胚胎干细胞的研究进展及其应用教学教程.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,胚胎干细胞的研究进展及其应用,胚胎干细胞（,Embryonic stem cells,，,ES,细胞）是一种从早期胚胎内细胞团（,Inner cell mass,，,ICM,）或原始生殖细胞（,primordial germ cells,，,PGCs,）经体外分化、抑制培养、分离和克隆得到的具有发育全能性的细胞。目前，,ES,细胞已经引起广大学者的注意和兴趣，对,ES,细胞的研究也取得了很大进展。,1.ES,细胞的研究概况,ES,细胞研究，首先源于畸胎瘤细胞（,Teratocarcinoma stem cell,）或胚胎瘤细胞（,Embryonic carcinoma cell,，,ES,细胞）。,1958,年，,Steven,通过把小鼠早期胚胎移植到,129,小鼠精巢或肾脏被膜下得到了,EC,细胞,1,。随后，,EC,细胞常被用以研究哺乳类动物发育和遗传以及细胞诱导分化的实验模型，通过各种诱导因子和实验条件，成功地诱导出神经细胞、肌肉细胞、软骨细胞和上皮细胞等包括三个胚层在内的各种类型的分化细胞。,1974,年，,Brinster,把,EC,细胞注射到胚泡腔后，,EC,细胞参与受体胚胎的发育，从而得到了嵌合体。,1981,年，,Mintz,等培养的,METT-1,系,EC,细胞具有与生殖腺嵌合的能力,2,。但是由于,EC,细胞种系间的嵌合率低，仅有,13%,，而且,EC,细胞具有肿瘤源性，生成的嵌合体到了成年又出现肿瘤，建成的,EC,细胞系有异常核型。因此,EC,细胞作为研究正常细胞分化的模型并不理想。,1981,年,，,Evans,和,Kaufman,首先在,EC,细胞研究的基础上，通过对延迟着床的小鼠早期胚胎进行体外培养，首次分离得到,小鼠,ES,细胞，并以两个人名字的开头字母命名为,EK,细胞，并建立了,ES,细胞系,3,。随后，,人们相继建立了其它动物的类,ES,细胞,。,Doetschman(1988),、,Piedrahita(1990),建立了仓鼠的,ES,细胞系。,Notarianni(1990),、,Piedrakita(1990),、,Strojek(1990),、,Anderson(1990),和,Wheeler(1994),各自成功的建立了猪的类,ES,细胞系；,Sukoyan(1992),建立了水貂的类,ES,细胞系。,Saito(1992),、,Strelchenko(1994),和,Stice(1993),建立了牛的类,ES,细胞系，,Sims(1993),对,ES,细胞进行核移植，得到四头犊牛，,Cibelli,用转基因技术得到了生殖系嵌合体牛。,Craves(1993),、,Niemann(1994),建立了兔的类,ES,细胞系。,Tsuchiya(1994),、,Meinecke,、,Tillmann(1996),建立了绵羊,ES,细胞系，,Campbel,于,1996,年对绵羊,ES,细胞系进行核移植，得到了四只羔羊。,Bongso(1994),、,Meineke-Tillmann(1996),建立了山羊的类细胞系。,1994,年，,Bonso,建立了人的类,ES,细胞系，,1998,年，,Tillhomoson,等建立了人的类,ES,细胞系，并进行了鉴定，,其中，,H9,株传,32,代，并能成功地进行冷冻和解冻。该细胞的核型正常，,AKP,、,SSEA-3,、,SSEA-4,、,TRA-1-60,、,TRA-1-18,染色均为阳性，体内体外分化试验证明具有多能性,4,。,我国尚克刚（,1989,，,1993,，,1994,），丛笑倩（,1990,）,也分别建立了小鼠的,ES,细胞系,，并得到了嵌合体小鼠。,1991,年，陈立人建立了小鼠和猪的类,ES,细胞系。,1995,年，赖学良建立了兔的,ES,细胞系，并得到了一只皮毛嵌合体小鼠。,1999,年，张学明对利用小鼠胚胎成纤维细胞制作饲养层进行了研究，发现了,2,日龄到,13,日龄之间的小鼠胚胎最适于分离小鼠原代胚胎成纤维细胞,5,西北农业大学,，,从,1994,年开始，用早期,胚胎相继分离克隆出的类,ES,细胞，最多传五代（,1995,，,1997,，,1999,）；牛的类,ES,细胞，最多传六代（,1995,，,1998,，,1999,）；小鼠的类,ES,细胞，最多传九代；,1997,年用分离流产胎儿原始生殖细胞克隆出人的类,ES,细胞，最多传六代；,1999,年分离克隆出牛的类,ES,细胞，传,15,代，并进行了冷冻保存,6,。特别是近几年来，由于对人的类,ES,细胞的研究取得了很大进展，国内外掀起了一股,ES,细胞的研究热潮。,2.ES,细胞的形态学特征及基本特征,2.1ES,细胞的形态学特征,ES,细胞核大，胞质胞浆少，细胞界限不明显。体外培养时，细胞排列紧密，呈集落状生长，边缘折光性强，集落边缘可见有少量的已经分化为扁平上皮细胞或梭形的成纤维细胞。用碱性磷酸酶染色法染色，,ES,细胞呈棕红色，而周围的成纤维细胞则呈淡黄色,7,。小鼠胚胎干细胞的直径在,7-18um,之间，猪、牛和羊的,ES,细胞颜色较深，直径为,12-18um,8,。总的来说，,ES,细胞具有与胚胎细胞相似的形态特征,。,2.2 ES,细胞的基本特征,2.2.1,全能性,ES,细胞的全能性（,totipotenty,），是指,ES,细胞在解除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力，即,ES,细胞发育成完整动物体的能力,。其实质是细胞基因组中决定蛋白质编码的所有基因按一定的时空顺序依此表达。,ES,细胞是能在体外大量增殖的全能性细胞,，可以为细胞的遗传操作和细胞分化研究提供丰富的实验材料。,ES,细胞全能性的检测方法是以胚胎干细胞进行细胞核移植。如果,ES,细胞能和去核的细胞融合发育成重构胚，而且经过胚胎移植，重构胚能发育形成个体，则表明,ES,细胞具有全能性。例如，,Campkell,将绵羊的类,ES,细胞注射到去核卵母细胞中，获得重构。重构胚经过胚胎移植，有活的羔羊产生，证明了绵羊的类,ES,细胞具有发育全能性,9,。,2.2.2,多能性,多能性（,Pluripotency,）是指,ES,细胞具有发育成多种组织的能力，参与部分组织的形成,。细胞多能性检测的方法很多，主要有：,1.,体外培养诱导分化试验 将,ES,细胞培养在不含分化抑制物的培养基上，可以形成类胚体（,Embryoid bodies,）。,2.,将,ES,细胞在特定培养基进行培养，定向分化成特定组织。例如，在含有白血病抑制因子（,LIF,）和维生素,A,酸（,RA,）的培养基可以分化形成体壁内胚层。,3.,将,ES,细胞悬液（,1-2,10,7,个,/ml,）注射入同原动物皮下，形成组织瘤，可以形成内胚层，中胚层，外胚层。,4.,胚胎嵌合法，将,ES,细胞与胚胎细胞共同培养或者将,ES,细胞注射入囊胚腔中，,ES,细胞就会参与多种组织发育。如,Kaufman,首次用小鼠,ES,与囊胚嵌合，获得了第一个生殖腺嵌合体小鼠，表明,ES,细胞具有发育多能性。,利用骨髓基质细胞或其条件培养液，可诱导,ES,细胞在体外分化为造血干细胞（,transforming growth factor B,，,TGF-B,）的,ES,细胞，在维甲酸（,RA,）培养液经悬滴培养形成抑胚体，再继续贴壁培养，可见拟胚体周围有许多由内皮细胞排列而成的辐射状血管样结构；,ES,细胞在,RA,与双丁酰基环腺苷磷酸（,dibutyryl cyclic adenosine monohosphate dBcAmp,）共同作用下，可以分化为神经胶质细胞；在,RA,诱导下，,ES,细胞可分化为肌细胞；,ES,或,EG,细胞经悬滴培养形成的拟胚体在二甲基亚砜（,DMSO,）、胰岛素，三碘腺原氨酸（,triiodofhgronine,）、胎牛血清或维甲酸（,RA,）的共同作用下可分化为脂肪细胞；,ROSAB-geo,基因传染的,ES,细胞在缺乏,G418,、含有,10%,小牛血清，,1umol/L,低塞米松（,dexamethason,）条件下可以分化成软骨细胞,10,。,此外，也可以通过测定时期专一性胚胎抗原（,stage-specific embryonic antigen SSEA,）,.,碱性磷酸酶（,AKP,）、,OCT-4,基因、端粒酶（,telomerase,）等发育全能性标志来确定。,ES,细胞表达,SSEA,，因此常用单克隆抗体,SSEA-1,检测,ES,和,EG,细胞表面抗原作为发育全能性的标志。,ES,和,EG,等未分化干细胞具有较,AKP,高的活性。而在已分化的细胞中，活性则明显降低。,OCT-4,是一种发育全能性的标志基因，在小鼠胚胎发育早期，生殖细胞谱系以及体外培养的多能干细胞都能特异性的表达,OCT-4,基因，而分化细胞则无,OCT-4,基因表达。端粒酶是一类核糖糖蛋白，与维持真核细胞染色体末端的端粒长度以及控制细胞寿命有关。人,ES,细胞端粒活性很高，而分化细胞则一般难以检测到其活性,11,。,3.ES,细胞系的建立概况及建系的技术要点：,3.1 ES,细胞系的建立概况,迄今为止，小鼠与人的,ES,细胞系已经成功建立，其他动物如仓鼠、猪、牛、水貂、兔、山羊的类,ES,细胞系也相继建立，在牛、兔上还得到了转基因嵌合体动物,12,。,3.2 ES,细胞建系的技术要点,ES,细胞建系的原理是将早期胚胎（桑椹胚或囊胚）或者是用外科手术法得到的内细胞团（,Inner cell mass,，,ICM,）或者原始生殖细胞（,primordial germ cells,，,PGCs,）与分化抑制物共同培养，使之增值而又保持未分化状态，这样代代相传，从而使数量有限的胚胎或者,PGCs,细胞能够成千上万倍地克隆。其建系的基本技术要点如下：,3.2.1,饲养层的制备及分化抑制物的选择 常用的饲养层是由小鼠成纤维细胞无限系（,STO,）或小鼠原始胚胎成纤维细胞（,PMEF,）制备而成，,STO,或,PMEF,经过丝裂霉素,C,等有丝分裂抑制剂处理后，与早期胚胎或,PGCs,共同培养后，,ES,细胞就可以分离出来了。,STO,和,PMEF,细胞可以分泌成纤维细胞生长因子,FGF,（,fibroblast growth factor,）、分化抑制因子,LIF(leukemiain hibitory factor),，这些因子有助于,ES,细胞增值，而且能抑制细胞的凋亡和分化。此外，也可以用绵羊、山羊的输卵管或子宫上皮、牛的颗粒细胞、子宫成纤维细胞等作为分化抑制培养基,13,。,3.2.2,早期胚胎及,PGCs,的选择和分离 以下早期胚胎都可以作为建立胚胎干细胞系的材料：小鼠的桑椹胚（,2,日龄），囊胚（,3,日龄）和延迟囊胚（,4-6,日龄）；猪的囊胚（,7-10,日龄）；绵羊的囊胚（,7-9,日龄）；山羊的囊胚（,7-8,日龄）；牛的桑椹胚（,6-7,日龄），囊胚（,7-8,）日龄；兔的囊胚（,4-5,日龄）；水貂的囊胚（,8-10,日龄）；仓鼠的囊胚（,3,日龄）。,3.2.3,早期胚胎及,PGCS,的培养和,ES,细胞的分离传代 将早期胚胎或,PGCs,置于饲养层或条件培养基上，在,5%CO,2,、,3739,条件下进行培养。培养液一般为,DMEM+15%,胎牛血清（,FCS,）。培养液中可添加多种细胞因子或分化抑制物，如分化抑制因子（,LIF,）、表皮生长因子（,EGF,）、胰岛素样生长因子（,IGF,）、,硫基乙醇（,mercaptoe thanol,）等。,进行体外培养时，当胚胎内细胞团,ICM,增殖后或,PGC,S,出现,ES,样克隆后即可传代。,ES,细胞的增殖速度很快，小鼠,ES,细胞每,7-8,小时倍增一次，猪类,ES,细胞每,20,小时倍增一次，羊类,ES,细胞，每,40-50,小时倍增一次，牛类,ES,细胞每,18-24,小时倍增一次,14,。传代时一般是用胰酶,EDTA,消化，在用微吸管或拨针将其打散成单个细胞，然后移入新的饲养层上，进行培养几天后，即可出现新的克隆点，在其分化之前可以再进行传代。,3.2.4ES,细胞的鉴定及保存,ES,细胞的鉴定方法主要有形态学鉴定，碱性磷酸酶（,AKP,）染色，表面抗原检测，核型分析，体外分化实验，嵌合体实验，核移植等。,ES,细胞保存方法一般是冷冻保存，比早期胚胎的冻存技术要简单一些。冷冻保护液一般为,DAEM+30%-50%NBCS,（新建牛血清）,+10%DMSO,（二甲基亚砜）。冷冻过程为：室温下平衡,10,分钟,10,冰箱,3-5,小时,-7,冰箱过夜第二天放入液氮中长期保存，也可以,-70,冰箱保存几个月。解冻一般在,37,水浴中进行，解冻后立即用新的培养液替换冷冻保护液，随后转入,CO,2,培养箱中进行培养,。,4.ES,细胞的应用及前景,ES,细胞特有的生物学特性,决定了其在生物学领域有着不可估量的应用价值,.,在进行,ES,细胞建系和定向分化的同时,在核移植,嵌合体,转基因动物研究等方面也进行了广泛的尝试,已经充分体现出,ES,细胞在加快良种家畜繁育,生产转基因动物,哺乳动物发育模型,基因和细胞治疗等方面有着广阔的应用前景,.,4.1 ES,细胞与动物克隆,ES,细胞具有可以无限地传代增殖，而且不改变其基因型和表现型的特点。如果以,ES,细胞作为核供体进行核移植,可以在短时间内获得大量基因型和表现型完全相同的个体。而且用,ES,细胞与胚胎进行嵌合克隆动物,可以解决哺乳动物远缘杂交的困难,生产出珍贵的动物,也可以进行异种动物克隆,有助于保护珍惜野生动物,.,自绵羊,“,多莉,”,出世后，许多科学家对体细胞克隆进行了大量的试验，并取得了成功。但是，尽管体细胞克隆与,ES,细胞克隆相比有着易于取材的特点，但是体细胞克隆也存在着不少缺点，如生理和免疫缺陷，目前体细胞克隆还不能完全代替,ES,细胞克隆。,4.2,基因载体,目前常用的生产转基因动物的方法是向受精卵中注射,DNA,，外源基因的整合、表达和筛选工作是在个体水平上进行的，不仅工作繁琐，周期长成功率低，产生的后代的遗传性状也常出现分离；而利用,ES,细胞作为基因载体，得到基因整合的细胞，将载体,ES,细胞直接进行核移植或者通过与胚胎嵌合获得嵌合动物，,ES,细胞在嵌合体中分化发育成全能性的生殖细胞，即可以得到携有目的基因的转基因动物。因为一个优良的,ES,细胞系不仅可以用于各种目的基因转化，用各种方法将外源,DNA,导入细胞，而且外源基因的整合数目、位点、表达程序以及稳定性等都可以在细胞水平上进行加工，筛选，在很大程度上加快了动物遗传工程的进程。现在已经有不少有关以,ES,细胞作为外源基因载体生产转基因动物的报道。,Hooper,用逆转录病毒,DNA,随机插入和同源重组法得到了次黄嘌呤,-,鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（,HPRT,）缺失的,ES,细胞系，并获得了,HPRT,缺失的嵌合体小鼠，建立了猪,TGF-B,1,cDNA,的,ES,细胞。曾讳清将,HGF,基因导入小鼠,ES,细胞，获得了转染,HGF,基因的,ES,细胞。,4.3,其他,在嵌合体动物中,ES,细胞能参于个体发育，并能产生包括生殖系在内的各种类型的细胞，表明,ES,细胞类似胚胎的,ICM,细胞，不仅具有发育全能性，而且持有对调节正常发育所有信号的反应能力。在特定的体外培养条件和诱导剂的共同作用下，,ES,细胞可以经过一定的前体细胞阶段，发育成属于三个胚层谱系的各种高度分化的体细胞，如神经细胞，肌肉细胞，白细胞，成纤维细胞等。因此,ES,细胞既可以作研究特定类型细胞分化的模型，研究某些前体细胞起源和细胞谱系演变的实验体系。又可以作为基因和细胞治疗的载体，使细胞工程学迈上一个新的台阶。,近几年来，胚胎工程技术、基因工程技术、组织工程技术与,ES,细胞研究的结合已经成为现实，将使相关的基础学科研究以及医药业、畜牧业等发生重大变化，走向一个新的时代,。,