8-饮料中微生物检测(课堂PPT).ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第七章 微生物的测定,含在饮料的检测中,1,一、分类,碳酸饮料,(,品,)(,汽水,),类,果汁,(,浆,),及果汁饮料,(,品,),类,蔬菜汁及蔬菜汁饮料,(,品,),类,含乳饮料,(,品,),类,植物蛋白饮料,(,品,),类,瓶装饮用水类,茶饮料,(,品,),类,固体饮料,(,品,),类,特殊用途饮料,(,品,),类,2,总酸度、,pH,值、还原糖含量,食品中微生物的检测,细菌总数,大肠菌群数,食品添加剂的检测,甜味剂糖精钠、甜蜜素、安赛蜜、阿斯巴甜。,防腐剂苯甲酸、山梨酸,3,二、微生物检验,1,、细菌总数,菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后所得,1g,或,1ml,检样中所含细菌菌落的总数。它可以反应食品的新鲜度、被细菌污染的程度、生产过程中食品是否变质和食品生产的一般卫生状况等。因此它是判断食品卫生质量的重要依据之一。,4,流程,检样做成几个适当倍数的稀释液选择,2-3,个适宜稀释度各以,1mL,之量分别入灭菌平皿内每皿内加入,46,适量营养琼脂菌落数报告,5,（,1,）样品的无菌处理,以无菌操作，将检样,25g,（或,25ml,）剪碎以后，放于含有,225ml,灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预先置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成,1,：,10,的均匀稀释液。,固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以,8000r/min100000r/min,的速度处理,1min,，做成,1,：,10,的均匀稀释液。,6,（,2,）稀释、接种,用,1ml,灭菌吸管吸取,1,：,10,稀释液,1ml,，沿管壁徐徐注入含有,9ml,灭菌生理盐水或其他稀释的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液，下同），振摇试管混合均匀，做成,1,：,100,的稀释液。,7,琼脂培养基配方,蛋白胨,10 g,牛肉膏,3 g,氯化钠,5g,琼脂,15-20g,蒸馏水,1000ml,8,根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择,23,个适宜稀释度，分别在作,10,倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移,1ml,稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。,稀释液移入平皿后，应及时将凉至,46,营养琼脂培养基,可放置在（,461,）,0C,）水浴锅内保温,注入平皿,15ml,，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有,1ml,稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。,等琼脂凝固后，翻转平板，置（,361,）,0C,恒温箱内培养（,482,）,h,取出，计算平板内菌落数目乘以倍数，即得,1g,（,1mL,）样品所含菌落总数。,9,菌落计数方法,做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。,平板菌落数的选择,选取菌落数在,30,300,之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘,2,以代表全皿菌落数。,10,稀释度的选择,应选择平均菌落数在,30,300,之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。若有两上稀释度，其生长的菌落数均在,30,300,之间，则视两者之比如何来决定。若其比值小于或等于,2,，应报告其平均数；若大于,2,则报告其中较小的数字。,若所有稀释度平均菌落数均大于,300,，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。,若所有稀释度的平均菌落数均小于,30,，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。,若所有稀释度均无菌落生长，则以小于,1,乘以最低稀释倍数报告之。,11,简便方法：菌落总数测定纸,12,使用方法,13,2,、大肠菌群的测定,大肠菌群是指在,37,、,24h,能发酵乳糖，产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰式阴性无芽孢杆菌。,大肠菌群数以每,100ml,（,g,）检样中大肠菌群最可能数（,MPN,）表示。,14,流程,乳糖胆盐发酵管变黄浑浊，,15,培养基配方,乳糖胆盐发酵双料,:,(1),蛋白胨,40g,(2),牛胆盐,10g,(3),乳糖,20g,(4),蒸馏水,1000ml,(5),溴甲酚紫（,1.6g/t,）,2ml,(6)PH,值,7.2-7.4,乳糖发酵管,(1),蛋白胨,20g,(2),乳糖,10g,(3),蒸馏水,1000ml,(4),溴甲酚紫 （,1.6g/t,）,1ml,(5)PH,值,7.2-7.4,16,伊红美蓝培养基：,成分：,蛋白胨,10g,乳糖,10g,磷酸氢二钾,2g,琼脂,17g,2,伊红水溶液,20ml,0.65,美蓝水溶液,13ml,蒸馏水,1000ml,pH,为,7.1,制法：,将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于热蒸馏水中，校正,pH,，分装于烧瓶内，,121,高压灭菌,15min,备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至,50-55,，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。,17,伊红美兰琼脂平板,划线培养,大肠菌群的典型菌落,（,1,）深紫黑色，具有金属光泽的菌落,（,2,）紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落,（,3,）淡紫红色、中心色较深的菌落。,18,革兰氏染色阴性菌,19,纸片法,20,MPN,表,阴性管数 ,MpN 95,可信限,100 mL(g),1mL(g),，*,30.1mL(g)*30.0lmL(g)*3 ,下限上限,0 0 0 ,30 ,5 ,0 0 1 30 ,0 0 2 30 90 ,0 0 3 30 ,0 1 0 30 ,5 ,0 1 1 60 130,0 1 2 90 ,0 1 3 120 ,续表,阳性管数 ,MPN 95,可信限,100mL(g),1mL(g)3 0.l mL(g)x3 0.0lmL(g)X3 ,下限上限,0 2 0 60 ,0 2 1 90 ,0 2 2 120 ,0 2 3 160 ,0 3 0 90 ,0 3 1 130 ,0 3 2 160 ,0 3 3 190 ,1 0 0 40 ,5 200,1 0 1 70 10 210,1 0 2 110 ,1 0 3 150 ,1 1 0 70 10 230,1 1 1 110 30 360,1 1 2 150 ,1 1 3 190 ,1 2 0 110 30 360,1 2 1 150 ,1 2 2 200 ,1 2 3 240 ,1 3 0 160 ,1 3 1 200 ,1 3 2 240 ,1 3 3 290 ,2 0 0 90 10 360,2 0 1 140 30 370,2 0 2 200 ,2 0 3 260 ,2 1 0 150 30 440,2 1 1 200 70 890,2 1 2 270 ,2 1 3 34o ,21,革兰氏染色,革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：,1,）涂片固定。,2,）草酸铵结晶紫染,1,分钟。,3,）自来水冲洗。,4,）加碘液覆盖涂面染,1,分钟。,5,）水洗，用吸水纸吸去水分。,6,）加,95%,酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，,30,秒后水洗，吸去水分。,7,）蕃红梁色液（稀）染,10,秒钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。染色的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。,22,分光光度计使用方法,23,24,2,使用方法,（,1,）预热仪器 将选择开关置于“,T”,，打开电源开关，使仪器预热,20,分钟。为了防止光电管疲劳，不要连续光照，预热仪器时和不测定时应将试样室盖打开，使光路切断。,（,2,）选定波长 根据实验要求，转动波长手轮，调至所需要的单色波长。,（,3,）固定灵敏度档 使用时，调到“,1”,挡。,（,4,）调节,T=0%,轻轻旋动“,0%”,旋钮，使数字显示为“,00.0”,，（此时试样室是打开的）。,（,5,）调节,T=100%,将盛蒸馏水（或空白溶液，或纯溶剂）的比色皿放入比色皿座架中的第一格内，并对准光路，把试样室盖子轻轻盖上，调节透过率“,100%”,旋钮，使数字显示正好为“,100.0”,。,（,6,）吸光度的测定 将选择开关置于“,A”,，盖上试样室盖子，将空白液置于光路中，调节吸光度调节旋钮，使数字显示为“,.000”,。将盛有待测溶液的比色皿放入比色皿座架中的其它格内，盖上试样室盖，轻轻拉动试样架拉手，使待测溶液进入光路，此时数字显示值即为该待测溶液的吸光度值。读数后，打开试样室盖，切断光路。,重复上述测定操作,1-2,次，读取相应的吸光度值，取平均值。,（,8,）关机 实验完毕，切断电源，将比色皿取出洗净，并将比色皿座架用软纸擦净。,3,注意事项,（,1,）为了防止光电管疲劳，不测定时必须将试样室盖打开，使光路切断，以延长光电管的使用寿命。,（,2,）取拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，而不能碰比色皿的光学表面。,（,3,）比色皿不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗涤，也不能用毛刷清洗。比色皿外壁附着的水或溶液应用擦镜纸或细而软的吸水纸吸干，不要擦拭，以免损伤它的光学表面。,25,