第三篇食品中各类微生物检验.docx

第三篇食品中各类微生物检验

第一篇 微生物食品加工

实验一 甜酒酿的制造
一、目的
1、经过甜酒酿的制造了解酿酒的基本原理。
2、掌握甜酒酿的制造技术。
二、原理
以糯米〔或大米〕经甜酒药发酵制成的甜酒酿，是我国的传统发酵食品。我国酿酒工业中的小曲酒和黄酒消费中的淋饭酒在某种水平上就是由甜酒酿开展而来的。
甜酒酿是将糯米经过蒸煮糊化，应用酒药中的根霉和米曲霉等微生物将原料中糊化后的的淀粉糖化，将蛋白质水解成氨基酸，然后酒药中的酵母菌应用糖化产物生长繁衍，并经过酵解途径将糖转化成酒精，从而赋予甜酒酿特有的香气、风味和丰厚的营养。随着发酵时间延伸，甜酒酿中的糖分逐渐转化成酒精，因此糖度下降，酒度提高，故适时完毕发酵是坚持甜酒酿口味的关键。
三、资料
1、资料：糯米、酒药
2、仪器和用具：手提高压灭菌锅，不锈钢丝碗，滤布，烧杯，不锈钢锅。
四、流程
原料选择→洗米蒸饭→淋水降温→落缸搭窝→接种→保温发酵→后熟→质量评价
五、方法
1、洗米蒸饭
将糯米淘洗洁净，用水浸泡4h，捞起放于置有滤布的钢丝碗中，于高压锅内蒸熟〔约0.1Mpa，9min〕，使饭〝熟而不糊〞。
2、淋水降温
用清洁冷水淋洗蒸熟的糯米饭，使其降温至35℃左右，同时使饭粒松懈。
3、落缸搭窝
将酒药平均拌入饭内，并在洗洁净的烧杯内洒少许酒药，然后将饭松懈放入烧杯内，搭成凹形圆窝，面上洒少许酒药粉。盖上培育皿盖。
4、保温发酵
于30℃停止发酵，待发酵2天后，当窝内甜液达饭堆2/3高度时，停止搅拌，再发酵1天左右即可。
六、结果
1、发酵时期每天观察、记载发酵现象。
2、对产品停止感官评定，写出品味体会。
七、思索
1、制造甜酒酿的关键操作是什么？
2、发酵时期为什么要停止搅拌？

实验二 酸乳的制造
一、目的
1、掌握酸乳制造原理
2、学会酸乳的制造方法
二、概述
酸奶因具有清爽爽口的味觉而倍受欢迎 , 又由于酸乳中会有乳酸菌的菌体及代谢产物,它对肠道内的致病菌有一定的丑掣作用,故对人体的肠道消化道疾病有良好的治疗效果。
三、原理
酸乳是以牛乳为主要原料，接入一定量的乳酸菌，经发酵后而制成的一种乳制品饮料,当乳酸菌在牛乳中生长繁衍和产酸至一定水平时,pH下降，使乳酪蛋白在其等电点左近发作凝集，这种凝乳状酸奶称为凝结型酸奶。
四、器材
鲜牛奶、奶粉、蔗糖、菌种(或市售酸乳)、天平、烧杯、玻璃棒、牛奶瓶、恒温水浴锅、恒温培育箱、冰箱、不锈钢锅。
五、方法
〔一〕凝结型酸奶制造
在添加消费发酵剂后立刻停止包装,并在包装容器中发酵而成,成品呈凝乳状。
1、工艺流程
蔗糖、脱脂奶粉
↓
原料鲜奶一→污染一→脂肪含量规范化一→配料一→过滤一→预热一→均质一→杀菌-→冷却-→接种一→分装一→发酵一→冷却一→后熟。
2、操作步骤
〔1〕牛奶瓶消毒：
将牛奶瓶在不锈钢锅里用沸水煮15分钟。
〔2〕牛乳的污染：
应用特别设计的离心机,除去牛乳中的白血球和其他肉眼口见的异物。
〔3〕脂肪含量规范化：
鲜奶中脂肪含量比拟高,为了防止酸奶中有脂肪析出,因此需求对鲜奶的脂肪含量停止调整使其到达所要求的规范。可以在脂肪含量高的牛乳中,参与一定体积的脱脂乳,或经过火离机,从牛乳中分别出稀奶油,然后在失掉的脱脂乳中再掺入一定量稀奶油,使调制乳的脂肪含量到达要求。
〔4〕配料
a.奶粉的添加:经脂肪含量规范化处置的调制乳(或按1：7的比例加水把奶粉配制成恢复牛奶)，为了使其非脂干物质含量到达要求,普通往调制乳中添加脱脂奶粉,经如此处置的酸奶有一定的硬度,脱脂奶粉的添加量普通为1%-3%。
b.蔗糖的添加：为了紧张酸奶的酸味,改善酸奶的口味,普通在调制乳中参与4%-8%的蔗糖,假设蔗糖量参与过多,会因调制乳浸透压的添加而阻碍乳酸菌主长普通是先将原料乳加热到60℃左右,然后参与蔗糖,待糖溶解后,过滤除杂,经过滤的奶液再停止均质处置。
〔5〕均质：
用于制造酸奶的原料乳普通都要停止均质处置,经过均质处置,乳脂肪被充沛分散酸奶不会发作脂肪上显现象,酸奶的硬度和粘度都有所提高,而且酸奶口感细腻,更易被消化吸收,将加热和均质两种方法适当结合起来,处置的效果会更好,普通是先将原料乳地垫至60℃左右,然后在均质机中,于8-1OMpa压力对乳停止均质处置。
〔6〕灭菌：
均质后的原料乳的灭菌方法大致有两种:将乳加热至90℃,保温5min,或置于80℃恒温水浴锅中灭菌15分钟,也可用超高温瞬时灭菌法〔在135℃下保温2-3s〕。灭菌目的有以下几点：
①杀灭原料乳中的微生物,特别是致病菌。
②构成乳酸菌生长促进物质,破坏乳中存在的阻碍乳酸菌生长的物质。
③除去原料乳中的氧及由于乳清蛋白的变性而添加的-SH,从而使氧化恢来电位下降,滋长乳酸菌的生长。
④使乳清蛋白变性膨润,从而改善酸奶的硬度和粘度,并阻止水分从变性酷蛋白凝聚成的网状结构中分别出来。
⑤灭菌后,使乳中原本存在的酶失活,使发酵进程成为单一乳酸菌的作用进程,易于控制消费。
经灭菌处置后的原科乳迅速冷却到43-45℃待接种。
〔7〕接种：
向43-45℃灭过菌的原料乳中参与任务交酵剂,接种量为2-3%，通常是嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的混合菌，两种菌的比例为1:1或2：1。球菌的接种量稍多些,可补偿由于杆菌生长产酸而阻碍球菌生长所形成的球菌数量缺乏的缺陷。经实验证明，当接种量超越3%时,发酵所需时间并不因种量加大而延长,而酸奶的风味由于发酵前期酸度上升太快反而变差,所以,恣意加大接种量是有益的,反之,假定接种量过小,发酵所需时间延伸,酸奶的酸味会显得不够。
〔8〕分装：
酸奶遭到振动,凝乳形状易被破坏,因此,不能在发酵罐中先发酵然后再停止。分装,必需是将会有乳酸菌的牛乳培育基先分装到销售用的玻璃瓶或塑料小容器中,加盖后送入恒温室培育,在容器中发酵制成酸奶,为了防止杂菌的侵入,分装操作应在无菌室中停止。牛乳分装后,容器上部留出的空隙要尽能够小,这样容器中的内容晃动幅度小,酸奶的形状易坚持完整,另外,增加空气也有利于乳酸菌的生长。整个分装操作的时间要短,使乳液温度下降少,这样乳液温度与所设定的发酵温度接近,整个发酵时间就不会被延伸。
〔9〕发酵:
将装有含乳酸菌的牛乳的容器置于恒温箱中停止发酵,恒温箱的温度坚持在40-43℃,时间为3-4小时,或30℃培育18-20小时,发酵终点确实定有两种方法:
a.发酵奶的酸度已到达65-70oT,[用0.1moL/L NaOH 规范溶液滴定10ml样品,每消耗掉 1mLNaOH溶液称为1滴定酸度(oT)]或PH=4-5；
b.发酵奶的活动性变差,基本凝结。
(10)冷却:
发酵完毕,在将酸奶移放进冷藏室停止贮存和后熟处置之前,应将酸奶从发酵室中取出,用冷风迅速将其冷却到10℃以下使酸奶中的乳酸菌中止生长,防止酸奶酸渡过高而影响口感。
(11)后熟:
酸奶在构成凝块后应在4-7℃下坚持24小时以上,以取得酸奶特有风味和较好口感。
(12)冷藏:
经冷却处置的酸奶贮藏在2-5℃,最好是-1-0℃的冷藏室保管,高温保管有以下优点:
①保管时期,酸奶的酸度上升极少；
②牛乳凝结时会发生收缩力,招致乳清折出,在高温时这种收缩力比拟弱,所以乳清不易从酸奶中分别出来；
③高温下酸奶逐渐构成白玉般的组织形状,结构十分细腻；
④高温保管进程中,香味物质逐渐构成,使酸奶具有较浓香味。
(13)品味：
酸奶应有凝块,质地细腻,酸甜适中,清爽爽口,假定有不良异味,那么很能够是酸奶污染了杂菌。
〔二〕搅拌型酸奶的制造
在发酵罐中接种消费发酵剂,凝结后,再经搅拌入杯成其它容器中,产品凝乳粒子直径坚持在0.01-0.04mm大小。呈半活动形状的粥糊状,易运用吸管吸食。
1、工艺流程
原料鲜奶→配料→预热→均质→杀菌→冷却→接种→搅拌→发酵→冷却→搅拌混合→装瓶→冷却→后发酵 ↑
辅料
2、操作步骤(略)
(三)饮料型酸奶
将凝结型酸奶均质处置后,使凝乳充沛分散,凝乳粒子直径在0.01mm以下的酸奶,这种酸奶的特点是与牛乳相似,呈液体状。
1、工艺流程
凝结型酸奶→混合→均质→分装→冷却→冷藏
↑
动摇剂溶液
2、操作步骤
(1)凝结型酸奶的制备(略)
(2)混合:
为了防止饮料型酸奶发生分层现象,普通在疑固型酸奶中参与动摇剂,然后再用均质机破乳,由于添加了动摇剂,即使在冷藏时期也不会发作酸奶分层现象。依据来源,可将动摇剂分红两类:
①人工分解动摇剂,如海藻酸丙二醇酶(PGA)等；
②自然动摇剂,如明胶、琼脂、海藻酸纳和果胶等。动摇剂的种类、添加量和添加方式,关于制备凝结塑酸到十分重要。
目前在酸奶中运用得较多的是低甲氧基果胶(LM果胶)。普通参与量为0.3%,运用时，先将LM果胶用水溶解,经灭菌后冷却到接近酸奶的温度(20-15℃),然后参与酸奶中搅匀。
(3)均质:
在1OMPa压力下,将上述酸奶停止均质处置。
(4)分装:
均质后的酸乳液,灌装到销售用的小容器中后,迅速冷却到10℃以下。
(5)冷藏:
饮料型酸奶会有活乳酸菌,因此应置于O-5℃冷藏。
(四)果汁酸奶
果汁酸奶是在凝结型酸奶中添加果汁和动摇剂后，再经均质处置制成的。
1、工艺流程
低酸味凝结型酸奶→混合→均质→分装→冷却→冷藏
↑
果汁、动摇剂
2、操作步骤
(1)低酸味凝结型酸奶的制备:
果汁(露)的添加会添加酸奶的酸味,因此在接种时,将嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌两者的比例改动成10:1,目的是增加保加利亚乳杆菌发生的乳酸,这样可防止发生酸味过强,制备低酸味凝结型酸奶的其它操作步骤,与普通凝结型酸奶的制法相反。
(2)混合:
将酸奶和灭菌后冷却到15-20℃的果汁(露)按4:1混合,同时参与过量灭过菌的动摇剂水溶液,搅拌平均。
(3)均质:
在1OMpa压力下,将上述酸奶停止均质处置。
(4)分装:
将经均质处置过的果汁酸奶乳液灌装到销售用的小容器中,迅速将其冷却到10℃以下。
(5)冷藏:
冷却后的酸奶,置于O-5℃的冷藏室中冷藏。
(五)杀菌型酸奶
由牛乳制成酸奶后,用加热方法将酸奶中一切微生物杀灭的一种酸奶,此种酸奶特点是:不存在乳酸菌和其它微生物,保管期中酸奶酸度不会改动,且保管期延伸,但凝乳经加热后,十分容易折出乳清,需在发酵前加动摇剂,灭菌后酸奶的营养价值也有所降低。
1、工艺流程

糖、奶粉、动摇剂 ┌--搅拌型酸奶--┐
↓ ┌发酵-杀菌-┤ ├-无菌分类
脂肪含量规范化牛乳→配料→过滤→均质→分装 └--饮料型酸奶--┘
└-发酵-杀菌-凝结型酸奶

2、操作步骤
杀菌型酸奶除多了一步杀菌工序外,其它操作步骤与凝结型酸奶基本相反。
杀菌:微生物在酸性环境中对温度十分敏感,当PH为4.O-4.5时,65℃加热5min就可以把酸奶中的微生物杀死制造杀菌型酸奶常运用这种方法。其它步骤(略)。
(六)冷冻酸奶
在酸奶中添加糖和香料,依照冰淇淋消费工艺加工成保健饮料。按冷冻酸奶能否含有活菌,可将其划分为活菌型冷冻酸奶和杀菌型冷冻酸奶两种类型活菌型冷冻酸奶在-25℃贮藏一年活乳酸菌残存50%-80%，杀菌型冷冻酸奶是将酸奶中活乳酸菌杀死因此成品功用动摇。
1、工艺流程

糖液→杀菌→冷却
↑
酸奶→混合→均质→搅拌、分装→搅拌型冷冻酸奶→冷藏
↓ ↓
香料 快速冷冻(-35℃)→凝结型冷冻酸奶→冷藏
2、操作步骤
(1)牛乳的污染、脂肪含量规范化和配料的操作方法与制造凝结型酸奶相反。
(2)将原料加热至75℃,然后用均质机停止二段均质(均质压力为13.538Mpa,3.434Mpa)
(3)均质后的乳加热到85℃,保温10min,接着将此灭菌奶冷却到44℃。
(4)接种保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的混合菌液(1：1),接种量为2%-3%。
(5)在43℃左右发酵6-7h,终止时酸奶的pH值为4.7-5.0。
(6)在上述酸奶中添加经杀菌冷却的糖液和香料,充沛混合后,在143Mpa 压力60 ℃下均质,接着,将均质奶冷却到45℃,成熟数小时后分装。最后送入-35℃冷库,快速冷冻硬化,失掉凝结型冷冻酸奶,也可以将成熟后的酸奶不经过冷冻硬化,在分装后直接冷藏保管制成搅拌型冷冻酸奶。
六、本卷须知
(1)选择优质、新颖的牛奶和酸奶(作为菌种)。
(2)严厉无菌操作,尽量防止杂菌污染。
(3)酸乳制好后,应在O-5℃下保藏,保质期为5天。

附一:原料奶质量要求
a.来源于安康牛所产的乳,色泽呈乳白色或微黄色,气息芬芳、无异味初乳、末乳、细菌污染乳均不得运用。
b.乳牛注射抗生素后所产出乳,四天内不得运用。消费前应做小样。
c.总乳固体不低于11.5%,非脂乳固体大于8.5%。
d.原料中不得含碱及菌剂等杂质。
e.奶温不高于10℃,70度酒精实验无絮状物沉淀。

附二:酸牛奶卫生规范
1、感官目的
呈乳白色或和稍带淡黄色,具有幽香纯真的乳酸味,凝块稀疏结实平均，无气泡,允许大批乳清折出。
2、理化目的
项目
目的
脂肪含量/%
≥3.0
酸度〔以乳酸计〕/%
0.63-0.99
汞含量〔以Hg计〕mg/kg-1
≤0.01

3.细菌目的
项目
目的
大肠菌群/个〔100mL〕-1
≤90
致病菌〔系指肠道致病菌及致病性球菌〕
不得检出

实验三 面包的制造
一、目的
1、掌握面包制造的原理、工艺。
2、学会面包的制造方法。
二、概述
面包是产小麦国度的主食，简直世界各国都有消费。它是以面粉为主要原料，以酵母菌、糖、油脂和鸡蛋为辅料消费的发酵食品，其营养丰厚，组织疏松，易于消化吸收，食用方便，深受消费者喜欢。
三、原理
酵母参与面粉和水的混和合物中后,在28℃左右的温度下,应用面粉中含有大批单糖与蔗糖末尾生长繁衍,在生长繁衍的同时,面粉中的β-淀粉酶能将面粉中的淀粉转化为麦芽糖。
β-淀粉酶
2(C6H1005)+2nH20────→n(C12H22020)
淀粉 麦芽糖
麦芽糖的添加,为酵母菌进一步生长发酵提供了可应用的营养物质。酵母菌菌体自身可以分泌麦芽糖酶和蔗糖酶,将麦芽糖和蔗糖分解成单糖,供酵母菌应用。
麦芽糖酶
(C12H22020)+H20────→2C6H1206
麦芽糖 葡萄糖

蔗糖转化酶
(C12H22020)+H20────→C6H1206+ C6H1206
蔗糖 葡萄糖 果糖
酵母菌应用这些糖类及其它营养物质先后停止有氧呼吸和无氧呼吸,发生二氧化碳、醇、醛和一些无机酸等产物。
有氧呼吸
C6H1206+6O2────→6CO2+6H20+674千卡

无氧呼吸
C6H1206────→C2H5OH+2CO2+24千卡

生成的二氧化碳由于被面团中的面筋包围,不易跑出,留在面团内,从而使面团逐渐胖大。发酵后的面团,经揉搓成型醒发后,放入200℃左右的烤炉中烘烤。由于面团内的二氧化碳受热收缩,逸散,从而使面包充溢多孔,构成海绵状。
在发酵中构成的其它物质如乙醇、乳酸、醋酸、醛酮类等无机化合物,在烘烤中构成了面包特有的香味。
四、原料与器材
面粉、白糖、油脂、酵母、改良剂、不锈钢锅、托盘天平、量筒、调羹、恒温箱、不锈钢刀、瓷盘、远红外电热烤箱。
五、操作步骤
1、原辅料配方:
面粉100%；水45-55%；干酵母0.8-1.5%；改良剂1%；白糖20%；油脂8%-10%。
2、面团第一次发酵:
将面粉的50%全部酵母、改良剂、白糖及过量的水调制成面团,让面团在28-30℃下发酵2-4小时。
3、面团第二次发酵:
将剩余的原辅料拌入经过第一次发酵的面团中搅拌平均后在28-30℃下发酵1.5-2小时。
4、成型:
将发酵好的面团,按要求切成小块加工成各种外形,留意应搓得平均飞严密，不要使外表有裂纹。
5、醒发:
将面包坏放入烤盘,外表刷上一层清水,在40℃下醒发约30min(烤盘底部涂一些油)。
6、烘烤:
将面包坯放入烤箱中,在约200℃温度下烘烤8-10分钟。
7冷却:
面包出炉后,温度很高,须经冷却后才干包装和贮藏。
六、面包质量要求
色:
面包的外表应为金黄色或棕黄色,色泽平均分歧,富有光泽,无烤焦或发自现象,外部颜色洁白。
形:
面包外表应润滑,无撒粉粒、气泡、裂纹、粘边现象,外形应契合各种外形面包要求,外部组织气孔细密平均,富有弹性。
香:
香味地道,有面包特有香味。
七、本卷须知
1、留预料的过度,尤其是面粉与水的配比。
2、严厉控制面团发酵,醒发和面包烘烤的温度与时间,尤其是烘烤时,要防止烤焦。
3、在面包制造进程中,自始至终都要留意卫生。

实验四 酸乳中乳酸菌的测定
一、目的
1、解酸乳中乳酸菌分别原理
2、学习并掌握酸乳中乳酸菌菌数的检测方法。
二、原理
活性酸奶需求控制各种乳酸菌的比例，有些国度将乳酸菌的活菌数含量作为区分产品种类和质量的依据。
由于乳酸菌对营养有复杂的要求，生长需求碳水化合物、氨基酸、肽类、脂肪酸、酯类、核酸衍生物、维生素和矿物质等，普通的肉汤培育基难以满足其要求。测定乳酸菌时必需尽量将试样中一切活的乳酸菌检测出来。要提高检出率，关键是选用特定良好的培育基。采用稀释平板菌落计数法，检测酸奶中的各种乳酸菌可取得满意的结果。
三、资料
1、培育基
MRS培育基，改良CHALMERS培育基，M17培育基。
2、仪器和用具
无菌移液管〔25ml,1ml〕，无菌水〔225ml带玻璃珠三角瓶，9ml试管〕，无菌培育皿，旋涡平均器。恒温培育箱。
四、流程
酸奶→稀释→制平板→培育→反省计数
五、方法
1、样品稀释
先将酸奶样品搅拌平均，用无菌移液管吸取样品25ml参与盛有225ml无菌水的三角瓶中，在旋涡平均器上充沛振摇，务必使样品平均分散，即为10-1的样品稀释液，然后依据对样品含菌量的估量，将样品稀释至适当的稀释度。
2、制平板
选用2~3个适宜的稀释度，培育皿贴上相应的标签，区分吸取不同稀释度的稀释液1ml置于平皿内，每个稀释度作2个重复。然后用溶化冷却至46℃左右的MRS或改良CHALMERS培育基倒平皿，迅速转动平皿使之混合平均，冷却成平板。
3、培育和计数
将平皿倒置于40℃恒温箱内培育24~48h，观察长出的粗大菌落，计菌落数目，按惯例方法选择30~300个菌落平皿停止计算。
六、结果
1、指示剂显色反响
乳酸菌的菌落很小，1~3mm，园形隆起，外表润滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色。由于产酸菌落周围能使CaCO3发生溶解圈，酸碱指示剂呈酸性显色反响。
2、镜检形状
必要时，可挑取不同形状菌落制片镜检确定是乳杆菌或乳链球菌。保加利亚乳杆菌呈杆状，成单杆、或双杆菌或长丝状。嗜热链球菌，呈球状，成对、或短链、或长链状。
3、参照比拟
据引见，改良CHALMERS培育基的检出率较MRS培育基高，M17培育基较适宜于乳球菌的培育，在检测时可同时运用多个培育基作比拟。
七、思索
1、为什么乳酸菌的检测关键是选用特定良好的培育基？
2、培育基中为什么要加CaCO3？

第二篇 食品中各类微生物检验
本篇主要包括食品中菌落总数、大肠菌群、各种致病菌、霉菌和寄生虫的检验。本篇包括食品中菌落总数和大肠菌群的测定，这两个项目是每一种出厂食品都必需检测的项目。
实验五 食品中菌落总数的测定
食品中菌落总数的测定，目的在于了解食品在消费中，从原料加工到成品包装受外界污染的状况；也可以运用这一方法观察细菌在食品中繁衍的静态，确定食品的保管期，以便对被检样品停止卫生学评价时提供依据。
食品有能够被多种类群的微生物所污染，每种细菌都有它一定的生理特性，培育时运用不同的营养条件及其生理条件(如温度、培育时间、PH值、需氧性质等)去满足其要求，才干区分将各种细菌培育出来。但在实践任务中，普通都只用一种常用的方法去作菌落总数的测定，所得结果，只包括一群能在营养琼脂上发育的嗜中温性需氧菌的菌落数。国度规范所规则的菌落总数(Berobie bacterial count)就是指食品检样经过处置，在一定条件下培育后，所得1g或lmL检样中所合细菌菌落的总数。
食品中菌落总数的多少，直接反映着食品的卫生质量。假设食品中菌落总数多于10万个，就足以惹起绍菌性食物中毒；假设人的感官能发觉食品因细菌的繁衍而发作蜕变时，细菌数大约已到达106一107个／g(mL或cm2)。详见表5—1。
表5-1
食品种类
菌落总数/个
1g或1mL
1cm2
鸡肉
108
106~108.5〔极少〕
牛肉(生)
108
106.3~108.5
腊肠

106~108.5
鱼
106.5~106.6

蟹肉
108

贝
107

牡蛎
104~105.7

鲜蛋奶
107

冰蛋
106.7

豆腐
105~106

鲜牛乳
106~107

米饭
107~108

从表中可以看出食品的蜕变反映与菌落总数的增多有一定联络，但有时食品中细菌含量很高，即使已到达相当于同种食品已蜕变时的细菌数，而食品并未有任何蜕变现象，这种状况也是经常会遇到的。有时食品遭受污染的水平特别严重，食品中虽含有少量的细菌，由于时间持久或细菌繁衍条件不具有，就见不到蜕变现象。例如：细菌难以生长的一些干制食品和冰冻食品，它们含有细菌的多少，就可以说明这些食品在消费、运输、贮藏等进程中卫生管理的状况。
从食品卫生观念来看，食品中菌落总数越多，说明食质量量越差，也就应思索到病原菌污染的能够性愈大；当菌落总数仅大批存在时，那么病原菌污染的能够性就会降低，或许简直不存在。但也有少数状况并不完全如此，有人曾报道，从市售的一批冰蛋制品中，在所检出菌落总数在5000个／g；以下的样品中，和其中仅含菌落总数380个／g的样品中，均可分别出沙门氏菌，并且都有大肠菌群存在。再如，在一些菌落总数低的食品中(如罐头食品)，曾有细菌繁衍并已发生了毒素，但是由于环境条件的限制使细菌不能延续生长繁衍，而毒素因性状动摇不受环境的影响而仍在食品中保管。保这种状况，就不能单凭菌落总数一项目的来评定食品卫生质量的优劣。
还有一些食品，如酸泡菜、发酵乳等发酵制品，也不能单凭测定菌落总数来确定卫
生质量，由于发酵制品自身就是经过微生物的作用而制成的。
依据以上理想，食品中菌落总数的测定对评定食品的新颖度和卫生质量起着一定的
卫生目的作用，但还必需配合大肠菌群的检验和病原菌项目的检验，才干作出比拟片面
准确评定。
一、目的
1、学习并掌握细菌的分别和活菌计数的基本方法和原理
2、了解菌落总数测定在对被样品停止卫生学评价中的意义
二、原理
菌落总数是指食品经过处置，在一定条件下培育后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染水平的标志，也可以运用这一方法观察细菌在食品中繁衍的静态，以便对被检样品停止卫生学评价时提供依据。
菌落总数并不表示样品中实践存在的一切细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。
三、资料
1、食品检样
2、培育基和试剂：
75％乙醇、无菌生理盐水、15％氢氧化钠溶液、营养琼脂培育基
3、其它设备和资料
电热恒温培育箱、冰箱〔0-4℃〕、恒温水浴钨(46士1)℃、托盘天平、电炉〔可调式〕、吸管〔1mL和10mL〕、广口瓶〔500mL〕、三角瓶〔500mL〕、玻璃珠〔直径为5mm〕、平皿〔皿底直径为9cm〕、试管、试管架、酒精灯、均质器或乳钵、灭菌刀或剪刀、灭菌镊子、75％酒精棉球、玻璃蜡笔、注销薄
四、实验步骤
(一)检验顺序
菌落总数检验顺序见图5—1
(二)检样稀释及培育
①以无菌操作，将检样25g(或25mL)剪碎以后，放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预先置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充沛振摇或研磨做成1：10的平均稀释液。
固体检样在参与稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000r／min—10000r／mln的速度处置1min做成1：10的平均稀释液。
②用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管劈冉冉注入台有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内(留意吸管尖端不要触及管内稀释液，下同)，振摇试管混合平均，做成1：100的稀释液。
③另取1mL的灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1mL灭菌吸管。
④依据食品卫生规范要求或对检样污染状况的估量，选择2—3个适宜稀释度，区分在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。
⑤稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃营养琼脂培育基[可放置在(45土1)℃水浴锅内保温]注入平皿15mI一20mL，并转动平皿位混合平均，同时将营养琼脂培育基倾入加有1mL稀释液(不含样品)的灭菌平皿内作空白对照。
⑥待琼脂凝结后，翻转平板，置(36土1)℃恒温箱内培育(48土2)h取出板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得Ig(1mL)样品所含菌落总数。

检样

做成几个适当倍数的稀释液

选择2~3个适宜稀释度各以1mL之量区分参与灭菌平皿内

每皿内参与46℃过量营养琼脂

菌落计数

报告

图5-1

(三)菌落计算方法
(1)平板菌落数的选择
选取菌落数在30一300之间的平板作为菌落总数测定规范。一个稀释度运用两个平板，选取两个平扳平均数．其中一个平板有较大片状菌落生长时．那么不宜采用，而应以无片菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌落数。假定片状菌落不到平板的一半，而其他一半中菌落散布2fB平均，可计算半个平板后乘2U代表整个平皿菌落数。
(2)稀释度的选择
①应选择平均菌落数在30一300之间的稀释度，乘以稀释倍效，报告之(见表5-2例1)。
②假定有两个稀释度，其生长的菌落数均在30一300之间，那么视二者之比如何来决议。假定其比值小应报告其平均数：假定比值大于2，那么报告其中较小的数字(见表5-2例2、例3)。
③假定一切稀释度的平均菌落数均大于300，那么应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表5-2例4)。
④假定一切稀释度的平均菌落数均小于30，那么应按稀释度最低的平均菌范数乘以稀释倍数报告之(见表5-2例5)。
⑤假定一切稀释度均无菌落生长，那么以小于1乘以最低稀释倍数报告之〔见表5-2例6〕。
⑥假定一切稀释度的平均菌落数均不在30一300之间，其中一局部大于300或小于30时，近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表5-2例7)。
(3)菌落数的报告
菌落数在100以刚t1按其实有数报告；大于100时，用二位有效数字，在二位有效数字前面的数字，以四舍五入方法计算。为了延长数字前面的0的个数，可用10的指数来表示，见表5-2〝报告方式〞一栏。
表5-2 稀释度的选择及菌落数据报告方式

稀释液及菌落数
两稀释液之比
菌落总数〔个/g，个/mL〕
报告方式〔菌落总数〕
10-1
10-2
10-3
1
多不可计
164
20

16400
16000或1.6×104
2
多不可计
295
46
1.6
37750
38000或3.8×104
3
多不可计
271
60
2.2
27100
27000或2.7×104
4
多不可计
多不可计
313

31300
310000或3.1×105
5
27
11
5

270
270或2.7×102
6
0
0
0

<10
<10
7
多不可计
305
12

30500
31000或3.1×104

(四)小结
①平板培育计数法，只能检出生长的活菌，不能捡出样品中全部的细菌数，总是比实践生活在食品中的细菌数要少，这是由于食品中存在多种细菌，它们的生活特性各异，不能够在一致培育条件下全部生长出来。但是，仍能借此评定整个食品被细菌污染的水平，所以目前普通食品的卫生检验中都普遍采用这种方法。
②平板菌落计数测定食品中的菌落总数，普通均采用中温培育，特别是已属于直接供食用的制成食品，由于这些食品卫生的要求，是严厉防止消化道传染病病原菌和食物中毒病原菌污染，这些病原菌都属于嗜温性菌，因此测定细菌数时，采用中温培育是比拟合理的。
四、其他菌落总数的测定方法
上节规范平板培育汁数法虽是国度制定的菌落总数测定方法，在一定水平上能反映食品的卫生质量，但是对一些食品却不能做出准确的评价，这是由于细菌的顺应生长的温度有高温、中平和高温之分，所需的pH值和营养条件也不尽相反，并且和培育时间也有关系。例如，惹起新颖鱼类、贝类食品的新颖度降低以致于糜烂蜕变，起主要作用的细菌类群是高温细菌，为了调查这类食品新颖度的状况，就必需采取高温培育72h。又如，冰冻鲜鱼、贝类作为食品原料，也常以测定嗜冷细菌的多少，来有效地反映出它们的新颖度；再如，罐装食品，就必需以测定嗜热菌的多少来判定它们的卫生状况，等等。关于这类细菌的培育，所用的时间应相对延伸，通常以平板上生长出可见菌落来决议。由于菌落的构成需求一定的时间，假设食品中混杂有多种细菌、菌种之间生长的速度就肯定存在着差异，这样，就希望尽能够使多种细菌都能在平板上发生菌落，从而才干比拟正确地反映出食品的卫生质量。培育的时间与培育的温度有关，在不同的培育温度范围内，普通常采用的时间，如表5—3所示。
表5-3 菌落总数测定所采用的时间和温度
培育的细菌
培育温度/℃
培育时间/d
嗜温菌
30~37
〔48±3〕h
嗜冷菌
20~25
5~7
5~10
10~14
嗜热菌
45~55
2~3

五、思索题
1、菌落总数的概念。
2、测定食品中的菌落总数有什么重要意义?
3、详细论述食品中菌落总数的测定方法。
4、怎样用不同的方法测定活菌制剂中的双歧扦菌？
5、活菌计效法测定食品中的菌落数有何优缺陷?

实验六 食品中大肠菌群的测定
一、概述
(一)大肠菌群的定义及范围
依据国度1994年公布的食品卫生检验方法微生物学局部，大肠菌群(coliform bacteria)系指一群在37℃、24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
大肠菌群主要是由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成，即艾希氏菌届、拘橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及肠杆菌属，其生化特性分类见表5-4。
表5-4 大肠菌群生化特性分类表

靛基质
甲基红
V-P
拘橼酸
H2S
明胶
动力
44.5℃乳糖
大肠艾希氏菌Ⅰ
+
+
—
—
—
—
+/-
+
大肠艾希氏菌Ⅱ

+
—
—
—
—
+/-
—
大肠艾希氏菌Ⅲ
+
+
—
—
—
—
+/-
—
费劳地拘橼酸杆菌Ⅰ
—
+
—
+
+/-
—
+/-
—
费劳地拘橼酸杆菌Ⅱ
+
+
—
+
+/-
—
+/-
—
产气克雷伯氏菌Ⅰ
—
—
+
—
—
—
—
—
产气克雷伯氏菌Ⅱ
+
—
+
+
—
—
—
—
阴沟肠杆菌
+
—
+
+
—
—
+/-
—
注：+，表示阳性；—，表示阴性；+/-，表示少数阳性，少数阴性。

由上表可以看出，大肠菌群中大肠艾希氏菌I型和Ⅲ型的特点是，对靛基质、甲基红、v-P和拘橼酸盐应用四个生化反响区分为〝十十逐一〞，通常称为典型大肠杆菌；而其他类大肠杆菌那么披称为非典型大肠杆菌。
(二)大肠菌群的测定意义
1、粪便污染的目的细菌
早在1892年，沙尔丁格(Schardinger)氏首先提出大肠杆菌作为水源中病原菌污染的目的菌的意见，由于大肠杆菌是存在于人和植物的肠道内的罕见细菌。一年后，塞乌博耳德〝斯密斯(Theobold．Smith)氏指出，大肠杆菌因普遍存在于肠道内，假定在肠道以外的环境中发现，就可以以为这是由于人或植物的粪便污染形成的；从此，就末尾运用大肠杆菌作为水源中粪便污染的目的菌。
据研讨发现，成人粪便中的大肠菌群的含量为：108个／g一109个／g。假定水中或食品中发现有大肠菌群，即可证明已被粪便污染，有粪便污染也就有能够有肠道病原菌存在。依据这个理由，就可以以为这种含有大肠菌群的水或食品供食用是不平安的。所以目前为评定食品的卫生质量而停止检验时，也都采用大肠菌群或大肠杆菌作为粪便污染的目的细菌。当然，有粪便污染，不一定就有肠道病原菌存在，但即使无病原菌，只需被粪便污染的水或食品，也是不卫生的，不受人喜欢的。
2．粪便污染目的菌的选择
作为理想的粪便污染的目的菌应具有以下几个特性，才干起到比拟正确的目的作用。
①存在于肠道内持有的细菌，才干显示出目的的特异性。
⑧在肠道内占有极高的数量，即使被高度稀释后，也能被检出。
⑧在肠道以外的环境中，其抵抗力大于肠道致病菌或相似，进入水中不再繁衍。
④检验方法简便，易于检出和计数。
在食品卫生微生物检验中，可作为粪便污染目的菌依据的上述条件，粪便中数量最多的是大肠菌群，而且大肠菌群随粪便排出体外后，其存活时间与肠道主要致病菌大致相似，在检验方法上，也以大肠菌群的检验计数简便易行。因此，我国选用大肠菌群作为粪便污染目的菌是比拟适宜的。
另外，作为粪便污染的目的细菌还有：分叉杆菌(Bifidobacterium)、拟杆菌(Bacteroides)、乳酸菌、肠杆菌科中的梭状芽胞和底群链球菌等，据报道，拟杆菌是人体肠道内第二个较大的菌群；厌气性乳酸菌占人体肠道内细菌组分的50％以上，普通粪便中该菌量为109个／g—1010个／g。肠道内属于肠杆菌科的细菌，除上述的细菌外，还有克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌和副大肠杆菌等，也