第三篇 微生物在药学中的应用.pdf

第三篇微生物在药学中的应用微生物与药学的关系密切：1、许多抗生素是微生物的代谢产物，2、选用微生物来制造医药卫生方面广泛应用的 药物，如维生素,辅酶；3、药品卫生质量的控制需要进行微生物学检验;4、药品和生物制剂应用生物工程技术生产时，采用工程菌进行，如：胰岛素、干扰素和生长 因子等。随着微生物学基础理论和实验技术的发 展，微生物在药学领域应用越来越广。在医药生产中已广泛利用微生物发酵来 制备各种药物，形成一门独立的微生物 药物学科。发酵(fermentation)：原来是指在厌氧条件 下酵母菌分解碳水化合物释放能量以及得 到产物的过程，但目前工业上把发酵扩展 为利用培养微生物来制得产物的任何过程，其中也包括利用微生物的某些酶来转化某 些物质使之成为所需物质的过程.发酵(fermentation)：原来是指在厌氧条件下酵母菌分解碳水化合物 释放能量以及得到产物的过程，目前工业上把发酵扩展为利用培养微生物来制 得产物的任何过程，其中也包括利用微生物 的某些酶来转化某些物质使之成为所需物质 的过程.发酵的分类：根据发酵时所需条件1、是否需要氧气 厌氧发酵与需氧发酵2、培养基的物理性状固体发酵与液体发酵3、工艺 浅层发酵与深层发酵现代生物技术的发展，使发酵工业的范畴突破 了利用天然微生物的传统发酵，逐步建立起新 型的发酵，可生产天然微生物所不能产生或产 生很少的特殊产物。I本篇主要内容：:1、介绍微生物发酵制品包括抗生素、维生素、:氨基酸、酶和酶抑制剂。i；2、微生物与药物变质的关系以及保证药物制剂 质量所必需的各种微生物学检验法。如:抗生素效价的微生物学检定；药物抗菌活性的测定；第十七章抗生素共生现象：互相依存，作为整体如：根瘤菌与豆科植物拮抗：生活在一起，一种生物产生物质抑制 或杀灭另一种生物。抗生素就是拮抗现象 的体现。Fleming于1929年首先发现从青霉菌中产生 的青霉素(penicillin),Waksman于 1944 年发现从链霉菌中产生的链霉素(streotomycin)。抗生素的现状目前从自然界发现和分离的抗生素已达10,000 多种，实际应用于生产和医疗上的抗生素约有 一百多种，连同各种半合成衍生物及其盐类共 约三百种。国外现有的主要抗生素在我国已有生产，其中的 庆大霉素用我国自行分离的菌种生产。国外没有的抗生素如创新霉素国外虽有，但我国发现新的成分或新的用途 如平阳霉素（或博来霉素）第一节抗生素的概念和分类一、抗生素的概念抗生素是指青霉素、链霉素等一类化合物 的总称，是人类控制、治疗感染性疾病，保障身体健康及用来防治动植物灾害的 重要化合物。原始含义：是指那些由微生物产生的、能 抑制其微生物生长的物质。习惯上：将那些由微生物产生的，极微量 即具有选择性地抑制其他微生物或肿瘤 细胞的天然有机化合物称为抗生素。的含义:抗生素是生物（包括微生物、植物和动物）在其生命活动中产生的（或由其他方法获 得的），能在低浓度下有选择地抑制或影 响其他生物机能的有机物。几个注意点：确切含义是只有来自微生物的天然产 物才能称为抗生素，而现在把经化 学改造的天然来源的抗生素或微生 物代谢的其他产物均称为半合成抗 生素。抗生素：是一个低分子量(指一个 分子有一定的化学结构，其相对质 量最大可达数千)的微生物代谢产 物，在低浓度(lmg/ml)时能抑 制其他微生物生长。医疗用抗生素需要以下要求：31、差异毒力大是指微生物或肿瘤细胞等靶体的抑制或杀灭作 用，与其对机体损害程度的差异比较。抗生素 的差异毒力愈大，则愈有利于临床应用。如青 霉素能抑制细菌细胞壁的合成，而人及哺乳类 动物细胞不具备细胞壁，因而青霉素的差异毒 力大。一般的化学消毒剂对微生物和机体的毒 力无明显差异。2、生物活性强大、有不同的抗菌谱是指在极微量的抗生素就对微生物具有抑制或 杀灭作用。抗菌作用的强弱用最低抑菌浓度（MIC）来表 示，即能抑制微生物生长所需的最低浓度（以g/ml为单位），数值越小，则作用越 强。抗菌谱：是指抗生素所能抑制或杀灭微生物的 范围和所需剂量。范围广者称为广谱抗生素,范围窄称为窄谱抗生素。良好的抗生素还应具有不易使病原菌产生 抗药性，毒副作用小，不易引起超敏反应，吸收快，血药浓度高，不易被血清蛋白结合 而失活。二、抗生素的分类目前尚无完善的系统分类方法1、根据抗生素的产生来源(1)细菌产生的抗生素 如多粘菌素和短杆菌肽(2)放线菌产生的抗生素主要来自链霉菌属 如:链霉素、卡那霉素、四环素(3)真菌产生的抗生素 如青霉菌属产生的青霉 素，头泡菌属产生的头泡菌素(4)植物和动物产生的抗生素如:地衣和藻类植物产生的地衣酸 被子植物蒜 中制得的蒜素动物脏器中制得的鱼素2、根据抗生素的化学结构分类(1)%内酰胺类抗生素如：青霉素、头抱菌素特点分子中有一个含四个原子的酰胺 环，化学上称为3内酰胺环。来源它们起初是从真菌产黄青霉菌和 头衔菌属中发现，后来从放线菌的链霉 菌属和诺卡菌属及其某些革兰阴性菌中 也发现。从生物合成角度看，被认为是 从氨基酸聚合而衍生的。机制抑制细菌细胞壁基本成分肽聚糖的合成,导致不可逆转的破坏，具有杀菌作用。早期的青 霉素只对革兰阳性和阴性菌有效。对真菌无用（细胞壁不含肽聚糖），对支原体无效（无细胞 壁）使用注意问题除个别外，此类抗生素的毒性非常低。有时出 现极为严重的超敏反应。(2)四环类抗生素 如金霉素、土霉素和四环素特点具有很广的抗菌谱及较好的治疗果来源不同种的链霉菌均能产生四环素类抗生素 结构特点由乙酸和丙二酸单位缩合的键环化 而形成；由四个环线形相连而组成。作用特点抑制核糖体蛋白的合成，其作用是 可逆的，因此具有抑制作用。抗菌谱广即革兰 阳性与阴性菌、立克次体、衣原体和某些原虫。由于其理化性质(在中性PH条件下不溶水)所决定，天然产生的只能口服，化学半合成获 得了 一些可用于注射的衍生物及作用周期较长 的。（3）氨基糖甘类抗生素（氨基环醇类），来源包括很广的由链霉菌、小单抱菌和芽泡 杆菌产生的物质。化学特征具有环状氨基醇和与之相连的氨基 糖。葡萄糖是氨基醇和氨基糖的来源。作用机制以不可逆的方式作用于核糖体而抑制 蛋白质的合成，具有杀菌作用，主要作用革兰 阳性菌。代表药物链霉素（第一个发现，也是第一个对 抗生素有效的抗生素）、卡那霉素、庆大霉素、妥布拉霉素和丁安卡那霉素。特点由于分子内含许多羟基，此类抗生素水溶 性非常好，因而不能口服，主要的副作用为肾 和耳毒性。（4）大环内酯类抗生素化学结构特点具有一个由不少于12个碳原子,并由内脂基团使其环化。他们是链霉菌的典型 产物，其生物合成是由一系列乙酸和丙酸单位 缩合而成。分类与作用特点分两类a、抗细菌大环内酯类抗生素由14-16个碳原子构成的内酯环，至少有两个糖 分子；具有抑菌作用；抗菌谱局限于革兰阳性 菌和支原体；典型代表是红霉素、竹桃霉素；为改善口服吸收率，还半合成了一些新的衍生 物。b、抗真菌和抗原虫大环内酯类抗生素特征由约30个原子组成内酯类，带有羟 基取代基团包含一系列共轨的双键，也称为多 烯类化合物，只有静脉注射才有活性。机制通过干扰细胞膜备醇类合成诱导细胞膜 畸变，因此对细菌无作用。毒副作用较大，因 而只能有限的用于最需要的病例。代表药物两性霉素B(5)肽类抗生素由氨基酸组成，经常形成环状结构；主要对革 兰阳性菌。短肽菌肽主要干扰细菌细胞膜功能;，杆菌肽主要抑制细胞壁肽聚糖的合成。代表药物多黏菌素一对革兰阴性菌有效，作 用于细胞膜；肽托霉素和雷膜拉宁一对细胞壁 合成抑制作用。（6）安莎霉素类60年代末期投入临床使用，其典型结构是 具有一条脂肪链，连接两个相对的芳香环，像是一条链子上的两个篮子。它们由放线菌 属的多种类群所构成，由一系列乙酸和丙酸 单位缩合而成。如利福霉素（对革兰阳性菌 及分枝杆菌有极强的作用）、利福平（对分 枝杆菌及葡萄球菌效果尤佳）。(7)糖肽类抗生素(二丙庚肽类)代表药物为万古霉素和替考拉宁。主要对革 兰阳性细菌有效，尤其是对耐性内酰胺类抗 生素的葡萄球菌有效。（8）抗肿瘤抗生素 属于不同化学类别，但都 以不同机制作用于DNA复制。放线菌素一由酚恶嗪酮环组成带有二个相同的肽 环，它们以其芳香环与DNA碱基嵌合，而影响 DNA功能，在其真核细胞中主要干扰RNA合成。点：环类化合物（柔红霉素和阿霉素）一具有四环结构带有一个取代的糖基，作用于拓扑 异构酶，使DNA断裂。丝裂霉素C一具有三环结构，使二个DNA链中间 形成共价键桥。博来霉素一由轮生链霉菌产生的9肽混合物，以 类酶反应使DNA链断裂。(9)其他抗生素氯霉素：抑制蛋白质合成，有抑菌作用，对革兰阴性细菌尤其沙门菌有很好的效果。林可霉素：抑制蛋白质合成。新生霉素：抑制DNA回旋酶的一个单位，作用革兰阳性菌和变形杆菌。灰黄霉素：可以在体内应用的抗真菌抗生素，由真菌产生，具有芳香环结构，生物合成是由 乙酸和丙二酸单位缩合而成，抑制细胞支架的 形成。第二节 抗生素产生菌的分离和筛选目前新抗生素的获得途径：1、从自然界分离筛选新抗生素产生菌 从土壤到海洋一般常见到极端微生物 从微生物到植物、海洋生物。2、改造现有的已知抗生素的产生菌，再经筛选 获得新得抗生素产生菌。3、从已知的抗生素进行结构改造，经筛选获得 新的半合成抗生素。4、采用新的筛选方法如：应用定向生物合成和突变生物合成的原 理，以及培养超敏细菌以寻找微量的抗生素,选用新的肿瘤模型来筛选抗肿瘤的抗生素。5、采用现代分子生物学技术产生新抗生素(1)基因克隆产生新抗生素：首先获得某 已知抗生素的结构基因，然后通过一定 的载体将基因片段导入特定的另一种抗 生素产生菌中，则可能产生完全符合人 们设计要求的新抗生素。(2)沉默基因的激活：引入抗生素生物 合成的调控基因，有可能激发抗生素产 生菌处于休眠状态或沉默状态的基因系 统，从而开启另一结构抗生素的生物合 成开关，得到新抗生素。绝大多数抗生素的原始产生菌是从自然界分离筛 选获得，以传统的分离土壤放线菌为例，说明新 抗生素产生菌的常规分离和筛选过程。S 土壤微生物的分离II、采土以春、秋两季采土为宜。去除表土，采取5 10cm深处的土壤，装入无菌容器。2、分离菌株 将24克土壤均匀散布水中,待其沉降，上清部分经适当稀释后（一般 为IO.。），涂布于适宜培养基中，并培 养至单菌落出现，挑取单个菌落移种纯培养，根据菌落的特征，初步排除相同 菌。二、筛选：是指从大量待筛选微生物中，尽快 地鉴别出有实用价值的抗生素产生菌的实验过程。1、筛选模型：是指筛选工作中所使用的实验菌。为了避免感 染病原菌的危险，尽可能选用非致病的、且能 代表某些类型致病菌的微生物作为实验菌。表17-1常用的实验菌和代表的致病微生物实验菌 代表的致病微生物金黄色葡萄球菌 枯草芽胞杆菌 耻垢分支杆菌 大肠埃希菌 白假丝酵母菌 曲霉 噬菌体革兰阳性球菌 革兰阳性杆菌 结核分枝杆菌 革兰阴性杆菌 酵母状真菌 丝状真菌 病毒、肿瘤细胞2、筛选方法抗菌抗生素一般采用琼脂扩散法。先制备含实验菌的平板，然后以无菌滤纸片蘸 取各放线菌的摇瓶培养发酵液或切取一定大小 的放线菌琼脂培养块，置于含菌平板上，培养 后观察有无抑菌圈产生。三、早期鉴别经过筛选的阳性菌应进一步做抗菌谱和抗药 谱的测定，对有价值的产生菌必须从产生菌及自 该菌产生的抗生素两方面进行鉴定。1、抗生素产生菌的鉴别 通过形态、培养、生 化反应等实验对抗生素产生菌进行初步的分类 鉴定O2、抗生素的鉴别常用理化方法如：纸层析法 测定抗生素的极性和在各种溶媒中的溶解度。纸电泳法 判断抗生素是酸性、碱性、中性或两性。薄层层析法、高效液相层析法、紫外分光光 度法等方法测定新抗生素的理化性质和结构。四、分离精制将可能产生新抗生素的放线菌进行扩大培养，然后选择合适的方法从培养液中提取有效抗生 素，进一步精制纯化。在此过程中，须跟综测 定抗生素的生物活性。五、临床前实验研究如：进行动物毒性实验（急性、亚急性、慢性）动物治疗保护性实验临床前药效实验和药理实验（抗生素在体内 吸收、分布、排泄），经系列实验认为确有前 途的新抗生素经有关部门审查合格后方可进行 临床实验。国家制定了药品临床前研究质量管理规范,（简称GLP）o、临床实验八药品临床实验管理规范简称GCP,是临床 实验的全过程，包括方案设计、组织实施、监 视、审核、记录、分析、总结和报告的标准。第三节抗生素的制备抗生素的制备分为发酵和提取两个阶段。抗生素的发酵：是指抗生素产生菌在一定培养 基条件下生物合成抗生素的过程，该过程又分 为菌体生长和抗生素生物合成两个部分。发酵后存在于发酵液中的抗生素需用一系列物 理和化学方法进行提取和精制，得到抗生素成 品。抗生素生产大致分为二个阶段：发酵和提取一般流程如下:菌种一抱子制备一种子制备一发酵一发酵液预 处理及压滤一提取及精制-成品检验一成品包一、发酵阶段:一）现代抗生素发酵的一般特点1、需氧发酵 抗生素产生菌多为需氧菌，需 要在发酵的过程中不断通入无菌空气，并进行 机械搅拌，以提供足够氧来进行生物代谢和生 物合成。2、深层发酵（或为沉没发酵），在大型发酵 罐内进行，可进行较大规模的生产。3、纯种发酵在纯种培养的抗生素发酵工业 中，应防止杂菌及噬菌体污染。（二）一般生产流程抗生素发酵阶段一般主要包括：泡子制备、种子 制备和发酵，这是进行微生物逐步扩大培养过 程。1、册子制备目的是将沙土管保存的菌种进行培 养，以制备大量抱子供下一步种子制备之用，一般于试管、扁瓶或摇瓶内进行。2、种子制备 目的是使有限数量的抱子发芽繁 殖，获得足够菌丝体以供发酵之用。在种子罐 内进行。通过种子制备，可以缩短发酵罐内菌 丝体繁殖生长的时间，增加抗生素合成的时间。一般通过种子罐1-3次，再移种到发酵罐中，分 别为二级、三级和四级发酵。3、发酵关键阶段目的是在人工培养条件下 使菌丝体产生大量的抗生素。在发酵罐内进行。发酵注意事项：1、无菌操作污染杂菌主要是种子和空气过 滤系统污染，各部件渗漏及操作。在发酵的各 阶段应取样进行杂菌检查。2、营养需要发酵培养基应供给微生物生产 繁殖以及生物合成所需的营养，其原料应尽可 能价廉，来源要广。3、pH值：加入使培养基pH值恒定的化合物：硫酸镂、硝酸钠。4、温度 酶的催化需要合适的温度。可通过罐的 夹套或蛇管导入冷水或热水以控制罐温。5、前体 前体一是抗生素分子的前身或其组成 一部分，直接参与抗生素的生物合成而自身 鸵显著变化。在一定条件下，加入前体可控制 抗生素的合成方向，并增加产量。如：在青霉素G的生产中常加入苯乙酸或苯乙 酰胺作为前体；在红霉素生产中添加丙酸、丙醇盐作为前体。但前体一般对产生菌有一定的毒性。6、通气、搅拌及消沫 发酵过程中利用溶解氧,因此必须不断经空气过滤系统输入无菌空气，同 时在发酵罐内设置搅拌和挡板以增加通气效果。为防止泡沫造成的逃液和渗漏，需用消沫浆或消 沫剂。7、发酵终点判断定期取样，测定抗生素含量、发酵液的pH值、含糖量和含氮量、菌丝含量 及形态观察。放罐应在产量的高峰期，过早或过迟都会影响 抗生素含量。八发酵液预处理及提取阶段预处理时应尽可能使抗生素转入以后要处理的 相中（多数是液相），可用调节pH值呈酸性 或碱性的方法。预处理的主要任务是除去发酵液内的杂质（Ca、Mg、Fe）及蛋白质，并经过过滤，使菌丝与 滤液分开，便于进一步提取。1、溶媒萃取法 是用一种溶剂将物质从另一种 溶剂中提取出来的方法，这两种溶剂不能互溶 或只部分互溶，能形成便于分离的两相。目前微生物制药生产中常用的提取方法。先进的萃取设备：ABE-216萃取机2、离子交换法 离子树脂交换法是应用离子交 换树脂作为吸附剂，将发酵液中物质选择性地 吸附至离子交换树脂上，然后用合适的洗脱剂 将抗生素从树脂上洗脱下来，达到分离、浓缩、提纯的目的。由于费用较低，成为提取主要方 法。如：链霉素和卡那霉素的生产。D-Ghi和间-DAP 相继加到UDP-MurNAc上，生成中间物胞壁酰 三肽。所有的反应均在细胞质内。2、单体的形成及跨膜转运3、肽聚糖链的组装及三维结构的构建合成的最后几步是由几种酶催化完成；转糖基酶转肽酶D竣肽酶内肽酶 反应发生在细胞质膜外表面.金黄色葡萄球菌五肽中第三位氨基酸是Lys,而不是DAP；第 二位氨基酸是Gin,而不是Ghi。二糖五肽合成后，五个Gly分子通过肽键连接 在Lys 的e-NH2转肽反应在五肽次末端D-Ala的竣基和末端 Gly的氨基之间。抑制细胞壁肽聚糖合成的抗生素有：1）环丝氨酸2）万古霉素和杆菌肽3）P-内酰胺类抗生素，如青霉素和头泡菌素八影响细胞膜的功能作用于细菌细胞膜抗生素对细菌有较强的杀伤作用，如：多黏菌素，属多肽类抗生素，分子内含碱性 亲水性（多肽）基团与亲脂性脂肪酸链。亲水 性基团可以与细菌细胞膜磷脂上的磷酸基形成 复合物，而亲脂链可以插入细胞膜上的脂肪链 之间，因而解聚细胞膜的结构，使细菌细胞膜 的通透性增加，导致细菌细胞内的主要成分如 氨基酸、核酸和钾离子等渗漏，细菌因而死亡。短杆菌肽：为多肽类抗生素，对革兰阳性菌有较 强的杀菌作用，其分子的氨基酸侧链也有亲水性 和输水性两种基团，也可与细胞膜的脂蛋白或脂 质结合，影响细菌细胞膜的通透性和其他功能。两性霉素B是一种抗真菌的抗生素，对新型隐球 菌和白假丝酵母菌等具有良好的抗菌作用，其 作用机制主要是能和敏感菌细胞膜上的留醇部 分结合而改变了膜的通透性，使细胞内钾离子 和其他成分渗出膜外，从而抑制了真菌的生长。三、干扰蛋白质合成抑制蛋白质合成过程的抗生素较多，主要有氨 基糖昔类、四环素类、大环内酯类以及其他一 些抗生素。它们作用于蛋白质的起始、延长、终止各阶段的不同环节。如：链霉素 对蛋白质的起始、延长、终止各 阶段均有影响，但其作用是能不可逆地与细菌 核糖体30S亚基结合，抑制蛋白质合成的起始 及密码子识别阶段。四环素类与核糖核蛋白体30s亚基16SrRNA上 靠近与氨基酰-tRNA连接的区域形成可逆复合物,使氨基酰-tRNA不能与结合部位结合，阻断蛋白 质合成的肽链延长。这类抗生素对细菌有选择性 毒性，因为原核细胞中的主动转运体系能使药物 特异性透过细胞，真核生物细胞却能主动外排此 类抗生素。大环内脂类抗生素如红霉素 与核糖核蛋白体 50S亚基结合，选择性地抑制原核细胞蛋白质 的合成林可霉素 与核糖核蛋白体50S亚基结合，抑制 蛋白质合成的肽链的延长。四、抑制核酸的合成如：博来霉素 是引起DNA单链断裂，也 可使DNA一条链上的脱氧核糖和磷酸连 接部分断裂，形成缺口，还可抑制DNA 连接酶和DNA聚合酶，干扰DNA的复制。利福霉素和利福平可直接作用于RNA聚合酶而抑制RNA的 合成，主要是特异性抑制RNA合成的初始步骤,对原核生物细胞RNA合成有选择性抑制作用，低浓度可抑制细胞RNA聚合霉，而高浓度对 DNA聚合酶几乎无作用，利福霉素类抗生素 还能抑制RNA指导的DNA聚合酶（逆转录酶）和RNA复制酶。意环类抗生素：如阿霉素 可致DNA断裂、染 色体交换率增高、染色体畸变、抑制DNA复制g五、干扰细胞的能量代谢和电子传递体系I由于大多数毒性较强，限制在临床上的广乏应用。如：抗霉素A是呼吸链电子传递体系的抑制剂，可以使细胞色素b变成还原状态，细胞色素J变 成氧化状态，抑制细胞色素b和细胞色素s间的 电子传递。另外，抗霉素还能抑制细胞能量代谢 中的氧化磷酸化过程，其机制可能是阻抑电子传 递体系放出的自由能形成高能中间体向ATP生成 的过程。第六节抗药性常见的临床致病菌金黄色葡萄球菌、铜绿假 单胞菌、变形杆菌、大肠埃希菌、志霍菌属等 抗药情况突出。所引起的各种感染已成为临床 治疗上的一大难题。抗药性的基本概念抗药性(drug resistance)：指在微生物或肿瘤细胞多次与药物 接触发生敏感性降低的现象，是微生物 对药物所具有的相对抗性。抗药性的程度一般以该药对某种微生物 的最小抑菌浓度来衡量。有些微生物由于具有一些独特的结构 或代谢，天生对药物不敏感，根据抗药 性的概念，就不能称之为抗药性，这种 现象可称为天然不敏感性（过去称为固 有抗药性）。如：铜绿假单胞菌对多种药物不敏感。改变而获得了抗药可称之为获得抗药性常常是临床上不合理用药或长期用药之后表现 出的抗药性。多重抗药性(multiple drug resistance):指某一些微生物可同时对两种以上作用机制 不同的药物所产生的抗药性，也称为多剂抗 药性，这是由于多重抗药性菌株的遗传物质 上带有多种抗药性基因。交叉抗药性(cross drug resistance)：有些微生 物对结构类似或作用机制类似的抗生素均有抗药 性的现象。赖药性(drug dependence)：由于基因突 变而致的抗药性，不仅对该药具有抗性,而且需要该药物作为特殊营养因素，这 种现象称为赖药性。耐受性(tolerance)：有一些微生物对药物抑菌作用的敏感 性未改变，而对药物的杀菌作用具有相 对抗性，即该菌在最低抑菌浓度时仍受 到抑制，但最小杀菌浓度提高，抗生素 此时表现的是抑菌，而不是杀菌作用，这种现象称为耐受性。二抗药性产生的遗传学机制微生物对药物的抗药性可由染色体或质粒，或 两者兼有介导。大多数抗药性由质粒编码，少 数由染色体编码。产生抗药性的原因可能是染 色体或质粒上带有与抗药性有关的基因。如：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，带有一种与 抗药性相关的mecA基因。有些具有多重抗药性的菌株，可能含有两个以 上的抗药质粒，或其抗药质粒上可能含有多个 抗药基因。1、自发突变加药物选择 一般认为，抗药菌所 含的抗药基因是由敏感菌的遗传物质自发突变产 生的，但突变率极低,在10410-6。极少量的抗 药菌存在于大量的敏感菌不足为害，但经临床频 繁使用抗生素后，药物杀死或抑制敏感菌的生长,而抗药性细菌继续生长繁殖，无形中对抗药菌起 了选择作用，造成抗药菌株的大量增殖，形成抗 药菌系。许多实验证明，抗药性的产生不是由于微生物 与药物接触而产生的，而是自发突变加上药物 选择的结果。2、细胞间抗药性的基因转移染色体上的抗药性可以通过三种机制由一个细 菌传递到另一个细菌：1）接合 带有抗药性基因的质粒可自行复制，代 代相传，并在不同种属间（特别是肠道）进行 转移，而导致抗药性的广泛散播。如：1958年日本爆发痢疾大流行发现：携带黄 胺、四环素、链霉素、氯霉素等抗药基因的大 肠埃希菌在肠道内通过接合将多种抗药性基因 转移给痢疾杆菌，从而抗药性的散播。2）转导 通过噬菌体将细菌染色体片段由供体菌 株向受体菌株转移。当转导片段中含有抗药性的 遗传因子时，转导将导致抗药性的传播。但频率 不高。3）转化不重要4）一些微生态制剂的活菌细胞中可能携带有一 定的抗药性基因，由于广泛大量地被服用，也 可能造成抗药性的传播。5）转座子在细胞间抗药性的基因转移中，起 重要作用。三、抗药性产生的生物化学机制是指抗药菌遗传学上的改变在生物化学上的表现O主要有三方面：1、产生使抗生素结构改变的酶（即钝化酶）一些抗药菌产生能使抗菌药物活性降低或完全 失活的酶类（包括组成酶和诱导酶）最典型代表：4内酰胺类抗生素，由于抗药菌 产生内酰胺酶（包括青霉素酶、头泡菌素酶 等），而使抗生素水解灭活。细菌供内酰胺酶产生一般两种情况：1、与具有诱导酶作用的药物接触，酶被诱导 产生，大多数是胞外酶，此类酶一般由质粒编码,在革兰阳性菌株的抗药菌中约占90%.2、细菌发生自发突变，供内酰胺酶可以稳定 地产生，与诱导药物无关，是一种组成酶，常 常结合在细胞膜上，属于固有的胞内酶。氨基糖昔类抗生素的抗药菌产生乙酰基转移 酶、磷酸转移酶、腺昔酸转移酶，以及氯霉素 类抗药菌产生的CM-乙酰基转移酶，均属抗药 酶（钝化酶）类。2、抗生素作用靶位的修饰许多抗生素通过使作用靶位失活而发挥作用。由于基因突变，一些细菌形成抗生素不能与之 结合的作用靶位，或者即使与之结合形成复合 物，但靶位仍能保持其功能，微生物就出现抗 药性。如：对链霉素抗药的突变株，就是由于抗药菌染 色体上的str基因发生突变，使得核糖体30s亚 基上的S12蛋白的构型发生改变，而核糖体上 的S12蛋白与链霉素和核糖体RNA复合体的形 成有关，因而使链霉素不能与核糖体结合，因 而不能抑制蛋白质合成而产生抗药性。青霉素的原始作用靶位是青霉素结合蛋白，它们 是与肽聚糖交联有关的酶类，抗药菌的结合蛋白 数目减少、类型改变、与抗生素亲和力下降，即 酶的性质发生改变，则造成此类抗生素的失活。黄胺类抗药菌株 由于基因突变，改变了二氢 叶酸合成酶的性质，合成了另一种对黄胺不敏 感的酶类，在黄胺存在情况下，仍能合成大量 二氢叶酸，使代谢正常进行，由此而产生抗药3、细胞膜通透性改变由于细胞膜通透性发生改变致使药物进入细胞 内减少，就使得微生物细胞表现出抗药性。如：抗四环素的细菌可能是因为一些与抗生素透 入细胞相关的膜孔蛋白结构上的改变，降低细 胞膜的饿通透性而使药物的透入浓度降低，另 外其细胞膜上可能还存在有一种使药物外排的 机制，在降低药物摄入的同时，促使药物的外 排，使之达不到抑制浓度，因而产生抗药性。铜绿假单胞菌对区内酰胺类抗生素具有天然不敏 感性，其原因之一就是其细胞膜上缺乏帮助转运 这类药物的膜孔蛋白或可利用的膜孔蛋白数量极 少，使得抗生素进入较少。微生物对抗生素的抗药性产生存在着不同的生 物化学机制，有的与抗生素的作用有关，有的 则与抗生素的作用机制无关。对同一种抗生素,可能存在不同机制抗药的菌株。当两种抗生素 作用于相同位点时，常出现交叉抗药性。四、抗药性的控制1、合理使用抗生素 不必使用抗生素时尽可能 不用，防止交叉抗药性。同时注意联合用药，因每一种药物在代谢过程中发生作用的部位不 同，联合服用两种药物可起到协同作用。2、寻找新药寻找具有新的化学结构的新抗生 素以及新的酶抑制剂，改造现有的抗生素（包 括对现有的产生菌和抗生素的改造）。目前半 合成抗生素的使用己成为克服抗药性的主要途 径。3、加强抗药机制的研究 研究抗药机制，有助 于了解细菌抗药性的本质，有效地控制细菌感 染。第七节抗生素的效价、单位及测定法一、抗生素的效价和单位抗生素是一种生物活性物质，可以利用抗生素 对生物所起作用的强弱来判定抗生素的含量。含量通常用效价或单位表示。有时二者合称效 价单位。效价(potency):指在同一条件下比较抗生素的 检品和标准品的抗菌活性，从而得出检品的效 价。即效价是检品的实际单位数与其标准量的 比值。常用百分数表示。效价=检品的抗菌活性 x 100%标准品的抗菌活性单位（unit,u）是衡量抗生素有效成分的具 体尺度。有以下几种：1、重量单位以抗生素的生物活性部分的重量 作为单位。lmg=1000单位（u）,对于不同盐 类的同一抗生素，只要它们的单位相同，即使 盐类重量不同，其实际有效含量是一致的。如:链霉素硫酸盐、十霉素盐酸盐、新霉素钠（钾）盐等以重量单位表示。2、类似重量单位是以特定的抗生素盐类纯品的重量为单位，包括 如：纯金霉素盐酸盐及四环素盐酸盐，1微克=1 单位。3、重量折算单位 以原始的生物活性单位相当的 实际重量为1单位加以折算。如：青霉素最初确定一个青霉素单位系指在 50ml肉汤培养基内完全抑制金黄色葡萄球菌生 长的最小青霉素量为1单位。青霉素纯化后，这个量相当于青霉素G钠盐0.5988微克，因而 国际上一致规定：0.5988微克为1单位，则 lmg=1670单位。4、特定单位以特定的一批抗生素样品的某一重 量作为一定单位，经有关的国家机构认可而定。如：特定的一批菌肽lmg=3000单位。标准品与国际单位(internationalunit,IU)标准品：是指与商品同质的、纯度较高的抗生素,每毫克含有一定量的单位，可供作测定效价的 标准。经国际协议，每毫克含一定量的标准品称为国 际标准品，其单位即为国际单位。抗生素的国际标准品是在联合国世界卫生组织的 生物检定专家委员会的主持下，委托指定的机构（主要是英国国立生物标准检定所）组织标定、保管和分发.我国的国家标准品由卫生部药品生物检定所检 定和分发。标示量:抗生素制剂标签上的标示量原则上以重星表示（指重量单位），但少数成分不清的抗生素（如制 霉菌素），或照顾用药习惯（如青霉素），仍沿用单 位表示.二、抗生素效价的微生物学测定法抗生素效价测定有物理、化学和微生物学方法。大多数抗生素应用微生物学测定法，即利用抗 生素对一定的微生物具有抗菌活性的特点来 测定抗生素效价的方法。该方法可以反映抗 生素的抗菌活性，与临床使用有平行关系，且灵敏度高、检品用量少，但操作繁杂、出 结果时间长(18-24h),误差较大(5%-10%)O我国1995年药典规定绝大多数抗生素的效价 测定采用微生物学方法，主要有稀释法、比 浊法和琼脂扩散法中的管碟法。琼脂扩散法中的管碟法1、设计原理管碟法是法定的抗生素效价测 定法，是利用抗生素在培养基中的扩散渗透作 用，比较标准品和检品两者对实验菌的抑菌圈 大小，以确定检品效价的一种方法。基本原理：在含有高度敏感性实验菌的琼脂平 板上放置小钢管，管内放入标准品和检品的溶 液，经过培养，当抗生素扩散至适当范围内就 产生透明的无菌生长范围，常呈圆形，称为抑 菌圈。不同浓度的抗生素其抑菌圈直径大小不 同。抗生素在一定浓度的范围内，其浓度和抑菌圈直 径呈曲线关系，如果把抗生素浓度改为对数浓度,就得到一条直线。抑菌圈的直径与抗生素浓度的 对数关系，可以用斜截式的直线方程来表示：y=a+bxy：抑菌圈直径a：截距b：斜率 x：抗生素浓度的对数2、抗生素效价测定方法(1)一剂量法：又称为标准曲线法，是用已知 效价的标准品溶液先制备出标准曲线，并在同 样条件下测出检品溶液的抑菌圈直径平均值之 差，即可在标准曲线上直接查得检品溶液的浓 度，换算成效价。由于实验时检品和标准品都 只用一个剂量，故称一剂量法。由于操作繁琐，不易规范，未收入药典。（2）二剂量法：为最常用方法，又称四点 法。可抵消斜率和截距的影响，以标准品和 检品分别作出的直线互相平行，所以又称为 平行线法是一种相对效价的计算法。三剂量法：原理和方法基本同二剂量法不同之处在于标准品和检品各设高、中、低三 组剂量，每个平板放置6个小钢管，故又称6点 法。此法不常采用，只用于标定标准品或仲裁 检品等特殊情况。3、影响抗生素生物效价测定（管碟法）的因素:抑菌圈直径，扩散系数，扩散时间，培养基厚 度，小钢管中抗生素总量以及抗生素的最小抑 菌浓度等。这些因素不仅影响抑菌圈的大小，也影响抑菌圈的清晰度。