免疫学技术(单抗的制备)演示课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,免疫学技术,单克隆抗体的制备,1,1,2,3,单克隆抗体,单克隆抗体的定义,单克隆抗体制备原理,单抗制备方法及步骤,4,制备过程中注意事项、优缺点及其应用,5,单抗的改进,2,1,单克隆抗体的定义,3,定义,动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种,专一抗体,的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即,单克隆,。单克隆细胞将合成针对,一种抗原决定簇,的抗体，称为单克隆抗体。,4,1975年 Kohler&Milstein,创立单克隆抗体技术，获得1984年诺贝尔医学和生理学奖,创立者,：,5,单抗概况,1975年分子生物学家G.J.F.,Kohler,和C.Milstein在细胞杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，,使经绵羊红细胞(SRBC)免疫的小鼠的脾细胞，与小鼠的骨髓瘤细胞融合，并由此创建了第一个B细胞杂交瘤细胞株，获得了抗SRBC的单克隆抗体。这是免疫学乃至医学史上的一个里程碑。,6,单抗特点,一是,特异性,，针对特定的单一抗原表位，它具有高度的特异性，抗肿瘤抗体药物的研究表明，其特异性主要表现为特异性结合、选择性杀伤靶细胞、体内靶向性分布以及具有更强的疗效。,二是,多样性,，主要表现在靶抗原的多样性、抗体结构的多样性、作用机制的多样性等方面。,三是,定向性,，抗体药物可以定向制造，就是根据需要制备具有不同治疗作用的抗体药物。基于这些特点，我们可以用来制成“生物导弹”运送药物至病害部位，主要是癌细胞，从而达到治疗效果。,7,2,单克隆抗体制备原理,8,原理,9,制备流程图,10,制备流程,11,3,单抗制备方法及步骤,12,制备步骤,1.致敏淋巴细胞的准备,2.骨髓瘤细胞的准备,3.饲养层细胞的准备,4.细胞融合,5.选择性培养,6.特异性抗体的检测,7.杂交瘤细胞的克隆化,8.杂交瘤的冻存和复苏,9.单克隆抗体的大量制取,10.单克隆抗体的纯化,13,完全抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于5000Da生物物质,半抗原,：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于5000 Da 物质（半抗原需与,BSA、OA,等载体交联后成完全抗原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体）,动物选择：选择体重1820g,BALB/C 雌性小鼠,，用制备抗原免疫。,抗原免疫：方式体内、体外,剂量0.5-100,g,次数视抗原而定,间隔视抗原而定,佐剂视抗原而定,收集时间：末次加强免疫后72-96h收集,步骤一 致敏淋巴细胞的准备,14,常用骨髓瘤细胞系：SP20、NS1、P3.653,融合时骨髓瘤细胞的选择：,a.处于,对数生长期,，良好的形态，活细胞计数高于95,b.细胞株保持,HGPRT,（,次黄嘌呤尿嘌呤核糖转移酶）,缺陷状态,步骤二 骨髓瘤细胞的准备,15,常用饲养细胞：小鼠腹腔巨噬细胞，小鼠脾细胞，小鼠或大鼠胸腺细胞等。,饲养细胞主要作用：,可能在培养液中释放某种,生长刺激因子,；,满足新生细胞对,细胞密度,的依赖性;,减少聚苯乙烯培养板孔对新生细胞的毒性等,步骤三 饲养层细胞的准备,16,方法：电融合,激光融合,离心融合,灭活的病毒融合,聚乙二醇融合法,SP2/0细胞与脾细胞的比例为1：25,步骤四 细胞融合,17,步骤五 选择性培养,HAT选择培养基：,H,（Hypoxanthine）:次黄嘌呤,A,（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径,T,(Thymidine)：胸,腺嘧啶核苷；,“,核苷酸前体,”,，供细胞通过替代途径合成DNA,18,HAT选择作用：,淋巴细胞：不能生长，5,7天死亡；DNA合成的主要途径,被A阻断,骨髓瘤细胞：不能生长，5,7天死亡；,HGPRT缺乏,，DNA合成的替代途径受阻,19,对检测方法的要求：灵敏度高,特异性强,简便快速,常用检测方法：,ELISA,、免疫荧光法,步骤六 特异性抗体的检测,20,ELISA原理：,将抗原包被于酶标板，与待检杂交瘤细胞上清液反应，如该上清液中含有特异性的抗体（一抗Ab），即可与酶标二抗作用，加底物经酶催化呈现颜色反应，通过检测OD值判定结果。,ELISA,21,目的：建立,单一,细胞克隆,方法：,有限稀释法,，显微操作法，软琼脂培养法，,FACS法,克隆建立的标准：连续两次以上100%阳性孔,步骤七 杂交瘤细胞的克隆化,22,筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为,HAT敏感,细胞株。用HT培养液稀释，使细胞浓度为5060个/mL，于96孔培养板中每孔加0.1mL(五六个细胞/孔)。接种2排，剩余细胞悬液用HT培养液作倍比稀释，再接种2排，如此类推，直至使每孔含0.52个细胞。按Poisson法计算，应有36的孔为1个细胞/孔。培养710d后，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，尔后进行抗原特异的ELISA测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。,有限稀释法,23,特点：,不需任何特殊设备,克隆出现效率高,实验室常用方法,有限稀释法,24,将细胞经荧光抗体染色后，经喷嘴形成单个细胞的线形液滴，在莱塞光激发下，荧光素发射荧光，此信号由光电倍增管接收，再结合细胞形态大小产生光散射信号，经电脑处理，产生信号并与预定的信号对比，根据细胞荧光强度及细胞大小不同，将细胞分成不同级别，在电场中发生偏离，而分别收集于不同容器中。,FACS法,效率最高,价格昂贵,25,冻存：,慢冻,，分步冻存，,室温,-20,-70,液氮,意义：防止污染及变异,避免染色体丢失,防止非分泌细胞的过度生长,防止细胞密度过高而死亡,复苏：,快融,，取出立即浸入37-40水浴中，,使其迅速融化,步骤八 杂交瘤的冻存和复苏,26,动物体内诱生：腹腔接种,体外细胞培养：,单层细胞培养法，,悬浮培养系统，细胞固定化培养系统,步骤九 单克隆抗体的大量制取,27,取,BALB/C 雌性小鼠,，首先腹腔注射0.5ml液体石腊或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。,腹腔接种,28,总体上讲，杂交瘤细胞系并不是严格的贴壁依赖细胞，因此既可以进行,单层细胞培养,，又可以进行,悬浮培养,。杂交瘤细胞的单层细胞培养法是各个实验室最常用的手段，即将杂交瘤细胞加入培养瓶中，以含10-15%小牛血清的培养基培养，细胞浓度以110,6,-210,6,/ml为佳，然后收集培养上清，其中单抗含量约10-50ug/ml。,目前在杂交瘤细胞的大量培养中，主要有两种类型的培养系统。其一是,悬浮培养系统,，采用转瓶或发酵罐式的生物反应器，其中包括使用微载体；其二是,细胞固定化培养系统,，包括中空纤维细胞培养系统和微囊化细胞培养系统。,近来的研究表明，,微载体培养法,是杂交瘤细胞大量培养的理想途径之一。,体外细胞培养,29,1.辛酸硫酸铵沉淀法,原理：先加正辛酸沉淀,杂蛋白,，后加硫酸铵,沉淀,抗体,。,特点：成本较低，操作简单；,抗体活性损失小；,抗体纯度高；,抗体回收率低；,需要高速冷冻离心机。,步骤十 单克隆抗体的纯化,30,2 亲和层析法：,原理：利用蛋白A或蛋白G通过,共价键,联接到活化的固相载体上，吸附抗体，然后采用改变pH值的方法将抗体洗脱分离。,特点：抗体纯度高；,纯化速度快；,抗体回收率低；,抗体活性有损失；,成本高，费用大。,31,4,制备过程中注意事项、优缺点及其应用,32,用于免疫的动物，应选择与亲本骨髓瘤细胞,同一品系,的动物,抗原免疫用的抗原尽量设法提高其纯度，并保存其活性,融合剂PEG对细胞有毒性，一般采用,分析纯,规格。浓度越高，对细胞 的毒性越大,注意事项,33,操作中的,污染，,污染,是,杂交瘤技术中最常遇到的问题，它往往可使一个即将建株的细胞毁于一旦。,杂交瘤产生各种免疫球蛋白，但主要是IgG和IgM，究竟是哪种为主，则决定于抗原的免疫,程序,。免疫一次，且3天后就取脾，多为产生IgM的B淋巴细胞。免疫多次的多为IgG。,注意事项,34,优点：,在体外“永久”地存活并传代,用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法,可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗,局限性：,固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围,反应强度不如多克隆抗体,制备技术复杂、费时费工、价格较高,单克隆抗体的优缺点,35,1.,作为亲合层析的配体,单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单克隆抗体，利用它作为配体，固定在层析柱上，通过亲合层析，即可从复杂的混和物中分离、纯化这一特定成分。与其它提取方法(沉淀法、高效疏水色谱法等)相比，具有简便、快速、经济、产品活性高等优点。,单克隆抗体的应用,36,2.作为生物治疗的导向武器,脂质体是由既亲水又亲油的两亲磷脂组成的连续双分子层微囊，内含水相空间，可包裹水溶性物质。包有细胞毒剂的脂质体膜上偶联抗体，可定向攻击靶细胞，称为免疫脂质体。这种“导向治疗”，在动物试验与体外试验中已获得满意效果。另外，可将化疗药物、细菌毒素、植物毒素或放射性同位素等细胞毒剂与抗肿瘤抗原的单克隆抗体直接交联，利用其导向作用，使细胞毒剂定位于肿瘤细胞把它直接杀伤。这不仅提高了抗体的疗效，也可降低细胞毒剂对正常细胞的毒性反应。如应用抗T细胞单抗和柔红霉素结合物，在体外对非T淋巴细胞就无杀伤作用。但是，要把这种方法应用于临床，目前还存在不少技术难关，包括人体对鼠源单抗的排异问题等。,单克隆抗体的应用,37,3.作为免疫抑制剂,抗人T淋巴细胞单抗(McAb)作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应。其作用机理有赖于McAb的种类及其免疫学特性。注射抗小鼠Thy-1抗原的单抗，可以抑制小鼠同种皮肤移植的排斥反应。此外，对用于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗T细胞单抗加补体处理，能减轻移植物抗宿主病的发生。,单克隆抗体的应用,38,4 作为研究工作中的探针,单克隆抗体只与抗原分子上某一个表位(即抗原决定簇)相结合，利用这一特性就可把它作为研究工作中的探针。此时，可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结构与功能的关系，进而并可从理论上阐明其机理。如用荧光物质标记单抗作为探针，能方便地确定与其结合的相应生物大分子(蛋白质、核酸、酶等)在细胞中的位置和分布。,单克隆抗体的应用,39,6.作为医学检验试剂,(1)诊断各类病原体,这是单抗应用最多的领域，已有大量诊断试剂商品供选择。,(2)肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测,用于肿瘤的诊断、分型及定位。尽管目前尚未制备出肿瘤特异性抗原的单抗，但对肿瘤相关抗原的单抗早就用于临床检验。,(3)检测淋巴细胞表面标志,用于区分细胞亚群和细胞的分化阶段。,(4)机体微量成分的测定,应用单抗结合其它技术，可对机体的多种微量成分进行测定。,单克隆抗体的应用,40,5,单克隆抗体的改进,41,绝大多数的mAb是用小鼠开发的，虽然可作为研究和诊断的工具，但它们至少在一定程度上不是理想的治疗剂，因为他们在人类中有免疫原性。也就是说，小鼠抗体引入到病人体内，将被病人的免疫系统识别为外源物质，并将发生有损治疗抗体利用的人抗鼠抗体（HAMA）应答,产生原因,42,鼠的抗体可被修饰成遗传上更接近人的抗体。特别是鼠的IgG重链和鼠的轻链的恒定区在DNA水平上可以用人IgG1重链和轻链的恒定区所取代，以创建一个只有可变区（V）来源于鼠类的嵌合抗体。这明显地降低但并没有消除此抗体的免疫原性。,另一种方法包括测定小鼠抗体重链和轻链的V区序列，然后将这些链的高变区的DNA序列插入人的IgG重链和轻链基因中。这样产生的抗体95是人的，仅结合区是源于鼠的。,单克隆抗体的人源化和嵌合体,嵌合抗体,人源化抗体,43,44,通过人的B细胞和骨髓瘤细胞融合，已经制成了人的抗体，虽然这曾是十分困难的，并且通常在融合前需要用EB病毒感染以无限增殖B细胞。这种方法由于使用病毒而不理想，产生的mAb的特异性是有限的，抗体的产量也很少。最近，通过用人免疫球蛋白基因取代小鼠免疫球蛋白基因创建了产生人抗体的小鼠。因此，当小鼠被免疫时，它直接制造出对该抗原的人的抗体，并且产生这些抗体的B细胞可与骨髓瘤细胞融合，产生制造人mAb的杂交瘤。,直接制备人的mAb,45,另外一个制备单克隆抗体的方法涉及Fv库。这一途径包括从许多B细胞获得V,H,和V,L,区的信息。由此mRNA制备每个重链V区的cDNA，并与制备的每个轻链V区的cDNA连接，以创造所有的组合，并因此创造编码极大量不同抗原结合部位的基因。这些基因被克隆到细胞中，以生产它们编码的蛋白质，然后对它们的特异性进行选择。,Fv库,46,Fv库,47,48,