目基因克隆专业知识讲座.pptx

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,目标基因克隆,D,利用,PCR,分离目标基因方法,C cDNA,文库法,A,鸟枪法,E,化学合成,法,B,基因文库法,目基因克隆专业知识讲座,第1页,基因工程或,DNA,重组技术三大用途前提条件是从生物体基因组中分离克隆目标基因，目标基因取得之后，或确定其表示调控机制和生物学功效，或建立高效表示系统，构建含有经济价值基因工程菌（细胞），或将目标基因在体外进行必要结构功效修饰，然后输回细胞内改良生物体遗传性状，包含人体基因治疗。,普通来说，目标基因克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣生物个体基因文库，即将某生物体全基因组分段克隆，然后建立适当筛选模型从基因组文库中挑出含有目标基因重组克隆；另一类是利用,PCR,扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目标基因，然后将之克隆表示。,目基因克隆专业知识讲座,第2页,A,鸟枪法,鸟枪法克隆目标基因基本战略,鸟枪法操作改进,鸟枪法克隆目标基因不足,目基因克隆专业知识讲座,第3页,鸟枪法克隆目标基因基本战略,随机克隆供体细胞全基因组,DNA,片段，然后经过快速有效筛选程序从众多克隆中分离出含有目标基因,目标重组子,，进而取得目标基因。鸟枪法适合用于原核细菌目标基因克隆分离,目基因克隆专业知识讲座,第4页,鸟枪法克隆目标基因基本战略,染色体,DNA,切断,超声波处理：,片段长度均一，大小可控，平头末端,全酶切：,片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目标基因断开，,大小不可控,部分酶切：,片段长度可控，含有粘性末端，目标基因完整,与载体连接,假如转化子采取菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载,体；假如转化子采取基因产物功效检测法筛选，则选择表示型载体,假如转化子采取菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为,转化受体细胞,受体细胞；假如转化子采取基因产物功效检测法筛选，则选择能使目标基因表示,受体细胞,筛选含有目标基因目标重组子,菌落原位杂交法、基因产物功效检测法（筛选模型建立）,目基因克隆专业知识讲座,第5页,鸟枪法操作改进,使用这一改进方法前提条件是：目标基因酶切图谱已知。假如已知目标基因两端酶切口，可用该酶处理染色体,DNA,，,然后与载体拼接，这么能够确保目标基因完整性，从而提升重组子中,目标重组子,出现频率,使用特征性限制性内切酶切开染色体,DNA,目基因克隆专业知识讲座,第6页,鸟枪法操作改进,比如，已知某目标基因位于,1.8,kb,SalI,片段中，将染色体,DNA,用,SalI,切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于,1.6-2.0,kb,大小区域内凝胶块，从此凝胶块中回收,DNA,片段，然后与载体进行拼接,在连接前将,DNA,片段进行分级分离,2.0,kb,1.6,kb,1.8,kb,目基因克隆专业知识讲座,第7页,鸟枪法操作改进,冻融法,滤纸法,吸附法,低融点凝胶法,溶解法,凝胶,DNA,片段回收技术,目基因克隆专业知识讲座,第8页,鸟枪法克隆目标基因不足,工作量较大，需要了解目标基因背景知识,不能取得最小长度目标基因,不能除去真核生物目标基因内含子结构,目基因克隆专业知识讲座,第9页,B,基因文库构建,基因文库基本概念,基因文库构建程序,基因组文库重组克隆排序,目基因克隆专业知识讲座,第10页,基因文库基本概念,基因库与基因文库,基因库（,gene pool）,特定生物体全基因组集合（天然存在）,基因文库（,gene library or gene bank）,从特定生物个体中分离全部基因，这些基因以克隆形式,基因组文库,（含有全部基因）,存在（人工构建）。依据构建方法不一样，基因文库分为：,cDNA,文库,（含有全部蛋白质编码结构基因）,目基因克隆专业知识讲座,第11页,基因组,DNA,文库,(genomic library),：,指将某生物体全部基因组,DNA,用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围,DNA,片段，与适当载体体外重组并转化对应宿主细胞取得全部阳性生物群落,cDNA,文库,(cDNA library),：,指将某生物基因组转录部分或全部,mRNA,经反转录产生各种,cDNA,片段分别与克隆载体重组，贮存于受体生物群体中，这么生物群体称为,cDNA,文库,目基因克隆专业知识讲座,第12页,依据构建文库所用载体不一样可将基因文库分为,质粒文库,噬菌体文库,黏粒文库,人工染色体文库,M13 phage vector,、,phage vector,、,P1 phage vector et.,Cosmid vector,YAC,、,BAC,、,PAC,、,TAC,目基因克隆专业知识讲座,第13页,基因文库基本概念,基因文库构建基本战略,用鸟枪法构建基因组文库，,材料来自染色体,DNA,用,cDNA,法构建,cDNA,文库，,材料来自,mRNA,在高度分化生物体中，不一样组织和细胞在不一样时段,mRNA,种类不一样（即基因表示谱不一样），所以同种生物体,cDNA,文库,普通还有组织细胞界定，如肝组织,cDNA,文库或胚胎组织,cDNA,文库等。很显然，,cDNA,文库信息量远小于基因组文库,目基因克隆专业知识讲座,第14页,基因文库基本概念,基因文库完备性,基因文库,完备性,是指：在构建基因文库中任一基因存在概,率，它与基因文库最低所含克隆数,N,之间关系可用下式表示：,N=ln(1 P)/ln(1 f),其中：,P=,任一基因被克隆（或存在于基因文库中）概率,f=,克隆片段平均大小/生物基因组大小,比如，人单倍体,DNA,总长为,2.9,x 10,9,bp,，,基因文库中克隆片段,平均大小为,15,kb，,则构建一个完备性为,0.9,基因文库最少需要,45,万个克隆；而当完备性提升到,0.9999,时，基因文库最少需要,180,万个克隆,目基因克隆专业知识讲座,第15页,基因文库基本概念,基因文库质量标准,除了尽可能高,完备性外，,一个理想基因文库应具备以下条件：,重组克隆总数不宜过大,以减轻筛选工作压力,载体装载量最好大于基因长度,防止基因被分隔克隆,克隆与克隆之间必须存在足够长度重合区域,以利克隆排序,克隆片段易于从载体分子上完整卸下,重组克隆能稳定保留、扩增、筛选,目基因克隆专业知识讲座,第16页,基因文库构建程序,基因组,DNA,制备,为了最大程度地确保基因在克隆过程中完整性，,用于基因组,文库构建,DNA,在分离纯化操作中应尽可能防止过分断裂。制备,DNA,分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端,DNA,片段,比率就越低，重组率和完备性也就越高,A,A,A,A,用常规方法制备染色体,DNA,长度普通在100,kb,左右,假如先将细胞固定在低融点凝,胶中，然后置入含有,SDS、,蛋,白酶,K、RNase,缓冲液中浸泡，可取得1000,kb,大小,DNA,片段,目基因克隆专业知识讲座,第17页,基因文库构建程序,基因组,DNA,切割,用于基因组,文库构建,DNA,片段切割普通采取,超声波处理,和,限制性内切酶,部分酶切,两种方法，其目标是：,第一，确保,DNA,片段之间存在部分重合区,第二，确保,DNA,片段大小均一,超声波处理,后,DNA,片段呈平头末端，需加装人工接头,部分酶切法,普通选取四对碱基识别序列限制性内切酶,，,如：,Sau3AI,或,MboI,等，这么,DNA,酶解片段大小可控,连接前，上述处理,DNA,片段必须依据载体装载量进行分级,分离，以杜绝不相干,DNA,片段随机连为一体！,目基因克隆专业知识讲座,第18页,基因文库构建程序,载体和受体选择,出于压缩重组克隆数量，用于,基因组,文库,构建,载体通常选,装载量较大,l,-DNA,或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和,人类）需使用,YAC,或,BAC,载体,l,-DNA,因为绝大多数真核生物,mRNA,小于,10,kb，,所以用于,cDNA,文库,构,建载体,通常选质粒,上述几个,载体最大装载量以下：,质粒,考斯质粒,15,kb,25,kb,45,kb,BAC,300,kb,YAC,400,kb,用于基因,文库构,建受体则依据载体使用大肠杆菌或酵母菌,目基因克隆专业知识讲座,第19页,基因文库构建程序,从基因文库中筛选目标基因,大型基因组,文库,普通由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除,了一些含有特殊功效蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白,编码基因等）能够采取特殊正选择筛选,程序（如,抗药性筛选法,、,酵母双杂交技术,等）直接筛选外，普通基因组,文库筛选均需多轮,操作步骤,目基因克隆专业知识讲座,第20页,酵母双杂交体系（,Yeast Two-hybrid system,）,真核生物转录因子大多是由两个结构上分开、功效上独立结构域组成。如,GAL4,N,端,1-147aa,是,DNA,结合域（,BD,），其,C,端,768-881aa,是转录激活域（,AD,）。普通情况下，,AD,能与,GAL4,效应基因开启子上游特定,DNA,区段（,UAS,）相结合，而此时，,AD,则推进了转录起始。,目基因克隆专业知识讲座,第21页,d.,从大肠杆菌中分别提取这两种重组质粒,DNA,，共转化感受态酿酒酵母菌株。,e.,将共转化酵母菌株涂布于缺乏,Leu,，,Trp,和,His,培养基上，筛选表示相互作用杂种蛋白阳性菌落。,主要试验过程,a.,选择缺失,GAL4,编码基因酵母寄主菌株,-SFY526,或,HF7c,；,b.,构建带有,GAL1 UAS-,开启子,-lac Z,（,His3,）转化载体,;c.,把已知靶蛋白质编码基因克隆到,pGBT9,多克隆位点上，把全部,cDNA,都克隆到,pGAD424,载体上，组成,cDNA,表示文库。,目基因克隆专业知识讲座,第22页,目基因克隆专业知识讲座,第23页,目基因克隆专业知识讲座,第24页,目基因克隆专业知识讲座,第25页,基因文库构建程序,从基因文库中筛选目标基因,密集铺板（1-10万）,杂交,挖取,铺板,铺板,目标重组克隆,目基因克隆专业知识讲座,第26页,基因文库构建程序,基因文库构建技术性问题,在基因组,文库构建过程中，,最应引发重视问题是：,禁止外源,DNA,片段之间连接！,为了防止上述情况发生，,可采取以下办法组合：,将待连接,DNA,片段依据载体装载量分级分离,用碱性磷酸单酯酶除去,DNA,片段末端磷酸基团,用,TdT,酶在,DNA,片段末端上增补同聚尾末端,目基因克隆专业知识讲座,第27页,基因组文库重组克隆排序,大型基因文库（包含人基因文库）构建在技术上并不十分困难，假如一个,YAC,基因文库插入片段总和为整个基因组十倍以上时，普通就能从基因文库中调出任何一段,DNA,序列。然而基因文库克隆都是随机序列，必须将全部克隆排列成一个像天然染色体,DNA,上所表现出信息次序。这项工作工作量可能远大于基因组文库构建，属于基因文库后期制作,目基因克隆专业知识讲座,第28页,基因组文库重组克隆排序,将单一,YAC,克隆插入,DNA,片段,用限制性内切酶分布均匀地水解成若干片段，末端标识同位素,然后再用,Sau3AI,或,MboI,将末端标识,DNA,片段降解成碎片，聚丙烯酰胺凝胶电泳，每,10,个,YAC,克隆走在同一块板上，形成10个克隆特征性,DNA,指纹图谱,电脑分析指纹图谱，如发觉任何两个克隆,DNA,指纹图谱有部分相同，则其两个,YAC,片段就有相互重合可能性，于是这两个,YAC,克隆,DNA,片段克隆在染色体上是排列一起,酶切片段末端标识法,目基因克隆专业知识讲座,第29页,酶切片段末端标识法,H,H,H,H,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,单一克隆指纹图谱,十克隆指纹图谱,载体,DNA,克隆,DNA,目基因克隆专业知识讲座,第30页,基因组文库重组克隆排序,将若干,YAC,克隆固定在薄膜上，并复制二十份薄膜；合成,20,种不一样序列短探针，其序列是随机,用,20,种探针随机定位杂交（一对一）,20,份,YAC,克隆薄膜,假如某两个克隆同时对同一个探针展现杂交阳性反应，则这两个克隆有可能是相互重合。若将杂交阳性结果记为“1”，而阴性结果记为“0”，可清楚地列成一张表，最终排出上述,YAC,克隆排列次序,随机探针联合杂交法,目基因克隆专业知识讲座,第31页,01,02,03,04,05,06,07,08,09,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,A,B,C,D,E,F,G,01,02,03,04,05,06,07,08,09,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,D,A,B,C,E,F,G,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,目基因克隆专业知识讲座,第32页,01,04,12,06,13,14,02,14,07,19,11,15,05,08,16,03,10,09,20,18,D,A,B,C,E,F,G,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,F,C,A,D,G,E,B,目基因克隆专业知识讲座,第33页,基因组文库重组克隆排序,从基因文库中任取一个克隆作为染色体走读起点，将之两端序列分别亚克隆,，,亚克隆片段在,0.5-2.0,kb,范围内,分别以上述亚克隆,DNA,片段为探针，杂交同一基因文库，杂交阳性克隆中插入,DNA,片段必定与起点克隆所含,DNA,片段连锁在一起,然后再以阳性克隆片段两端序列为探针，进行第二步走读，直至线型染色体,DNA,端点,染色体走读法（,chromosome walking）,目基因克隆专业知识讲座,第34页,染色体走读法（,chromosome walking）,走读起点克隆片段,亚克隆旁测序列,探针标识,第一轮杂交,阳性克隆,阳性克隆,第二轮杂交,第二轮杂交,目基因克隆专业知识讲座,第35页,染色体走读法（,chromosome walking）,走读起点克隆片段,目基因克隆专业知识讲座,第36页,cDNA,文库,DNA,片段是互补,DNA(complementary DNA,cDNA),cDNA,是由生物某一特定器官或特定发育时期细胞内,mRNA,经体外反转录后形成双链,cDNA,cDNA,文库代表生物某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上基因群体，并不能包含该生物全部基因，且这些基因在表示丰度上存在很大差异。,C cDNA,法,目基因克隆专业知识讲座,第37页,细胞总,RNA,提取和,mRNA,分离,第一链,cDNA,合成,第二链,cDNA,合成,双链,cDNA,克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖,cDNA,文库构建共分四步,目基因克隆专业知识讲座,第38页,Step,细胞总,RNA,提取和,mRNA,分离,cDNA,文库构建是以,mRNA,为起始材料，,mRNA,在总,RNA,中所占百分比很小，所以从总,RNA,中富集,mRNA,是构建,cDNA,文库和其它应用所必需进行步骤。经过降低,rRNA,和,tRNA,含量，可大大提升筛选到目标基因可能性。,当前纯化,mRNA,方法都是在固体支持物表面共价结合固定一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成寡聚核苷酸,oligo,（,dT,）,链，由它与,mRNA,Poly,（,A,）尾巴杂交，从而吸附固定住,mRNA,，进而将,mRNA,从其它组分中分离出来。,目基因克隆专业知识讲座,第39页,指导合成高分子量蛋白质能力，指导合成目标多肽能力，,mRNA,大小，总,mRNA,制剂指导合成,cDNA,第一链长分子能力,mRNA,完整性,高丰度,mRNA,：珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白，在特定细胞中占,50-90%,。,低丰度,mRNA,：含量,0.5%,被称为低丰度或稀有,mRNA,mRNA,丰度,目基因克隆专业知识讲座,第40页,目基因克隆专业知识讲座,第41页,cDNA,法克隆目标基因基本战略,mDNA,5,ppp,5,G,G,AAAAAAAAAAAAAA,OH,3,5,ppp,5,G,G,AAAAAAAAAAAAAA,OH,3,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,5,ppp,5,G,G,AAAAAAAAAAAAAA,OH,3,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,cDNA,第一链,引物,退火,逆转录酶,dNTPs,合成,DNA,时需要引物引导，当前惯用引物主要有两种，即,Oligo,（,dT,）和随机引物。,Oligo,（,dT,）引物普通包含,10,20,个脱氧胸腺嘧啶核苷和一段带有稀有酶切位点引物共同组成，随机引物普通是包含,6,10,个碱基寡核苷酸短片段。,Step First cDNA strand synthesize,目基因克隆专业知识讲座,第42页,煮沸,NaOH,本身引导法：,取得双链,cDNA,5端会有几对碱基缺失,AAAAAAAAAAAAAA,5,ppp,5,G,G,AAAAAAAAAAAAAA,OH,3,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,AAAAAAAAAAAAAA,OH,3,TTTTTTTTTTTTTT,OH,3,Klenow,dNTPs,S1,Step Second strand synthesize of cDNA,目基因克隆专业知识讲座,第43页,c,DNA,第二链合成,DNApol dNTPs,RNaesH,置换合成法：,取得双链,cDNA,5端也会有几对碱基缺失,5,ppp,5,G,G,AAAAAAAAAAAAAA,OH,3,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,AAAAAAAAAAAAAA,p,5,5,S1,AAAA,TTT,OH,3,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,5,TTTTTTTTTTTTTT,OH,3,AAAAAAAAAAAAAA,5,5,TTTTTTTTTTTTTT,3,3,T4-DNA ligase,目基因克隆专业知识讲座,第44页,c,DNA,第二链合成,dCTP,TdT,引导合成法：,取得双链,cDNA,能保留完整5端序列,5,ppp,5,G,G,AAAAA,OH,3,TTTTT,p,5,3,HO,5,ppp,5,G,G,AAAAA,CCCCCCC,OH,3,3,HO,CCCCCCC,TTTTT,p,5,3,HO,CCCCCCC,TTTTT,p,5,3,HO,CCCCCCC,TTTTT,p,5,5,p,GGGGGGG,3,HO,CCCCCCC,TTTTT,p,5,5,p,GGGGGGG,AAAAA,OH,3,NaOH,退火,Klenow,dNTPs,目基因克隆专业知识讲座,第45页,Step dscDNA cloning and transformation,双链平头,cDNA,通常可用以下三种方法克隆入载体中：,平头末端直接与载体连接，但插入片段无法回收,平头两端分别接同聚物尾，最好是,AT,同聚物尾，这么重组分子可经过加热局部变性和,S1,核酸酶处理回收插入片段,加装人工接头引入酶切口，方便插入片段回收,将重组子转到受体中，扩增、检测阳性克隆,目基因克隆专业知识讲座,第46页,cDNA,法分离目标基因基本程序,特异分离程序,提取细胞总,mRNA,，,琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标,mRNA,，,由此合成双链,cDNA,，,然后进行克隆,特异分离程序较适合用于,mRNA,丰度极高目标基因克隆如血红蛋白基因等,目基因克隆专业知识讲座,第47页,cDNA,法分离目标基因基本程序,差异分离程序,利用两组细胞,mRNA,种类差异，分离克隆差异,mRNA,所对应,cDNA,，,因而这种程序较适合用于分离克隆新基因,比如：正常大鼠,FR3T3,成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表示，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功效,目基因克隆专业知识讲座,第48页,差异分离程序,多瘤病毒感染,FR3T3,细胞,正常,FR3T3,细胞,总,mRNA,总,mRNA,cDNA,双链,cDNA,单链,cDNA,提取,mRNA,合成,cDNA,合成第二链,克隆,提取,mRNA,共价交联,上柱,原位杂交,病毒诱导表示基因,cDNA,克隆,目基因克隆专业知识讲座,第49页,筛选目标基因片段差异杂交及减法杂交技术,差异杂交（,differential hybridization,）,差异杂交,：又称为差异筛选（,differential screening,），尤其适合用于分离特定组织中或发育阶段表示基因以及受生长因子调整基因，也可用于分离经特殊处理诱导表示基因,目基因克隆专业知识讲座,第50页,目基因克隆专业知识讲座,第51页,差异杂交不足,灵敏度低，尤其是对低丰度,mRNA,。,工作大，耗时耗钱。需要筛选大量杂交滤膜，判定大量噬菌斑或克隆片段。,重复性差,目基因克隆专业知识讲座,第52页,减法杂交（,subtractive hybridization,）,减法杂交：,又叫差减杂交、扣除杂交、减数杂交或消减杂交，是经过,DNA,复性动力学原理富集目标基因序列，并以此构建减数文库（,subtractive library,）方式来进行目标基因分离克隆。,减法杂交对象,Genomic DNA,cDNA,Genomic DNA subtractive hybridization,mRNA subtractive hybridization,克隆两样品存在特异性基因,克隆两样品差异表示基因,目基因克隆专业知识讲座,第53页,减法杂交本质,是除去那些普遍共同存在或非诱发产生,cDNA,序列，从而使欲分离目标基因序列得到有效富集,Differential cDNA between T and B cell,content 2%in T cell,total positive cloning:35,which purpose gene(T-cell receptor)is contained,目基因克隆专业知识讲座,第54页,减法杂交也可用于分离缺失突变基因,目基因克隆专业知识讲座,第55页,减法杂交缺点,假阳性：回收,cDNA,量少、轻易丢一些,mRNA,以及,mRNA,降解造成,cDNA,过短而造成,重复性易解低,改进方法,使用磁珠减数技术（,magnet assisted subtractive technique,，,MAST,）,Oligo(dT),30,乳胶和,PCR,结合方法,酶降解减数法,(enzymatic degrading subtractive,EDS),目基因克隆专业知识讲座,第56页,cDNA,法克隆目标基因不足,并非全部,mRNA,分子都含有,polyA,结构,细菌或原核生物,mRNA,半衰期很短,mRNA,在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，,分离纯化困难,仅限于克隆蛋白质编码基因,目基因克隆专业知识讲座,第57页,D PCR,法,PCR,（,Polymerase Chain Reaction,）,法，又称为,聚合酶,链反应,或,PCR,扩增技术,，是一个高效快速体外,DNA,聚合程序,使用,PCR,法克隆目标基因前提条件是：已知待扩增目标,基因或,DNA,片段两侧序列，依据该序列化学合成聚合反应必,需双引物,利用,PCR,定向扩增目标基因,目基因克隆专业知识讲座,第58页,5,5,目标基因,5,变性,加热,5,5,引物,退火,5,5,底物,聚合,5,5,5,5,加热,变性,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,退火 引物,底物,聚合,加热,变性,引物,退火,底物,聚合,1,2,3,目基因克隆专业知识讲座,第59页,由,Taq DNA,聚合酶扩增,PCR,产物中，其,3,末端总是会带有一个非模板依赖型突出碱基，而且这个碱基几乎总是,A,，,因为,Taq DNA,聚合酶对,dATP,含有优先聚合活性。因为该突出碱基存在，克隆时即能够采取,TdT,末端加同聚尾方法与载体拼接，也能够使用专门,T,载体,克隆,PCR,克隆目标基因基本程序,5,5,A,A,T,T,5,5,PCR,扩增产物,T,载体,T7,lacZ,MCS,ori,Ap,r,目基因克隆专业知识讲座,第60页,DNA,插入诱变结合,PCR,分离目标基因,当一段特定,DNA,序列插入到植物基因组中目标基因内部或其邻近位点时，便会诱发该基因发生突变，并最终造成表型改变，形成突变植株。假如此段,DNA,序列是已知，以其作为分子探针可从突变株基因组文库中筛选到突变基因，再利用此突变基因作为探针在野生型植株基因组文库中筛选到目标基因。因为插入,DNA,序列相当于人为地给目标基因加上一段已知序列标签，,DNA,插入诱变法又叫,DNA,标签法（,DNA tagging,）,DNA,插入诱变法,转座子标签法（,transposon tagging,）,T-DNA,标签法（,T-DNA tagging,）,目基因克隆专业知识讲座,第61页,转座子标签法（,transposon tagging,）,1951,年,Barbara Mclintock,首先在玉米中发觉了控制元件，以后命名为转座元件或,转座子,(transposon),。,转座子,是染色体上一段可移动,DNA,片段，它可从染色体一个位置跳到另一个位置。当转座子跳跃而插入到某个功效基因时，就会引发该基因失活，并诱导产生突变型，而当转座子再次转座或切离这一位点时，失活基因功效又可得一恢复。,目基因克隆专业知识讲座,第62页,转座子,转座子（,DNA-DNA,方式转座转座子）,逆转座子（,retrotransposon,）,自主转座元件,非自主转座元件,转座子,能够经过,DNA,复制或直接切除两种方式取得可移片段，重新插入基因组,DNA,中。自主转座元件本身能够编码转座酶而进行转座，非自主转座元件则需在自主元件存在时方可转座，以玉米,Ac/Ds,体系为例，,Ac(Activator),属于自主元件，,Ds(Dissociation),则是非自主元件，必需在,Ac,元件存在下才能转座,目基因克隆专业知识讲座,第63页,逆转座子又称为返座元,(retroposon),，是近年新发觉由,RNA,介导转座转座元件，在结构和复制上与反转录病毒,(retrovirus),类似，只是没有病毒感染必须,env,基因，它经过转录合成,mRNA,再逆转录合成新元件整合到基因组中完成转座，每转座,1,次拷贝数就会增加,1,份，所以它是当前所知高等植物中数量最大一类可活动遗传成份。,当前共发觉了,3,种类型反转录转座子：,Tyl-copia,类，,Ty3-gypsy,类和,LINE(long interspersed nuclear Clements),类转座子，前两类是含有长末端重复转座子，,LINE,类转座子没有长末端重复。高等植物中反转录转座子主要属于,Tyl-copia,类，分布十分广泛，几乎覆盖了全部高等植物种类,目基因克隆专业知识讲座,第64页,克隆转座子主要有两条路径：,依据序列同源性，在基因组不一样位置分离同一家族转座子组员,利用抗体识别或,cDNA,探针从野生型植株中取得表示量降低或不稳定基因座序列，再从突变体中分离得到对应转座子,名 称,来 源,类 型,Ac(Activator),玉米,类自主型转座子,Ds(Dissociation),玉米,类非自主型转座子,Mu(Mutator),玉米,类自主型转座子,Spm/En,玉米,类自主型转座子,Tam,金鱼草,类自主型转座子,dTphl,拟南芥,类自主型转座子,Tos17,水稻,反转录转座子,目基因克隆专业知识讲座,第65页,Ac-Ds,系统：,Ac,：,4565 bp,末端反向重复序列（,11 bp,）,自主元件,转座酶基因,Ds,：,Ac,缺失序列，结构多样,末端反向重复序列（,613,）,非自主元件,目基因克隆专业知识讲座,第66页,反向重复序列,转座酶,足迹,目基因克隆专业知识讲座,第67页,T-DNA,标签法（,T-DNA tagging,）,目基因克隆专业知识讲座,第68页,目基因克隆专业知识讲座,第69页,差示分析法分离目标基因,mRNA,差异显示技术（,mRNA differential display by PCR,DD-PCR,）,代表性差异分析技术（,representation difference analysis,RDA,）,抑制性减法杂交（,suppression subtractive hybridization,SSH,）,mRNA,差异显示技术,mRNA,差异显示技术：,或称为差异显示反转录,PCR,（,differential display,reverse transcription PCR,DDRT-PCR,）,P.Liang and A.D.Pardee found in 1922,目基因克隆专业知识讲座,第70页,mRNA,差异显示技术：,是经过对某一特定细胞类型或发育阶段表示,mRNA,与另一细胞类型或发育阶段表示,mRNA,进行,RT,PCR,扩增，并利用电泳和放射性自显影技术来对不一样细胞类型或发育阶段进行对比显示差异，进而寻找不一样细胞类型或发育阶段代表性基因基因克隆方法,mRNA,差异显示技术基本原理,绝大多数真核生物,mRNA,（除极少数特例，如组蛋白基因）都有,polyA,尾巴，在,polyA,尾巴前（,5,上游）两个碱基，除第二为情况之外，只有,12,种可能,目基因克隆专业知识讲座,第71页,将这,12,种序列互补序列作为下游引物，反转录,mRNA,，合成第一链,cDNA,。这种引物通常叫,锚定引物,通式,5T,11,MN,或,5T,12,MN,M,：,A,、,G,、,C,N,：,A,、,T,、,G,、,C,目基因克隆专业知识讲座,第72页,这,12,个锚定引物中每一条引物都可扩增出某一特定细胞总,cDNA,1/12,，由此可将整个,mRNA,在,cDNA,水平上，分成大致相等但序列不一样,12,份亚群体。这些群体中，代表某一特定细胞类型或发育阶段,mRNA,种含量是相当低。,要分离在某一特定细胞类型或发育阶段表示,mRNA,、而在另一细胞类型或发育阶段不表示或表示量不一样基因，就要进行,PCR,扩增,引物,上游引物：,3,端,12,种锚定引物,下游引物：,5,端,20,种,10mer,随机引物,(arbitrary primer,AP),引物对组合,240,对,目基因克隆专业知识讲座,第73页,在,PCR,反应加入,35,S,可,32,P,标识,dNTP,，经电泳和放射性自显影后，可每一对引物可扩增出,60,160,条分子量在,100,500bp,cDNA,条带。在同一胶上比较两个不一样品在同一引物条件下扩增出,cDNA,带就可显示出差异表示条带,mRNA,差异显示技术基本操作过程,目基因克隆专业知识讲座,第74页,目基因克隆专业知识讲座,第75页,目基因克隆专业知识讲座,第76页,目基因克隆专业知识讲座,第77页,E,化学合成法,化学合成法基本战略,化学合成单元操作,DNA,化学合成用途,目基因克隆专业知识讲座,第78页,化学合成法基本战略,全基因合成,化学合成目标基因前提条件是基因,DNA,序列已知，有三种战略：,小片段粘接法：,混合退火,依据目标基因全序列，分别合成,12-15,碱基长单链,DNA,小片段,T4-DNA,连接酶连接,克隆入适当载体,目基因克隆专业知识讲座,第79页,化学合成法基本战略,全基因合成,补钉延长法：,混合退火,依据目标基因,两条互补链,全序列，分别合成,12-15,碱基长单链,DNA,小片段以及,20-30,碱基长单链,DNA,中片段,T4-DNA,连接酶连接,克隆入适当载体,Klenow,酶聚合,目基因克隆专业知识讲座,第80页,化学合成法基本战略,全基因合成,大片段酶促法：,混合退火,依据目标基因,全序列，分别合成,40-50,碱基长单链,DNA,片段,T4-DNA,连接酶连接,克隆入适当载体,Klenow,酶聚合,目基因克隆专业知识讲座,第81页,化学合成法基本战略,全基因合成,上述三种方法各有利弊：化学合成,DNA,单片段愈短，收率就愈高，但因为化学合成份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目标基因时，即使化学合成份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成收率极低，比如，每聚合一个单体产物收率为,95%,则合成,50,个碱基长,DNA,单链大片段总收率只有,7.7%,目基因克隆专业知识讲座,第82页,化学合成法基本战略,探针等寡聚核苷酸合成,在一些情况下，往往只知道目标基因编码产物部分氨基酸,序列，而基因序列未知，此时需要从已知氨基酸序列推测为其,编码,DNA,序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或,cDNA,法得到,重组子，最终取得含有目标基因,目标重组子,因为大多数氨基酸拥有,简并密码子,，故在探针序列设计时,必须考虑以下问题：,生物体对简并密码子,偏爱性,，,合成系列探针,探针应含有足够长度，通常在,17-20,个核苷酸之间,探针内部不应出现可能互补区域,目基因克隆专业知识讲座,第83页,化学合成法基本战略,探针等寡聚核苷酸合成,某段连续氨基酸序列,Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile,全部可能,DNA,序列,TGT,ATG,GAC,GAA,ATG,AAA,AGA,AAC,ATA,C T,G,ATG,G,G,T,T,C,CGA,CGG,CGT,CGC,设计简并探针序列,TG,T,ATG,GA,C,GA,I,ATG,A,TG,T,ATG,GA,T,GA,I,ATG,A,TG,C,ATG,GA,C,GA,I,ATG,A,TG,C,ATG,GA,T,GA,I,ATG,A,A,G,另外还能够参考各种生物体,EST,数据库进行倾向性简并序列设计,expressed sequence tag,目基因克隆专业知识讲座,第84页,化学合成单元操作,化学合成,DNA,实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包含：,基团保护,、,分离,、,缩合,、,分离,、,去保护,五大操作单元。,从反应机理上来讲，,DNA,化学合成有,磷酸二酯法,、,磷酸三酯法,、,亚磷酸液三酯法,；详细操作过程又有,液相合成,和,固相合成,两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物分离程序简便，,DNA,合成仪就是依据,固相亚磷酸液三酯法,原理设计,目基因克隆专业知识讲座,第85页,化学合成单元操作,O,H,G,H,H,H,H,O,CH,2,O,DMT,P,O,Me,N,CH,Me,Me,CH,Me,Me,H,DMT：,二甲氧基三苯甲基,激活,缩合,氧化,脱取代基,玻璃珠,连接臂,目基因克隆专业知识讲座,第86页,DNA,化学合成用途,合整天然基因,修饰改造基因,设计新型基因,制备探针、引物、接头,如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素,如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等,基因等,目基因克隆专业知识讲座,第87页,