淋巴细胞分离与E玫瑰花环形成实验.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,淋巴细胞分离实验,E,玫瑰花环形成实验,1,实验目的,熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞（,PBMC,）的分离原理和方法,学习,E,花环试验的操作方法,观察显微镜下,E,花环的形态,2,实验原理,淋巴细胞便于在体外对机体免疫细胞进行鉴定、计数或功能测定；还可以用于,E,花环试验、淋巴细胞转化试验及淋巴细胞培养（需无菌操作）。,淋巴细胞的方便来源是外周血，分离的原则是收率较高，纯度较好，失活较低。无论采用哪种方法，应最大可能保持细胞应有活性。,3,实验原理,人外周血单个核细胞（,PBMC,）,包括淋巴细胞和单核细胞。,单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同。因此利用一种介于,1.075-1.090,之间的聚蔗糖,-,泛影葡胺（,Ficoll-Hypaque,）分离液作密度梯度离心，,离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布,从而分离出,PBMC,。,4,人血液中各种细胞的密度如下：,红细胞：,1.093,白细胞：,1.092,淋巴细胞和单核细胞：,1.075-1.090,血小板：,1.030-1.035,F/H=1.0770.001,5,肝素抗凝全血,+,等量,Hanks,液,将,F/H,管稍倾斜,将稀释血液在距分层液界面上,1 cm,处沿试管壁缓慢加至分层液上面。,应注意保持两界面清晰，勿使血液混入分层液内。,Ficoll/Hypaque(2:1),1500rpm,20 min,水平离心,6,血小板,7,用毛细吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻轻吸出该层的单个核细胞，盛入另一支离心管中。,将所得到的,PBMC,悬液用,5,倍体积的,Hanks,液或,RPMI-l640,洗涤,2,次，,1500 rpm 5min,。,8,实验原理,本实验采用的是,密度梯度离心法,。该方法是根据各类血细胞比重的差异（,外周血中各种细胞的密度不同，人红细胞密度为,1.093,，粒细胞为,1.092,，淋巴细胞为,1.0740.001,），利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立带，从而达到分离的目的。,9,实验原理,人,T,淋巴细胞表面的,CD2,分子即绵羊红细胞受体（,ER,），在一定的实验条件下，可与绵羊红细胞（,SRBC,）结合，形成玫瑰花结，称为,E,玫瑰花环试验。,该试验常用于临床检测人外周血,T,淋巴细胞的数量和比例，由此可间接反映机体的细胞免疫功能状况。,10,实验原理,T,细胞,SRBC,E,受体（,CD2,),SRBC,受体,11,实验器材,注射器、刻度吸管、毛细吸管、玻片、试管、离心管,肝素、无,Ca、Mg,的,Hanks,液、淋巴细胞分离液、双蒸水、生理盐水、,0.8%,戊二醛、瑞氏染液,家兔红细胞悬液、豚鼠淋巴细胞、灭活小牛血清,离心机、水浴箱、显微镜等。,12,实验方案,取豚鼠外周血,家兔红细胞,淋巴细胞,分离,显微镜下观察,+,13,实验步骤,淋巴细胞的分离,用,Hanks,液配成10,6,细胞/0.1,ml,14,加等量灭活小牛血清,(0.1,ml),取,0.1,ml,加入,1,绵羊红细胞,0.,1ml,混匀，37温箱放置5分钟,1000,rpm,离心5,min,15,加1小滴瑞士染色剂，轻轻混匀,取1滴于玻片上，加上盖玻片,高倍镜下观察玫瑰花环形成细胞,置4冰箱,5min,30-45min,16,结果判断,凡能结合三个以上绵羊红细胞者为玫瑰花形成,阳性细胞,。,正常人的花环形成率,50-70%,，,大致可以代表周围血中,T,细胞的百分数。,17,左,:,（甲紫染色，800）：可见2个被绵羊红细胞包围而形成玫瑰环的,T,淋巴细胞；,右,:,（吖啶橙染色）：图中可见3个染成橙黄色荧光的,T,淋巴细胞被绵羊红细胞所包围。,T,淋巴细胞玫瑰花环,18,T,淋巴细胞玫瑰花环扫描电镜，,6500,19,实验步骤,1.,取,1ml,豚鼠肝素抗凝血,于试管中，加等量,Hanks,液稀释，手动轻轻摇匀；,2.,取,2ml,淋巴细胞分离液加入,15 ml,离心管中；,3.,用毛细吸管吸取抗凝血，将抗凝血全部沿管壁缓慢加入，注意保持两种液体界面清晰,4.,室温下立即置水平式离心机以2000,rpm,离心20分钟，,离心后分为,4,层,。,5.,用毛细吸管仔细吸取血浆与分层液界面处,单个核细胞,（,PBMC,）层至一刻度离心管内。,6.,加入,5,倍以上体积的,Hanks,液洗涤3次，每次以2000,rpm,离心,10,分钟，弃上清，沉淀主要为单个核细胞）。,20,实验步骤,5.取一定量的兔血于离心管中，用无,Ca、Mg,的,Hanks,液洗涤3次，每次离心1500,rpm5min。,将压积,RBC,配制成1%红细胞悬液。,6.取0.,1ml,淋巴细胞悬液，加入等量1,RBC,悬液和0.,1ml,小牛血清混匀，37水浴1,5min,，500,rpm,离心,5min,，取出,.,（直接取样，滴加事先滴有美兰染液的载玻片上，计数早期,RE,花环）,7.置于,4,冰箱,20min,，小心吸去上清，沿管壁加1,2,滴0.8%戊二醛，轻轻转动试管小心混匀。,8.,置于,4,冰箱,15min,，取出涂片，待自然干燥后，瑞氏染色，镜下观察。,21,实验结果,计数花环个数，结合,3,个以上的,SRBC,为一个花环，计算活性,E,花环形成率，正常值为,50%-80%,。,E,花环形成率 形成花结的淋巴细胞数,/淋巴细胞总数（形成花结+未形成花结）100%,22,分析讨论,1.,你的实验结果怎样？请加以分析。,2.,能否用涂片法来观察,RE,花环形成情况？为什么？,23,