ITS测序PPT文档.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,利用,ITS,序列鉴定未知真菌,温永芳,2015.6.12,1,1,：,ITS,鉴定原理,2,：,PCR,原理,3,：电泳原理,4,：具体操作,目录,2,微生物鉴定,生理生化,形态学鉴定：菌落形态、孢子形态等,分子鉴定,细菌：,16s rDNA,真菌：,ITS,序列,3,一、,ITS,（,Internal Transcribed Spacer,）,鉴定是指对,ITS,序列,进行,DNA,测序,，通过将测序得到的,ITS,序列与已知真菌,ITS,序列比较，从而获得未知真菌种属信息的一种方法,ITS,序列,利用真菌,rDNA,上的,5.8s,，,18s,和,28sr,DNA,序列,之间的,转录间隔,5.8s,，,18s,和,28sr,DNA,序列,进化上高度保守，而,ITS,序列由于选择压力小，在自然中变异较快，在绝大多数真菌中表现出序列,多态性,，表现为,种内相对一致，种间差异比较明显,，非常适合真菌鉴定以及,系统发育,分析。,4,二、,PCR,原理,PCR,（,Polymerase Chain Reaction,）即聚合酶链式反应，是指在,DNA,聚合酶催化下，以母链,DNA,为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板,DNA,互补的子链,DNA,的过程。,是一项,DNA,体外合成放大技术,，能快速特异地在体外扩增任何目的,DNA,。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。,5,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（）,PCR,的基本原理,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复,13,步,2530,轮,目的,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,单链,与引物复性,DNA,变性,形成,2,条单链,子链延伸,DNA,加倍,6,DNA,分子在高于等电点的,PH,溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定电场强度下，,DNA,分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。,三、琼脂糖凝胶电泳原理,7,*提取微生物样品,DNA*,扩增出真菌,ITS,区序列*,DNA,测序,，将样品序列与,GenBank,中已知序列进行比对*判定微生物种类，可将微生物划分到属或种*与同源性较高菌种构建,系统发育树,鉴定步骤包括：,8,在,PDA,上培养七天的未知真菌一株,实验材料,9,离心机,水浴锅,研钵,微量移液器,仪器用具,10,电泳仪器和试剂,电泳仪、电泳槽、灌胶模具等,琼脂糖、,TEV,缓冲液、样品缓冲液,11,CTAB,法,CTAB,是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的,DNA-,蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使,DNA,与蛋白质分离。,CTAB,提取缓冲液：,2%W/V CTAB;100mM Tris-Cl pH 8.0;20mM EDTA,pH 8.0;1.4M NaCl,一、真菌基因组,DNA,提取,12,（,1,）取真菌菌丝,0.2g,，用液氮研磨充分，装入含有,0.5mL,预热的,CTAB,提取缓冲液的,1.5mL,离心管中,迅速混匀,在,65,水浴中保温,1h,期间不定时摇匀；,（,2,）放置室温，加入等体积酚,-,氯仿,-,异戊醇,(V/V:25241),轻柔混匀，,4,、,7500g,离心,10min,；,抽提去蛋白,（,3,）取上清加入,0.6,倍体积异丙醇，室温下静置,15min,；,沉淀核酸,（,4,）,4,10000g,离心,15min,，取沉淀，用,75%,乙醇洗,2,次，无水乙醇洗一次，真空干燥,5min,；,（,5,）将沉淀溶解在,200L pH8.0 TE Buffer,中,。,注：酚,-,氯仿,-,异戊醇于棕色瓶中,4,保存。,DNA,提取操作步骤,13,二、,PCR,加样体系,真菌,DNA,模版,2L,10buffer,2.5L,MgCl,2,（,25mM,）,2L,dNTP（各2.5mM）,2L,上游引物,ITS1（10M）,1L,下游引物,ITS4,（,10,M,）,1L,rTaq,酶（,5U/L,）,0.3L,ddH,2,O,14.2L,总体积,25,L,14,PCR,反应条件,94,预变性,4min,；,94,变性,1min,50,退火,1min,72,延伸,1min,72,总延伸,10min,；,10,保温。,32,个循环,15,1.,凝胶制备,制备,1.0%,琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加入,20mL 0.5TBE,，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至,50-60,时，缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。,2.,加样,取,10,l DNA,样液与,2,l,上样,buffeer,混匀，用微量移液器小心加入样品槽。,3.,电泳,接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为,15V/cm,（长度以两个电极之间的距离计算）,待溴酚兰移动到一定位置，停止电泳。,4.EB,染色,5.,观察拍照,三、琼脂糖凝胶电泳,16,17,泳道,1,：,DL2000,泳道,2,：,PCR,产物,18,ITS,测序结果,1 TCCGTAGGTG AACCTGCGGA AGGATCATTA CCGAGTGCGG GTCCTTTGGG CCCAACCTCC,61 CATCCGTGTC TATTATACCC TGTTGCTTCG GCGGGCCCGC CGCTTGTCGG CCGCCGGGGG,121 GGCGCCTTTG CCCCCCGGGC CCGTGCCCGC CGGAGACCCC AACACGAACA CTGTCTGAAA,181 GCGTGCAGTC TGAGTTGATT GAATGCAATC AGTTAAAACT TTCAACAATG GATCTCTTGG,241 TTCCGGCATC GATGAAGAAC GCAGCGAAAT GCGATAACTA ATGTGAATTG CAGAATTCAG,301 TGAATCATCG AGTCTTTGAA CGCACATTGC GCCCCCTGGT ATTCCGGGGG GCATGCCTGT,361 CCGAGCGTCA TTGCTGCCCT CAAGCCCGGC TTGTGTGTTG GGTCGCCGTC CCCCTCTCCG,421 GGGGGACGGG CCCGAAAGGC AGCGGCGGCA CCGCGTCCGA TCCTCGAGCG TATGGGGCTT,481 TGTCACATGC TCTGTAGGAT TGGCCGGCGC CTGCCGACGT TTTCCAACCA TTTTTTCCAG,541 GTTGACCTCG GATCAGGTAG GGATACCCGC TGAACTTAAG CATATCAATA AGCGGAGGA,登陆,Genbank blast,在线比对,19,序列比对分析,20,谢谢！,21,