的不同，,电泳度,有差异而分离，这种技术是基因操作中常用,的种,方法。,琼脂糖凝胶电泳的应用,分离不同片段大小和不同构象的,DNA,、,RNA,分子,鉴定,DNA,的片段，如,PCR,产物的鉴定,纯化,DNA,分子,2025/5/11 周日,琼脂糖凝胶电泳,凝胶准备,胶床准备,铺胶,静置,胶床置于电泳槽中,加电泳缓冲液,拔梳子,上样,电泳,取出凝胶,拍照,2025/5/11 周日,人类细胞质,RNA,提取,完整的,RNA,的电泳可明显地观察到,28S,和,18S,两条带，并且,28S,大约是,18S,的两倍宽。,若两条带不明显,则说明,RNA,部分降解,可能的原因是,RNase,。,RNA,电泳结果,rRNA,可以作为内部,Marker,分子，通过观察,rRNA,的两条带（,28S,和,18S,）的比例，可以判断所提取,mRNA,是否存在降解。,RNA,电泳并不能判断,mRNA,是否提取成功，也不作为鉴定,RNA,提取质量的常规方法，因为,在电泳过程中,RNA,可能发生降解,。,RT-PCR,RT-PCR,：逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse,transcription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的,一种,广泛应用的变形,。是一快速、简便、敏感性极高的检测,RNA,的方法。,RT-PCR,的原理,提取组织或细胞中的总,RNA,，以其中的,mRNA,作为模板，采用,Oligo,（,dT,）或随机引物利用逆转录酶反转录成,cDNA,。再以,cDNA,为模板进行,PCR,扩增，而获得目的基因或检测基因表达。,RT-PCR,的应用,分析基因的转录产物,获取目的基因,合成,cDNA,探针,构建,RNA,高效转录系统,2025/5/11 周日,RT-PCR,的步骤,提取原理,、方法,逆转录酶、引物,提 取,总,RNA,合成,cDNA,原理体系,引物选择,PCR,电泳原理,电泳步骤,电 泳,提 取,总,RNA,合成,cDNA,PCR,电 泳,逆转录酶：,存在于逆转录病毒体内。常见有哺乳动物型,37,o,C,，禽类型,42,o,C,。,以,mRNA,为模板的,DNA,聚合酶，形成与,RNA,碱基相互补,DNA,链，后者称为互补,DNA,cDNA,。,逆转录反应,(RT),AAAAAA(n),mRNA,AAAAAA(n),3,-,TTTTTT(18)-5,68-70,o,C,annealing,AAAAAA(n),3,-,TTTTTT(18)-5,37-42,o,C,RTase,mRNA,mRNA,cDNA,10min,1-2h,RT,RT-PCR,的逆转录酶,逆转录酶（,reverse transcriptase,）是存在于,RNA,病毒体内的依赖,RNA,的,DNA,聚合酶，至少具有以下三种活性：,1,、依赖,RNA,的,DNA,聚合酶活性：以,RNA,为模板合成,cDNA,第一条链；,2,、,Rnase,水解活性：水解,RNA,杂合,体中的,RNA,；,3,、依赖,DNA,的,DNA,聚合酶活性：以第一条,DNA,链为模板合成互补的双链,cDNA.,常用的逆转录酶有两种：鸟类成髓细胞性白血病病毒（,AMV),反转录酶,莫罗尼鼠类白血病病毒（,MMLV),反转录酶,合成,cDNA,引物的选择,1,随机六聚体引物：当特定,mRNA,由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长,mRNA,。用此种方法时，体系中所有,RNA,分子全部充当了,cDNA,第一链模板，,PCR,引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的,cDNA,中,96%,来源于,rRNA,。,合成,cDNA,引物的选择,2,Oligo(dT),：是一种对,mRNA,特异的方法。因绝大多数真核细胞,mRNA,具有,3,端,Poly(A+),尾，此引物与其配对，仅,mRNA,可被转录。由于,Poly(A+)RNA,仅占总,RNA,的,1-4%,，故此种引物合成的,cDNA,比随机六聚体作为引物和得到的,cDNA,在数量和复杂性方面均要小,。,合成,cDNA,引物的选择,3,异性引物：最特异的引发方法是用含目标,RNA,的互补序列的寡核苷酸作为引物，若,PCR,反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与,mRNA3,端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的,cDNA,，导致更为特异的,PCR,扩增。,PCR,PCR,技术,(olymerase chain reaction),：即聚合酶链式反应。,在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于,DNA,聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：,A,、变性：通过加热使,DNA,双螺旋的氢键断裂，形成单链,DNA,；,B,、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。,C,、延伸：在,DNA,聚合酶和,dNTPs,及,Mg,2,存在下，退火引物沿,5 3,方向延伸。,以上三步为一个循环，如此反复。,PCR产物在琼脂糖凝胶上的,电泳检测,在基因组DNA的提取中，用蒸馏水溶解提,取出的DNA，在1.0%的琼脂糖胶进行电泳，以,Marker(分子质量标准)作为参照，用5V/cm的电泳30-60分钟，最后采用EB溶液进行染色后在凝胶成像系统中进行观察拍照。,结果初步分析,数量分析：条带的宽度，,荧光的亮度。,质量分析：纯度,分子量,谢 谢,