6糖的提取分离、结构测定.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五节 糖及苷的提取分离,1,一、提取,单糖、低聚糖及苷类化合物,常用,水,或,醇,提取，然后用不同的有机溶剂萃取得到不同极性的化合物。,多糖,常用,热水,、,稀碱,或,稀酸,溶液进行提取。,植物体内苷常与水解酶共存，所以要,杀酶,或,抑制酶,的活性。,2,提取流程,3,二、分离,1.,季铵盐沉淀法,与酸性多糖形成不溶性沉淀，使其分离。,常用季氨盐有十六烷基,三甲胺溴化物,及其,氢氧化物,和,十六烷基吡啶,。,提高溶液,PH,值或加入硼砂缓冲液，也可沉淀分离中性多糖。,4,2.,分级沉淀或分级溶解法,按比例由小到大的顺序向多糖溶液中加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同浓度下析出的沉淀，反复溶解与沉淀。,为了多糖的稳定，一般在,PH7,时进行，酸性多糖在,PH2-4,时进行。,5,分级沉淀法得到的多糖，常含有较多的蛋白质，需将其去除,方法：,选择使蛋白质沉淀而不使多糖沉淀的试剂（如酚、三氯醋酸、鞣质等）处理,sevag,法,：（用,氯仿,:,丁醇,5:1,混合）,酶解法,：（蛋白水解酶，常与,sevag,法,合用）,三氟三氯乙烷法 三氯醋酸法,蛋白质的去除,6,3.,离子交换色谱,常用交换剂为阳离子或阴离子交换纤维素。,阳离子交换纤维素适用于分离酸性、,中性多糖,和粘多糖。,中性多糖,与,硼酸,络合后可增加,酸性,，可被阳离子交换纤维素吸附,酸性基团多的吸附力强，对于线性分子，分子量大的比小的吸附力强，直链分子比支链分子易吸附。,7,4.,凝胶柱色谱,分子筛,原理，按照分子量的大小不同进行分离。,常用葡聚糖凝胶（,sephadex G,）,5.,纤维素柱色谱,（吸附分配）,6.,制备性区域电泳,（分子大小、形状、电荷不同，在电场作用下 的迁移速率不同）,8,第六节 糖的核磁共振性质,9,一、糖的,1,H-NMR,性质,1.,1,H-NMR,化学位移,糖的,端基质子,信号在,4.36.0,甲基五碳糖的,甲基,信号在,1.0,左右,糖上,其余,质子信号在,3.24.2,之间。,10,2.,化学位移的应用,根据糖的,端基质子信号,的,个数,和,化学位移值,可推测连有糖的个数、糖的种类。,根据,甲基质子信号,的,个数,和,化学位移值,可推测甲基五碳糖的个数、糖的种类。,11,3.,偶合常数,质子的邻位偶合常数与,二面角,有关,两面角,90,度,J=0Hz,；,两面角,0,或,180,度,J=68Hz,；,两面角,60,度,J=24Hz,12,当,2-H,为直立键时,-D-,和,-L-,型糖的,1-H,和,2-H,键为双直立键，,=180,，,J=68Hz,13,-D-,和,-L-,型糖,1-H,为,e,键，,2-H,为,a,键，,=60,，,J=24Hz,14,如,D-,葡萄糖、,D-,半乳糖、,D-,阿洛糖的,2-H,均为,直立键,当其成,苷时，端基质子与,2-H,的,J,约为,4Hz,；,当其成,苷时，端基质子与,2-H,的,J,约为,8Hz,。,15,2-H,为,e,键,，,1-H,无论处于,e,键还是,a,键，与,2-H,的两面夹角均约,60,度,，不能用,J,判断苷键构型。如,D-,甘露糖,16,L-,鼠李糖,优势构象,为,1C,式，,2-H,为平伏键,，,1-H,与,2-H,的两面夹角约,60,度，所以苷键的构型不能,J,来,判断。,17,二、糖的,13,C-NMR,性质,1.,化学位移,CH,3,18ppm,甲基五碳糖的,C,6,CH,2,OH,62ppm,C,5,或,C,6,CHOH,6885ppm,糖氧环上的,C,2,C,4,-O-CH-O-,95105ppm,端基,C,1,或,C,2,环上的碳，带有,a-OH,的较带有,e-OH,的出现在较高场处（尤其是端基碳，但不适于甘露糖、鼠李糖的端基碳）；,18,D-,葡萄糖苷,C1,型,97101 ppm,型,103106 ppm,在,13,C-NMR,谱中：,19,2.,偶合常数,（吡喃糖中端基碳的,碳氢偶合常数,),吡喃糖中端基质子处于,横键（,a-D,或,-L,型苷键）时，其端基碳氢的偶合常数为,170175Hz,；,处于,竖键,（,-D,或,a-L,型苷键）时则为,160165Hz,。,鼠李糖相反（,1C,式）,20,3.,苷化位移,糖与苷元成苷后，,苷元,的,-C,、,-C,和糖的,端基碳,的化学位移值均发生了改变，称为,苷化位移。,21,如：,C1,位移,-D-,葡萄糖,96.7,甲基,-D-,葡萄糖苷,104.0 +8.3,-D-,半乳糖,97.3,甲基,-D-,半乳糖,104.5 +8.3,-L-,鼠李吡喃糖,95.1,甲基,-L-,鼠李糖苷,102.6 +7.5,22,醇型苷：,端基碳的,苷化位移,与苷元,醇羟基,种类有关,-Glc,-Glc,端基碳,C-1,C-1,伯 醇,100.0 +7.1 104.4 +6.7,仲 醇,98.5 +4.4 102.3 +3.5,叔 醇,94.6 +0.5 98.9 +0.1,伯醇,仲醇,叔醇,23,伯醇苷（,成苷后）,苷元,-C,向低场位移约,8,个化学位移单位,-C,向高场位移约,4,个化学位移单位,24,环醇苷,前手性碳：,对称碳原子增加一个取代基后，变为非对称碳，这样的碳原子称之为前手性碳,a.,两个,-C,均为仲碳,的苷,成苷后,-C,向低场,位移,7,个单位，端基碳向高场位移约,14,个单位（与甲苷比），,-C,的前手性构型与端基碳构型相同时，,向高场,位移约,2,个单位；不同时，向高场位移约,4,个单位。,同小异大：指,碳,25,b.,一个,-C,为仲碳，另一个为叔碳或季碳的苷,-C,与糖的端基碳构型相同时，,-C,向低场,位移约,5,个单位；不同时,-C,向低场,位移约,10,个单位。,-C,和端基碳的变化较复杂。,同五异十其余七指：,-C,26,叔醇苷,成苷后,-C,向,低,场位移约,7,个单位；,-C,向高场位移约,5,个单位。,酯苷和酚苷,苷元,-C,向高场,位移，区别于上述苷。,27,第七节 糖链的结构测定,28,一、纯度测定（多糖）,多糖纯品实质上是指一定分子量范围的均一组分。,测定方法：,超离心法、高压电泳法、凝胶柱色谱法、旋光测定法、官能团摩尔比恒定法等。,29,二、分子量测定,单糖、低聚糖及其苷的分子量测定主要采用,质谱法。,多采用化学电离质谱,(CI-MS),、场解吸质谱,(FD-MS),、快原子轰击质谱,(FAB-MS),和电喷雾质谱,(ESI-MS),等方法，,ESI-MS,及,FAB-MS,是目前测定苷类分子量常用的方法。,应用,甲基化法和过碘酸氧化法,进行的末端分析法也常用来推算多糖的分子量,30,三、单糖的鉴定,一般是将苷键全水解，用,PC,检出单糖的种类，糖类的,PC,常用的展开剂大多为含水的溶剂系统，如,正丁醇,-,醋酸,-,水,(4:1:5),，,EtOAc-,吡啶,-,水,(2:1:2),等，经显色后用薄层扫描法求得各种糖的分子比。,用,GC,或,HPLC,对单糖定性定量，,GC,常以甘露醇或肌醇为内标，用已知单糖作为对照品。,NMR,谱，也可以有效地鉴定苷分子中糖的种类。,31,四、糖的连接位置的测定,1.,甲基化法：,将被测物全甲基化，水解苷键，用,GC,定性定量分析，具有游离羟基的部位是糖的连接位点。,2.,1,H-NMR,法：,根据乙酰化后的质子化学位移判断糖的连接位点。,3.,13,C-NMR,法：,通过苷化位移，推断糖的连接位点。,32,五、糖链连接顺序的确定,1.,部分水解法：,将糖链水解成较小片段（低聚糖），然后分析片段推断糖链的结构。,2.,质谱法,根据质谱中的裂解规律和裂解碎片推测糖链的连接顺序。,3.NMR,和,2D-NMR,法。,33,2.,质谱法,FDMS,、,FABMS,等。,优点：不必制备衍生物,用量小,准确,简便。,34,是将糖及其苷类衍生物全乙酰化后，测定观察两糖之间质子的远程偶合或,NOE,效应，确定糖的连接顺序。,3.NMR,和,2D-NMR,法,。,通过,HMBC,可确定糖的连接位点。,35,六、苷键构型及氧环的确定,1.,苷键构型确定方法包括：,1,H-NMR,法、酶解法、分子旋光差法等。,1,H-NMR,法,1,利用端基质子的偶合常数,2,利用,-,苷键和,-,苷键的端基碳的化学位移差别,3,利用,2D-NMR,谱,酶解法,如麦芽糖酶一般能水解的为,-,苷键，能被苦杏仁苷酶水解的大多为,-,苷键,36,2.,氧环测定包括：,13,C-NMR,法、甲醇解法、,Smith,降解法等。,通常呋喃糖,C,3,和,C,5,位的化学位移明显偏大，多数,大于,80,37,复习题,糖的核磁共振性质,糖链的结构测定,38,