真核转染稳定筛选标记及原理.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,真核细胞稳定转染筛选标记及原理,小组：周四班二组 组员：薛莹超（报告者）滕达 曾欣宜 席杰 赖惠英 邓宇星,1,外源基因表达的三个概念,转染,通过生化或者物理方法将目的基因导入真核细胞中。,分类,转导,通过病毒介导，用基因组中携带有克隆目的片断的病毒来感染靶细胞。,转化,通过生化或者物理方法将目的基因导入原核细胞中。,2,常用的真核表达系统,酵母表达系统,丝状真菌表达系统,昆虫表达系统,哺乳动物表达系统,3,转 染 方 法,4,理想的细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等特点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高,、,细胞毒性很低，,但,准备程序复杂，对细胞类型有很强的选择性很难普及。非病毒介导的转染技术中，以,阳离子非脂性物质为主的混合物配方,转染效率最高。该类转染具有广谱、细胞毒性小、性能稳定等特点，且不受培养液中的血清和抗生素的干扰，比脂质体介导的转染方法更方便,。,5,转染后的表达,1.瞬时表达,质粒转染到细胞中，一部分转运进入细胞核，进行转录输出mRNA进行蛋白质合成。几天内大部分的质粒都会被降解或传代而稀释。一周以后几乎检测不到。转染的质粒不整合到染色体上，出现短暂的（24-96h）高水平表达，依赖于质粒纯度、浓 度和转染效率。,6,2.,稳定表达,转染的质粒DNA整合到染色体上可以持续存在，转染的细胞可以长期表达。,整合的概率比较小，要获得稳定转染的细胞株需要筛选标记共同转染，通过选择压力维持表达稳定。需要长时间的抗性选择培养。,7,酵母表达系统常用的选择性标记,营养缺陷性酵母,trp1-，ura3-，his3-，leu2-，lys2-。,显性选择标记，用于野生型酵母菌的转染。G418筛选。,8,哺乳动物细胞,遗传性标记,胸苷激酶基因（tk）选择系统,二氢叶酸还原酶基因（dhfr）选择系统,黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶基因（,H,GPRT）选择系统,新霉素抗性基因（neo）选择系统,氯霉素乙酰转移酶基因（cat）选择系统,潮霉素抗性选择系统,9,细胞内DNA的合成途径,细胞的DNA合成有主要途径和旁路途径两种方式,1.主要途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸脲甘酸在二氢叶酸还原酶的催化下合成DNA,2.旁路途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)或胸腺嘧啶激酶（TK）的催化下补救合成DNA。,10,胸苷激酶,基因选择,系统,遗传标记：,TK,编码产物：,胸苷激酶,筛选药物：,HAT选择法,H：次黄嘌呤；补救合成核苷酸的原料,A：氨基喋呤；抑制四氢叶酸合成,T：胸苷；补救合成dTTP的原料,作用机理：,TK是核苷酸补救合成途径的一个关键酶,11,二氢叶酸还原酶（DHFR）基因选择系统,遗传标记：,DHFR：真核细胞生物合成核苷酸的关键酶，功能是催化二氢叶酸还原成四氢叶酸,编码产物：,二氢叶酸还原酶（DHFR）,筛选药物：,叶酸类似物氨基喋呤或氨甲喋呤,作用机理：,dhfr缺陷型细胞,因不能合成核酸而死亡，而导入了外源基因的细胞成功存活，并且在氨甲喋呤的选择压力下大量表达蛋白。,12,黄嘌呤-鸟嘌呤,磷酸核糖,转移酶（,X,GPRT）基因,选择系统,遗传标记：,X,GPRT,编码产物：,黄嘌呤-鸟嘌呤,磷酸核糖,转移酶,筛选药物：,霉酚酸,作用机理：,X,GPRT,合成GMP。,哺乳动物细胞无,X,GPRT酶，不能利用黄嘌呤形成黄嘌呤磷酸（XMP），但有鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT），可催化黄嘌呤形成次黄嘌呤磷酸（IMP）。哺乳动物细胞可通过IMP生成GMP。当用IMP脱氢酶抑制剂霉酚酸，抑制了GMP的合成，使细胞失去合成DNA能力而死亡。,将含XGPRT基因的重组体导入真核细胞后，能表达XGPRT酶，可在含有黄嘌呤的培养基中通过XMP中间体补救合成GMP，使DNA合成正常进行,。,加入霉酚酸后，阳性克隆因不受霉酚酸的抑制而存活，而阴性细胞则受霉酚酸的抑制而死亡，以此来筛选阳性细胞。,13,新霉素抗性基因选择系统,遗传标记,：APH,编码产物,：氨基糖苷磷酸转移酶,筛选药物,：新霉素，,即G418一种氨基糖苷类抗生素，影响80S核糖体功能核蛋白质的合成,作用机理,：,新霉素抗性基因编码3磷酸转移酶降解G418,。,适用于所有的真核细胞,14,氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因选择系统,遗传标记,：,CAT,，,大肠杆菌Tn9转座子编码的催化氯霉素,乙酰化反应的蛋白质,编码产物,：,氯霉素乙酰转移酶,筛选药物,：氯霉素,作用机理,：,真核细胞缺乏CAT,，将,CAT作为报告基因,与目的基因一起导入到真核细胞，可在加入氯霉素的培养基中选择阳性细胞。,常用于瞬时表达研究,。,15,潮霉素抗性选择系统,遗传标记,：HPH,编码产物,：潮霉素B磷酸转移酶,筛选药物,：潮霉素B,作用机理,：HPH灭活潮霉素B,16,Thank You!,17,