QPCR技术细节.ppt

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,程涛,中国科学院生物化学与细胞生物学研究所,细节决定成败,QPCR,的技术细节对实验结果的影响,1,内容概要,荧光定量,PCR,的原理,荧光定量,PCR,的标记方法,实验流程及注意事项,荧光定量,PCR,解析方法,2,实时定量,PCR,技术：,利用,荧光信号的变化实时检测,PCR,扩增反应中,每一个循环扩增产物量的变化,，通过,Ct,值和标准曲线的关系对,起始模板,进行定量分析,与常规,PCR,技术比较：,对,PCR,扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，,无法对起始模板准确定量,，无法对扩增反应实时检测,荧光定量,PCR,原理,3,扩增曲线,荧光阈值,Ct,值,荧光定量,PCR,原理,4,在,PCR,反应中，,DNA,扩增过程遵循酶的催化动力学原理。,反应初期,，目的,DNA,片段呈,指数扩增,。随着目的,DNA,产物逐渐积累，在引物一模板与,DNA,聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增,DNA,片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“,平台期,”。到达平台期所需,PCR,循环次数取决于样品中模板的拷贝数、,PCR,扩增效率、,DNA,聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前，,TaqDNA,聚合酶一般要进行,25,次以上,PCR,循环。,多数情况下，平台期在,PCR,反应中不可避免。,PCR,产物的积累规律,5,PCR,产物的积累规律示意图,6,荧光定量,PCR,定量原理,扩增曲线,7,荧光定量,PCR,定量原理,为什么终点定量不准确呢？,8,荧光定量,PCR,定量原理,尽管终点产物的量不恒定，但人们发现,Ct,（,cycle threshold,）,与模板起始浓度有密切联系。,9,Ct,值的定义：,PCR,扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,Cycle,（循环数）,Rn,（荧光强度）,Ct value,荧光定量,PCR,原理,Ct,值,10,前,15,个循环信号作为荧光本底信号（,baseline,）,荧光阈值的缺省设置是,3,15,个循环的荧光信号的标准偏差的,10,倍,手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段,真正的信号,:,荧光信号超过阈值,荧光定量,PCR,原理,荧光阈值,11,定量,PCR,的数学原理,12,定量,PCR,的数学原理,13,定量,PCR,的数学原理,14,定量,PCR,的数学原理,Cycle number,Ck 10,4,Ck 10,2,Sample,Log of DNA concentration,模板,DNA,量越多，荧光达到域值的循环数越少，即,Ct,值越小。,Log,模板起始浓度与,Ct,值呈线性关系。,15,线性关系、扩增效率确认,检测灵敏度确认,No Template Control(NTC),确认,PCR,扩增效率（,E,）,:0.9-1.1,35Cycles,内可得到好的定量结果,如果采用,SYBR,检测方法，,30Cycles,内无非特异性产物扩增,35 Cycles,内无引物二聚体产生,相关系数（,r,2,）：大于,0.98,荧光定量,PCR,反应性的确认,16,内容概要,荧光定量,PCR,的原理,荧光定量,PCR,的标记方法,实验流程及注意事项,荧光定量,PCR,解析方法,17,非特异性荧光标记,SYBR Green I,特异性荧光标记,TaqMan Probe,常用荧光标记方法,18,SYBR Green I,染料法,原理,SYBR Green I,是一种结合于所有,dsDNA,双螺旋小沟,区域的具有绿色激发波长的染料。,SYBR Green I,19,热 变 性,引物退火,延伸反应,SYBR Green I,染料法,作用机理,20,问题点：,SYBR Green I,与双链,DNA,进行结合后散发荧光，因,此如果反应体系中有,非特异性扩增,或,引物二聚体,的产生，,也将 同时被检测到，从而可能导致检测结果不准确。,SYBR Green I,染料法,问题点与关键点,关键点：,设计合适引物，防止非特异性扩增！,21,将温度与荧光强度的变化求导,(-dI/dT),原始图谱,对数图谱,SYBR Green I,染料法,融解曲线,22,融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光,定量准确,融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确,SYBR Green I,染料法,融解曲线,23,对,DNA,模板没有选择性,使用方便，不必设计复杂探针,具有价格优势,优 点,容易产生假阳性,对引物特异性要求较高,不能进行多重定量,缺 点,SYBR Green I,染料法,优缺点,24,Taqman,探针法,原理,5,端标记有报告基团,(Reporter,R),，如,FAM,、,VIC,等,3,端标记有荧光淬灭基团,(Quencher,Q),探针完整，,R,发射的荧光能量被,Q,基团吸收，无荧光，,R,与,Q,分开，发荧光,Taq,酶有,53,外切核酸酶活性，可水解探针,25,Taqman,探针法,工作机理,热变性,引物和探针与模板退火,延伸反应,探针,报告基团,淬灭基团,探针,DNA,聚合酶,引物,R,R,R,R,26,1,、引物、探针的设计：,探针,Tm,为,68-70,，,30 bp,5,不能有,G,，,G,可能会淬灭荧光素，,引物尽量靠近探针，扩增片段,400 bp,，引物,Tm,为,59-60,2,、反应参数的确定：,一般为：,94,，,10-20S,60,，,30-60S,（,Taq,酶,53,外切核酸酶活性在,60,最高），也可通过温度梯度优化退火温度,3,、优化引物和探针浓度：获得最小,Ct,值，最大信号,/,背景比值,引物浓度：,50-900nM,探针浓度：,50-250nM,4,、其他与常规,PCR,相同,Taqman,探针法,PCR,体系的建立,27,3,淬灭基团,淬灭基团性质,建议使用的,5,报告基团,TAMRA,荧光物质,FAM,HEX,TET,JOE,等,Eclipse,非荧光物质,FAM,HEX,TET,JOE,TAMRA,ROX,等,Taqman,探针法,荧光标记物的选择,28,高度特异性,重复性好,可进行多重定量,优 点,只适合一个特定的目标,委托公司标记，价格较高,不易找到本底低的探针,缺 点,Taqman,探针法,优缺点,29,不同定量方法的比较,方法,优点,缺点,适用范围,SYBR Green I,方法,适用性广,灵敏,方便,便宜,引物要求高,易出现非特异性带,不能进行多重定量,适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究,TaqMan,方法,特异性高,重复性好,多重定量,价格高,只适合特定目标,病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核,遗传疾病的诊断,30,荧光定量,PCR,的原理,荧光定量,PCR,的标记方法,实验流程及注意事项,荧光定量,PCR,解析方法,31,SYBR,法实验流程及注意事项,样品制备,模板准备,引物设计,反应条件优化,浓度确定,技能要求,环境要求,误差控制,数据分析,仪器软件,RT,上机,反应体系优化,试剂选择,分析方法,32,样品制备,环境要求,模板准备,数据分析,RT,上机,浓度确定,SYBR,法实验流程及注意事项,无,RNase,环境,使用无,RNase,耗材,专用,RNase-free,工具,高纯度，浓度均一的,RNA,分光光度计检测,电泳检测,33,RT,反应体系优化,试剂选择,样品制备,模板准备,数据分析,上机,AMV,M-MLV,Quant,Super,下游反应数确定反转录体积,选择应用引物,高效、全长的,cDNA,SYBR,法实验流程及注意事项,34,模板准备,引物设计,浓度确定,环境要求,误差控制,RT,样品制备,数据分析,上机,核酸制备区,反应液制备区,制作标准曲线,设定浓度区间,评价引物,使用,mix,降低系统误差,设置重复（,3,次）,设置空白和阴性对照,均一的反应液和模板混合物,GC,：,50,60,Tm,：,55,60,单个碱基重复,4,个,无二级结构,扩增长度：,50,150bp,引物位置,35,反应体系优化,上机,反应条件优化,RT,样品制备,模板准备,数据分析,反应体积,5ul,，推荐,20,50ul,Mg,2,调节，酶活调节,引物浓度优化，模板量优化,退火温度优化：梯度,PCR,延伸时间：产物长度决定,扩增效率：,90,110,重复性：,std,0.2,标准曲线：,R,0.99,或,R,2,0.98,SYBR,法实验流程及注意事项,标准品,待测样本,阳性对照,阴性对照,36,技能要求,误差控制,上机,试剂选择,RT,样品制备,模板准备,数据分析,自配,DBI Real mastermix,Roche-Lightcycler series,ROTOGEN-RG series,BIO-RAD Opticon series,ABI-7series,Bioer,Linegene series,分装控制,内参控制,机器校正控制,平滑曲线，重复性好，灵敏度高,SYBR,法实验流程及注意事项,37,45,o,C,55,o,C,65,o,C,溶解曲线,扩增曲线,1.95,o,C for 15 min,2.94,o,C for 10 sec,3.,Gradient from 45,o,C to 65,o,C for 15 sec,4.72,o,C for 30 sec,5.83,o,C for 1 sec,6.Plate Read,7.Go to line 2 39 more times,8.Melting curve from 65,o,C to 95,o,C,readevery 0.2,o,C,hold 1 sec.,Real-time PCR,体系优化,38,误差分析及操作规范,同一,cDNA,样品的三个重复,39,误差分析及操作规范,如图一系列梯度稀释的模板，理论上它们在扩增曲线上的,CT,值之差，应该相等，但是后边几个浓度低的样品,CT,值明显提前了，由熔解曲线可知对于浓度低的样品，引物二聚体引起的误差非常严重。,1.,模板浓度越低，染料法的误差越大,40,误差分析及操作规范,2.,某一孔荧光信号特别强,原因：试剂配制时反应液没完全溶化，导致探针量在一管中增多；,试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同；,也可能是,PCR,仪热槽被荧光物质污染，这时就要清除热槽中的污染；,41,3.,样品浓度跨度过大,样品浓度过高，至阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线，,误差分析及操作规范,42,4.,部分样本扩增效率过低,原因：提取液残留，一定程度抑制了,PCR,反应；反应液未严格取量混匀或分装不均匀；试剂失效；,误差分析及操作规范,43,5.,阴性对照或空白对照翘尾,原因：模板提取环境有污染；模板提取操作有污染；试剂配制过程存在污染；,误差分析及操作规范,44,6.,直线型扩增曲线,原因：探针部分降解（探针降解原因：,a.,探针反复冻融,稀释的探针可在,4,保存至少,3,个月，应避免反复冻融；,b.,探针在光线下暴露时间太长）；反应液中有,PCR,抑制物；,误差分析及操作规范,45,7.,山坡形曲线,原因：常因反应管封口不严，至反应液蒸发所致。,误差分析及操作规范,46,8.,扩增曲线断裂,原因：基线选取范围不对，基线终点大于,Ct,值，这通常是由于模板,DNA,浓度过高所致，,因,Ct,值,15,，而基线范围仍取,3,15,，其中包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值过高，解决办法：减少基线终点至,Ct,值前,4,个循环，重新分析数据,误差分析及操作规范,47,9.,基线下滑,原因：基线选取范围不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致；,误差分析及操作规范,48,10.,没有扩增曲线,原因：,PCR,参数设置错误，在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步，即,stage 1,阶段；电脑设定了自动休眠；,误差分析及操作规范,49,11.,扩增曲线有一向上或向下的尖峰,原因,：反应过程中电压不稳定；可能在,20,循环左右仪器有停下或者仪器有开盖，使得光线突然增强；如果尖峰向下，也可能是卤素灯老化所致，这时应更换；,误差分析及操作规范,50,数据分析,软件系统,分析方法,上机,RT,样品制备,模板准备,相对定量：,2,Ct,法,绝对定量：标准曲线法,可靠，准确的数据,SYBR,法实验流程及注意事项,51,内容概要,荧光定量,PCR,的原理,荧光定量,PCR,的标记方法,实验流程及注意事项,荧光定量,PCR,解析方法,52,绝对定量解析方法,53,Sample,25,绝对定量的定义,Log,（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系,根据样品,Ct,值，就可以计算出样品中所含的模板量,54,PCR,目的基因克隆,质粒提取，,OD,值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用,目的基因,目的基因,目的基因,质粒,目的基因,基因组,DNA,质粒标准品的制备,55,拷贝数的计算：,待测样本浓度（,ng/ul,）,OD,260,40,稀释倍数,样本分子量,=,碱基数,324,待测样本拷贝数（,copies/ul,）,=,待测样本浓度,/,样本分子量,610,14,倍比梯度稀释方法,：,1v,原液,(,标准品,i)+9v,稀释缓冲液，得标准品,ii,1v,标准品,ii+9v,稀释缓冲液，得标准品,iii,1v,标准品,iii+9v,稀释缓冲液，得标准品,iv,1v,标准品,iv+9v,稀释缓冲液，得标准品,v,质粒标准品稀释方法与拷贝数计算,56,方 法：,从组织中提取,RNA,并进行反转录，以,SYBR,法进行荧光定量检测,试 剂：,DBI,公司,SYBR realtime PCR,试剂,标准品：,质粒标准品浓度为,10,6,、,10,5,、,10,4,、,10,3,；,2,个重复；设阴性空白对照,实验步骤：,提取,RNA,并反转录；,设计特异引物；,荧光定量扩增；,结果分析：获取样品中目的基因的精确,copy,数。,绝对定量实验例,57,Sample,copies/ml,Ct1,Ct2,Mean Ct,STD,标准品,510,3,28.18,28.64,28.41,0.16,标准品,510,4,25.25,25.14,25.19,0.04,标准品,510,5,22.11,22.46,22.28,0.12,标准品,510,6,18.63,18.92,18.77,0.10,未知样品,?,20.56,20.45,20.5,0.05,空白对照,None,None,实验数据,绝对定量实验例,58,扩增效率（,E,）计算,E=10,-1/,斜率,1,=10,-1/-3.17,1,=2.03,1,1.03,标准曲线制作：,利用,Mean Ct,作图可得到标准曲线,y=-3.17x+37.52 R,2,=0.9988,绝对定量实验例,相关系数（,R,2,）：大于,0.98,，越接近,1,，结果可信度越高。,扩增效率（,E,）：,0.9-1.1,越接近,1,，越理想。,59,未知样品拷贝数的计算,将,Ct,值带入线性方程：,20.5=-3.1726 X+37.52,Quantity,Unknown,=10,5.36,=229087 copies,绝对定量实验例,X=,20.5-37.52,-3.1726,=5.36,60,相对定量解析方法,61,理论上目的基因表达量分析条件,Sample B,Sample A,目的基因扩增效率相同,RNA,提取效率相同,细胞起始数相同,实际目的基因表达量分析,相对定量的必要性,62,以上条件,不可能同时得到满足,，必须用内对照基因,（管家基因）,进行校正，进行相对表达量分析。,63,管家基因,维持细胞基本代谢活动所必须的基因,如：,GAPDH、Actin、18S rRNA,等,筛选方法,根据文献提供,通过具体实验筛选,相对定量分析,管家基因筛选,0,1,2,3,4,5,6,Sample1,Sample2,Sample3,Sample4,实验组,实验值,-Actin,GAPDH,-2-microglobulin,HPRT,P,P,P,O,64,双标准曲线法,2,-Ct,法,相对定量分析,两种常用的分析方法,65,通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。,相对值,=,校正值,=,目的基因定量结果,管家基因定量结果,待测样品的校正值,对照样品的校正值,相对定量分析,双标准曲线法,公式：,66,优点：分析简单，实验优化相对简单,缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线,应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一,相对定量分析,双标准曲线法,检测样品,管家基因,H,目的基因,X,定量结果,定量结果,校正值,相对量,对照样品,6391.5,343.4,0.0537,1.000,待测样品,1,8589.7,17.3,0.0020,0.037,待测样品,2,7432.9,1946.1,0.2618,4.874,实验数据,67,公式：,F=,2,相对定量分析,2,-Ct,法,优点：无需作标准曲线,缺点：假定扩增效率为,100%,；,假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致；,实验条件优化较为复杂,应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一,待测组目的基因平均,Ct,值,待测组管家基因,平均,Ct,值,对照组目的基因,平均,Ct,值,对照组管家基因,平均,Ct,值,68,实验数据：,Sample,处理前,处理后,Jun(MeanCt),GAPDH(MeanCt),E,18,16,17,17.4,1.95,1.95,2,-Ct,法：,假设目的基因和参照基因扩增效率都接近,100%,Ct,（处理前）,18,17,1 Ct,（处理后）,16,17.4=,1.4,Ct=Ct,（处理后）,Ct,（处理前）,1.4,1,2.4,比率,（处理后,/,处理前）,=2,Ct,2,（,2.4,）,=,5.3,所以,Jun,基因在处理后表达水平比处理前高,5.3,倍,相对定量分析,2,-Ct,法,69,70,71,发表文章,Activation of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-3 in Macrophages Restrains TLR4-NF-,B Signaling and Protects against Endotoxin Shock.,Immunity,.(2014)(,影响因子：,20.72,),HCV-Induced miR-21 Contributes to Evasion of Host Immune System by Targeting MyD88 and IRAK1.,Plos Pathog,.(2013)(,影响因子：,9.12,),Inhibition of Lysyl Oxidase Ameliorates Inflammation and Experimental Pulmonary Fibrosis.,J MOL CELL BIOL,.(2014)(,影响因子：,7.31,),Exogenous Melatonin Modulates Apoptosis in the Mouse Brain Induced by high-LET Carbon Ion Irradiation.,Journal of Pineal Research,.(2012)(,影响因子：,5.79,),Expression of CIP2A in Renal Cell Carcinomas Correlates With Tumour Invasion,Metastasis and Patients Suvival.,British Journal of Cancer,.(2011)(,影响因子：,5.08,),72,联系方式,程 涛,：,chengtao,27813517,张彦波,：,zhangyanbo,党希龙,：,1910961181,73,谢谢大家！祝大家实验顺利！,74,