重叠延伸PCR.ppt

单击此处编辑母版标题样式,编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,重叠延伸,PCR,1,重叠延伸,PCR,技术,(SOE PCR),是指在,PCR,技术的基础上，采用,具有互补末端的引物,，使,PCR,产物,形成了重叠链,，通过,重叠链的延伸,，,将不同来源的片段重叠拼接起来,的一项新技术。该技术可以很快获得其他依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物，其成功的关键是重叠互补引物的设计。,SOE PCR,在基因的,定点突变,、,长片段基因的合成,、,基因敲除,以及,目的基因的扩增,等方面有着独特的应用。,概 念,2,材 料,Buffer,（缓冲液）,dNTP,模板,引物,F上游,引物，位于,整个被,扩增的目的,序列,5,端的引物，同,DNA,负链互补，同正链序列,相同）,引物,R,（下游引物，,位于,整个被,扩增的目的,序列,3,端的引物，同,DNA,正链,互补，,同负链,序列,相同）,酶,3,引物设计,两个基因，一个命名为,M,，一个命名为,N,。,M,的序列为,5,-,ATGCATGCTAGCTAGAACGCT,ACGCTGACTACCCCCTGATC,-3,N,的序列为,5-,ATGCTAGTAGCTAGCCCCCCCC,AGGGGATAATTTTTTAAAACG,-3,首先要设计引物，假设引物的序列为：,M1:5-,ATGCATGCTAGCTAGAACGCT,-3,M2:5-,GGGGGGCTAGCTACTAGCAT,GATCAGGGGGTAGTCAGCGT,-3,N1:5-,ACGCTGACTACCCCCTGATC,ATGCTAGTAGCTAGCCCCCC,-3,N2:5-,CGTTTTAAAAAATTATCCCCT,-3,（在,M2,的,5,端加入了,20,个,N,基因,5,端的互补序列，在,N1,的,5,端加入了,20,个,M,基因,3,端的序列）,重叠,PCR,的步骤：,（,1,）,以,M1,、,M2,扩增,A,基因，,N1,、,N2,扩增,B,基因,（,2,）,回收,M,、,N,基因（获得的,M,互补序列含有引物,M2,，获得的N,序列含有引物,N1),（,3,）,以,M,、,N,为共同的模板，,M1,和,N2,为引物，扩增,M+N,（设计引物的时候使,M,、,N,有了,20,个互补的碱基，可以经过退火结合在一起）,4,构建突变基因,基因突变技术是蛋白质工程中应用的重要技术之一，可以有目的改变,DNA,序列中的碱基。它不仅可以阐明基因表达的调控机理，还可利用研究蛋白质结构与功能间的关系，改造天然蛋白质，使之更符合应用需求。基因突变包括,单个碱基或整段序列的替换,、,基因片段的插入与删除,等类型。定点突变的方法很多，而基于,PCR,的定点突变技术由于其突变效率高、操作简单、耗时短、成本低廉等优点而倍受瞩目。,SOE PCR,运用非常广泛、灵活，不受突变位置及突变类型的限制，利用此技术不仅能实现基因点突变，还能便利地实现大片段的插入及删除。,5,在重叠延伸,PCR,中，两个重叠的,DNA,片段是分别从两个独立的,PCR,扩增反应得到的。,预设突变构建在重叠区域，存在于两个扩增片段中,。设计,4,种引物，用第一对引物扩增含有突变位点及其上游序列的,DNA,片段，第二对引物被用来扩增含突变位点及其下游序列的,DNA,片段，,两个侧翼引物含野生型序列，两个突变引物含有希望引进的突变位点,，如置换插入或缺失。混合两次,PCR,的产物，由于两个突变引物有重叠区，重叠片段之间退火，延伸成异源双链，加入外侧引物进行第三次,PCR,，即可得到目标突变体。,6,7,8,9,