免疫学技术专题知识.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,免疫学技术专题知识,免疫学技术专题知识,第1页,经典免疫学方法：,一、凝集反应（,agglutination）,细菌、红细胞等颗粒性抗原与对应抗体结,合后形成凝集团块反应。,1、,直接凝集反应,2、间接凝集反应,3、间接凝集抑制反应,免疫学技术专题知识,第2页,免疫学技术专题知识,第3页,二、沉淀反应（,precipitation）,血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶,性抗原与对应抗体结合后出现沉淀物反应。,1、单向免疫扩散（,single immunodiffusion）,2、双向免疫扩散（,double immunodiffusion）,3、免疫电泳（,immunoelectrophoresis）,4、,火箭免疫电泳（,rocket immunoelectrophoresis）,5、免疫浊度测定（,immunonephelometry）,免疫学技术专题知识,第4页,免疫学技术专题知识,第5页,免疫学技术专题知识,第6页,免疫学技术专题知识,第7页,免疫学技术专题知识,第8页,免疫学技术专题知识,第9页,免疫浊度测定：,可溶性,Ag+Ab，,二者百分比适当时，在特殊缓冲,液中快速形成一定,AgAb,复合物，使反应液出,现浊度。,透射比浊法,散射比浊法,速率散射比浊法,终点散射比浊法,免疫学技术专题知识,第10页,免疫学技术专题知识,第11页,一定要保持抗体过量，以维持抗原抗体复合物相,对不溶解性。,免疫学技术专题知识,第12页,该方法分析范围主要检测是血浆、体液,中特定蛋白系列。如,Ig、,补体、血浆蛋白、,炎性反应蛋白、一些小分子量治疗性药品,浓度等。,免疫学技术专题知识,第13页,第一节,免疫学检测常见标识技术,免疫学技术专题知识,第14页,免疫标识技术（,immunolabelling technique,）,指用荧光素、放射性核素、酶、发光剂或电,子致密物质（胶体金、铁蛋白）作为示踪剂标,记抗体或抗原进行抗原,抗体反应。,优点：高灵敏度、特异性、快速，能定性、定量、定位测定，易于观察结果并适合自动化检测。,总体分为：,免疫组化：,定位检测组织或细胞中,Ag/Ab,免疫测定：,定量检测液体标本中,Ag/Ab,也可分为：荧光免疫技术，放射免疫技术，酶免疫技术，化学发光免疫技术及免疫金标识技术等,。,免疫学技术专题知识,第15页,一、酶免疫技术,基础原理：以酶标识抗体（或抗原）用于免疫检,测，经过对应底物被酶解后显色反应，对标本中抗原,/,抗体进行定量、定位分析。,标识物：酶（催化底物：生物放大作用）,特点：灵敏度高、特异性强、准确性好，酶标识试剂能够较长时间保持稳定，检测方法简便安全易行，轻易与其它技术偶联衍生出适用范围更广新方法。,免疫学技术专题知识,第16页,（一）常见酶和酶作用底物,1,、辣根过氧化物酶（,HRP,）,HRP,起源于植物辣根中，分子量,40KD,，,由,主酶,（糖蛋白）和辅基（亚铁血红素）组成复合物。,HRP,常见底物有：,（,1,）邻苯二胺（,OPD,）,OPD,显色后为橙黄色，加入终止液为棕黄色，可溶性产物，,应用最早,，但配成溶液后稳定性差，且有潜在致癌性，显色反应需避光。,（,2,）,四甲基联苯胺（,TMB,）,TMB,经酶作用呈兰色，可溶性产物，加酸终止后黄色，稳定性好，显色反应无需避光，无致突变作用。,应用最广泛。,但,水溶性差。,免疫学技术专题知识,第17页,2,、碱性磷酸酶（,AP,）,AP,从大肠杆菌或小牛肠粘膜中提取，菌源性活力小于小肠粘膜活力。,AP,价格较,HRP,高，稳定性差，但敏感度高，空白值低。,可催化对硝基苯磷酸酯（,p-NPP,），生成,黄色对硝基酚,，,NaOH,终止后黄色可稳定存在一段时间（,405nm,）。,免疫学技术专题知识,第18页,（二）酶免疫技术分类,酶免疫组化,（,EIH,）,均相酶免疫测定（,HEI,）,酶免疫测定 非均相酶免疫测定 固相酶免疫测定,（,EIA,）,液相酶免疫测定,（同,RIA,）,免疫学技术专题知识,第19页,（三）酶免疫测定（,EIA,）,1,、均相酶免疫测定（,HEI,）,特点：仅需将待测样品、酶标试剂和底物溶液混合，待抗原抗体反应完成即可直接测定结果，,整个检测过程都在均匀液相中进行,。,以酶放大免疫测定技术（,EMIT,）,为例：,免疫学技术专题知识,第20页,2,、非均相酶免疫测定,（,1,）液相酶免疫测定（液相,EIA,）：,同,RIA,：,抗原、酶标抗原、抗体相继加入后，使反应到达平衡，再加分离剂。,（,2,）,固相酶免疫测定（固相,EIA,）,：,AgAb,反应在固相载体表面进行，应用最广泛是,酶联免疫吸附试验,（,Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA,）,免疫学技术专题知识,第21页,1,）,ELISA,基础原理,将抗原或抗体结合到固相载体表面，并保持其免疫活性。,抗原或抗体与酶连接成酶标抗原或抗体，仍分别保持其免疫活性和酶活性。,在固相载体上按照一定步骤加入待测抗原或抗体及酶标抗体或酶标抗原，洗去未结合游离物质，加入酶底物显色，颜色深浅与待测物质含量呈相关性。,免疫学技术专题知识,第22页,2,）固相载体种类,A,、塑料制品,聚苯乙烯：蛋白质非共价键或物理吸附结合到载体表面，可制成小试管、小珠、微量反应板形式专用于,ELISA,微量反应板,ELISA,板（,8,12=96,孔）,B,、微颗粒,高分子单体聚合成微球或颗粒，带有能与蛋白质结合功效基团，易于化学偶联，结合容量大。反应时可均匀分散到整个反应溶液中，反应速度快。其中可包裹磁性物质，制成磁化微颗粒，使分离可在磁板中完成，自动化分析。,C,、膜载体,NC,膜（硝酸纤维素膜）、玻璃纤维素膜、尼龙膜等微孔滤膜。非共价键吸附,Ab/Ag,，吸附能力强。广泛应用于斑点,-ELISA,等。,免疫学技术专题知识,第23页,3,）,ELISA,方法类型及反应原理,A,、双抗体夹心法,此法是检测大分子抗原常见方法。,上述方法亦可改为,双位点一步法,，使用针反抗原分子上两个不一样表位单克隆抗体，分别作为固相抗体和酶标抗体。注意钩状效应。,免疫学技术专题知识,第24页,B,、间接法,此法是测定抗体常见方法,。,能够用一个酶标抗,抗体检测各种抗体。,免疫学技术专题知识,第25页,免疫学技术专题知识,第26页,C,、,竞争结正当,可用于测定小分子抗原或半抗原及抗体。以检测抗原为例，待测抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，结合于,固相,酶标抗原量与标本中待测抗原含量呈,反比,。,免疫学技术专题知识,第27页,D,、捕捉法,最常见于检测,IgM,抗体,包被抗人,IgM,链,+,待测标本,-IgM,类抗体全被固相抗体捕捉,-,洗涤,+,特异性抗原（针对待测,IgM,对应抗原）与固相上特异性,IgM,结合,+,酶标抗体（针对特异性,Ag,）,+,底物,-,显色,-,显色表示有特异性,IgM,。,免疫学技术专题知识,第28页,E,、,BAS-ELISA,生物素（,B）,-亲和素（,A）,系统（,biotin avidin system,，,BAS）,是以生物素和亲和素含有独特结合特征为基础，它们结合快速、专一、稳定，并含有多级放大效应。,应用生物素亲和素放大系统,ELISA,，使反应信号放大，检测灵敏度提升。,免疫学技术专题知识,第29页,1个亲和素（链霉亲和素）可结合四个生物素衍化物,1,个抗体可结合多个,B，,与蛋白质-,NH,2,结合形成,肽键，-,NH,2,越多，标识,B,越多。,E B Ag?EB ABE B Ab B B B E EBABE,免疫学技术专题知识,第30页,BAS-ELISA,包含：,ABC-ELISA,（间接法、双抗体夹心法）,BA-ELISA,（间接法、双抗体夹心法）,BAB-ELISA,（间接法、双抗体夹心法）比如：,BAB-ELISA,（双抗体夹心法）：固相,Ab+,待检,Ag+,（,Ab-B,）,+A+B-E+,底物显色,免疫学技术专题知识,第31页,ABC-ELISA,（间接法、双抗体夹心法）,免疫学技术专题知识,第32页,（四）酶免疫组化（,EIH,）,原理：,以酶标识抗体与用于对应抗原反应，,经过底物被酶解显色以示踪抗原-抗体结合物存在部位。,酶免疫组化染色标本可在普通光学显微镜下观察，并能长久保留。,另外，作为辣根过氧化物酶底物,二氨基联苯胺（,DAB,），,其分解产物为不溶性，适于镜下观察。,免疫学技术专题知识,第33页,1,、直接法,组织标本待测抗原,+,酶标识抗体,DAB,显色,2,、间接法,组织标本待测抗原,+Ab1 +,酶标,-,二抗,使用一个酶标抗体可检测各种抗原。敏感性较直,接法高，但低于,PAP,法。,免疫学技术专题知识,第34页,3,、生物素,-,亲和素法,将亲和素（,A）,与生物素（,B）,系统应用于酶免疫组化,包含：,ABC,法（直接法、间接法）,BAB,法（直接法、间接法）,BA,法（直接法、间接法）,免疫学技术专题知识,第35页,3.,1,）,ABC,法,直接,ABC,法,:,玻片,Ag+B,Ab Ag-Ab,B,ABC,Ag-Ab,B-AB*C,特点,:,将,BAB,法中,A,先与,B,E,结合，制备成复合物,ABC,间接,ABC,法：,用生物素化第二抗体与抗原抗体复合物结合,玻片,Ag+Ab1 Ag-Ab1,B,Ab2,Ag-Ab1-Ab2,B,ABC,Ag-Ab1-Ab2,B-AB*C,免疫学技术专题知识,第36页,2,）,BAB,法（桥联亲合素,-,标识生物素法,BRAB,）,直接,BAB,法,:,组织切片或细胞涂片,Ag+B,Ab Ag-Ab,B,A,Ag-Ab,B-A,B,E,Ag-Ab,B-A-B,E,特点：以游离,A,分别连接,B,Ab,和,B,E,间接,BAB,法：,用生物素化第二抗体与抗原抗体复合物结合,组织切片或细胞涂片,Ag+Ab1 Ag-Ab1,B,Ab2,Ag-Ab1-Ab2,B,A,Ag-Ab1-Ab2,B-A,B,E,Ag-Ab1-Ab2,B-A-B,E,免疫学技术专题知识,第37页,3,）,BA,法（标识亲合素,-,生物素法,LAB,法）,直接,BA,（或,LAB,）法,玻片,Ag+B,Ab Ag-Ab,B,A,E,Ag-Ab,B-A,E,特点：以,A,E/SA,E,代替,BAB,法中,A,，省却了加,B,E,步骤,间接,BA,（或,LAB,）法,：,用生物素化第二抗体与抗原抗体复合物结合,玻片,Ag+Ab1 Ag-Ab1,B,Ab2,Ag-Ab1-Ab2,B,A,E,Ag-Ab1-Ab2,B-A,E,免疫学技术专题知识,第38页,BAS,试验方法及反应层次,方 法 反应层次,直接法,BA Ag,(Ab-B),A*,BAB Ag,(Ab-B),A,B*,ABC Ag,(Ab-B),AB*C,间接法,BA Ag,Ab1,(Ab2-B),A*BAB Ag,Ab1,(Ab2-B),A,B*ABC Ag,Ab1,(Ab2-B),AB*C,Ag,抗原；,Ab-B,生物素化抗体；,A,亲合素；,A*,标识亲合素；,B,生物素；,B*,标识生物素；,Ab1,第一抗体；,Ab2,第二抗体,;,Ab2-B,生物素化第二抗体,免疫学技术专题知识,第39页,4,、过氧化物酶,-,抗过氧化物酶（,peroxidase anti-peroxidase complex,，,PAP,）,法和碱性磷酸酶,-,抗碱性磷酸酶（,alkaline phosphatase-antialkaline phosphatase,，,APAAP,）,法,原理：应用抗酶抗体与酶结合，形成可溶性、稳定酶,-,抗酶抗体复合物。此法优点是：未经化学交联反应，故防止了抗体和酶活性降低，并省去酶标识抗体需纯化繁复过程。,免疫学技术专题知识,第40页,二、荧光免疫技术,（,fluoroimmunoassay）,原理：以荧光素标识抗体或抗原，用于对应抗原或抗体分析判定。,荧光免疫技术分为：,免疫荧光显微技术（荧光免疫组化）：,用荧光抗体对细胞、组织切片或其它标本中抗原（或抗体）进行判定和定位检测，可在,荧光显微镜,下直接观察试验结果，,流式细胞术：,进行自动分析检测,荧光免疫测定：,用于检测体液标本中抗原或抗体。,免疫学技术专题知识,第41页,（一）常见荧光色素,1、异硫氰酸荧光素（,FITC）,橙黄色/黄色粉末，,发出黄绿色荧光,。最大吸收峰490495,nm，,最大发射峰520530,nm，,含异硫氰基-,N=C=S。,应用最多荧光素。,2、四乙基罗丹明（,RB200）,橘红色粉末，,发出橘红色或橙色荧光,。最大吸收峰570,nm，,最大发射峰595600,nm。,含磺酸基。与,FITC,做双标识或对比染色。,3,、藻红蛋白（,R-RE）,发出橙色荧光，最大吸收峰565,nm，,最大发射峰575,nm，,可与,FITC,共用488,nm,激发光，,可用于流式细胞仪双标识。,免疫学技术专题知识,第42页,（二）免疫荧光显微技术,1,、,方法及原理,1）,直接,法,应用特异性荧光抗体直接检验标本中对应抗原。,2）,间接,法,以特异性抗体（或待测抗体）为第一抗体，以荧,光素标识抗球蛋白抗体（标识抗抗体）为第,二抗体，用于检测抗原或抗体。,免疫学技术专题知识,第43页,3,）,补体法 此法是在间接法第一步抗原,-,抗体反应加入补体，使之与抗原,-,抗体复合物结合；再用荧光素标识抗补体抗体进行示踪。,4,）双标识,法,此法用异硫氰酸荧光素（,FITC,）,及罗丹明（,TRITC,）,分别标识不一样抗体，进行同一标本荧光染色，若有两种对应抗原存在，可同时见两种（橙红、黄绿）荧光。,免疫学技术专题知识,第44页,2,、荧,光显微镜检验,1,）染色标本尽可能马上观察结果。,2）镜下观察时同一标本区观察时间不易过长。,3）通风很好暗室中进行。,4）油镜检验时用无荧光镜油，先观察对照，再对待测标本。,免疫学技术专题知识,第45页,（三）流式细胞术（,FCM,）,FCM,是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对,单个细胞,表面标志（抗原或受体）进行快速、准确分析和自动检测，并可对不一样类型细胞进行分选和搜集。,FCM,还可对同一细胞各种参数（如,DNA、RNA、,蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析，故成为当代生命科学研究领域中被广泛应用一项新技术。,免疫学技术专题知识,第46页,1,、基础概念与原理,FCM,是一个分析单个微粒（如细胞、微生物和人工合成微球等）物理和化学特征技术，其特点是快速、准确、客观，,能定量,。,FCM,原理,：悬浮在液体中分散细胞单个地依次经过测量区时产生电信号，从而可快速对大量细胞进行多参数检测和分析，并可从整个群体中分选出特定细胞亚群。,免疫学技术专题知识,第47页,免疫学技术专题知识,第48页,2,、流式细胞术在免疫细胞研究中应用,1）细胞表型分析,表型分析可用于免疫细胞判定、计数和功效评价。,2,）细胞功效检测,（1）细胞功效状态和活化信号转导：,包含检测胞内钙离子浓度、蛋白磷酸化、蛋白激酶活性状态、信息传递相关蛋白表示及相互作用等。,免疫学技术专题知识,第49页,（,2,）细胞增殖：,应用活细胞染料,5-,二醋酸羧基荧光素琥珀酸单胞菌酯（,5-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,，,CFSE,）作为标识物，建立了检测细胞增殖新技术。原理：,CFSE,能自动穿过胞膜，与胞内蛋白赖氨酸不可逆结合，并随细胞分裂而倍减，借助,FCM,检测荧光强度，可判断细胞增殖状态。,免疫学技术专题知识,第50页,（,3,）细胞分化：,借助胞内细胞因子染色（,intracelluar,cytokine staining,，,ICCS,），,可应用,FCM,检,测单细胞产生和分泌,CK,，从而判断单一细,胞亚群分化和功效状态。,原理：应用,蛋白转运抑制剂,使胞内合成,CK,滞留在高尔基体；应用,透膜剂,（,saponin,）,使荧光标识抗体可逆性穿透胞膜，以进行胞内,染色。,免疫学技术专题知识,第51页,（,4,）细胞毒效应：,经过检测一些效应分子（,FasL,、,穿孔素和颗粒,酶等）可判断细胞毒效应。,（,5,）细胞凋亡：见下文。,免疫学技术专题知识,第52页,（四）荧光免疫测定（,FIA,）,1、荧光偏振免疫测定（,FPIA,）,该法主要用于小分子物质（尤其是药品浓度）测定。,原理：荧光素标识已知抗原+待测抗原+抗体形成,标识抗原抗体复合物,，因为其分子量大，旋转慢，在激,发光照射下，吸收偏振光多，发出偏振荧光强，小,分子游离标识抗原旋转快，其偏振荧光弱。所以，标本,中抗原浓度越高，形成,标识抗原抗体复合物,越少，发,出偏振荧光越弱。反之，发出偏振荧光越强。,免疫学技术专题知识,第53页,2,、时间分辨荧光免疫测定（,TR-FIA）,原理：应用含有较长荧光寿命镧系螯合物（如铕）标识抗原或抗体，并利用,时间分辨荧光分析仪,延缓测量时间，有效消除非特异性本底荧光干扰，所得信号完全是镧系螯合物发射特异荧光，从而最大程度提升测定方法灵敏度和特异性。,免疫学技术专题知识,第54页,免疫学技术专题知识,第55页,3,、酶免疫荧光测定（,ELFIA,）,原理：应用含有潜在荧光物质作为酶底,物，经过酶解反应产生高强度荧光，可用荧,光测量仪进行定量测定。,免疫学技术专题知识,第56页,三、放射免疫技术,是以放射性核素作为示踪剂标识,免疫测定方法，其特点是将核素分析高,灵敏度与抗原-抗体反应特异性相结合。,广泛应用于各种,微量蛋白质、激素、小分子药品和肿瘤标志物定量分析,，对相关学科发展起到了极大推进作用。,包含放射免疫测定（,RIA,）和免疫放射测定（,IRMA,）,免疫学技术专题知识,第57页,（一）常见放射性核素,射线：,131,I,、,125,I,、,51,Cr,、,60,Co,射线：,14,C,、,3,H,、,32,P,射线半衰期长，易造成对环境污染，比活,性差，需液体闪烁仪。普通不用。,免疫学技术专题知识,第58页,（,二）放射免疫测定（,RIA,）,1,、,RIA,基础原理,以放射性核素标识抗原（,Ag*,）,和检品中待测未标识抗原（,Ag,）,与固定量特异性抗体竞争结合反应。,若,Ag*,和,Ab,量固定，二者结合所形成,Ag*-Ab,复合物受,Ag,含量制约。若反应系统中,Ag,含量高，其对,Ab,竞争结合能力即强，,Ag-Ab,复合物生成量增加，,Ag*-Ab,复合物则相对降低。所以，,Ag*Ab,复合物形成量与,Ag,含量间呈一定,负相关,函数关系。,免疫学技术专题知识,第59页,Ag*+Ab,Ag*Ab+Ag*+Ag,AgAb+Ag,B F B,0,T,免疫学技术专题知识,第60页,2,、,RIA,测定方法,1,）,AgAb,反应,2,）,B,、,F,分离,加入,PR,试剂（二抗和,PEG,混合物，也可制成固相二抗,（二抗与颗粒固相物连接）,Ag*Ab1+Ab2Ag*Ab1-Ab2,3,）放射性强度测定,计数仪测上清,/,沉淀,cpm,，制备标准曲线（,B/,（,B+F,），,B/F,，,B/B,0,）。亦可用计算机处理。,免疫学技术专题知识,第61页,（三）免疫放射测定（,IRMA,）,1,、单位点,IRMA,是将待测抗原与,过量标识抗体,直接反应，然后加,入,固相抗原免疫吸附剂,与游离标识抗体结合,经离心去除沉淀物，测定上清液放射性强度，从,而推算出检品中待测抗原含量。,2,、双位点,IRMA,测定固相上,cpm,数,免疫学技术专题知识,第62页,四、化学发光免疫技术,是将发光技术与免疫反应和计算机技术结合,自动化仪器分析技术，当前已趋替换,RIA,而,成为免疫检测广泛采取分析技术。,可用于多项指标检测。可测定内分泌激素类、肿瘤标志物类、心肌标志物类、病毒标志物类、治疗性药品浓度、骨代谢指标和贫血类等方面检测。,免疫学技术专题知识,第63页,（一）化学发光免疫测定（,CLIA）,CLIA,是以化学发光剂（如鲁米诺、吖啶酯等）标识抗体或抗原，免疫反应完成后，直接引发化学发光反应进行检测。,免疫学技术专题知识,第64页,（二）化学发光酶免疫测定（,CLEIA,）,CLEIA,抗原,-,抗体反应步骤与酶免疫测定相同，仅,酶促反应所用底物为发光剂,，经过化学发光反应进行检测。,免疫学技术专题知识,第65页,（三）电化学发光免疫测定（,ECLIA,）,ECLIA,实际上是在电极表面由电化学引发特异性化学发光反应。,三联吡啶钌,RU(bpy),3,2+,三丙胺（,TPA,）,.,免疫学技术专题知识,第66页,电化学发光免疫分析示意图,免疫学技术专题知识,第67页,电化学发光免疫测定示意图,免疫学技术专题知识,第68页,五、免疫金标识技术（,immunogold labelling technique）,氯金酸（,HAuCl,4,）在还原剂（枸橼酸三钠）作用下被还原成原子金，聚合成特定大小金颗粒悬液，并因为静电作用成为一个稳定胶体状态胶体金。,是以,胶体金,作为示踪标志物，应用于抗原-抗体反应。胶体金含有高电子密度，,最初主要用于,免疫电镜技术,，以后其应用范围逐步扩展,。,在,免疫组化,方面，胶体金标识抗体可直接用于检测细胞表面和组织切片中抗原或受体，并可在普通光学显微镜下观察。,在,流式细胞术,中，胶体金可作为多参细胞分析和分选有效标识物。,免疫学技术专题知识,第69页,常见方法：,1、免疫金（银）染色法（,IGS/IGSS）,组织切片（抗原）,+,特异性抗体+胶体金标,记二抗+银显影剂，标识物上金颗粒催化硝,酸银离子还原成银颗粒，在抗原抗体复合物,上形成黑色“银壳”，使,Ag,位置放大，从而提,高了镜下可见度。,免疫学技术专题知识,第70页,用,NC,膜或微孔滤膜为载体吸附抗原，用胶体金标识抗体代替酶标抗体。,2,、斑点免疫层析试验（,DICA）,免疫学技术专题知识,第71页,六、免疫印迹技术（,immunoblotting,）,又称为,Western-blotting,，,是将凝胶电泳高分辨力与固相免疫测定结合起来一个方法。,由十二烷基磺酸钠,-聚,丙烯酰胺凝胶电泳（,SDS-PAGE,）、,蛋白质转印和固相膜免疫测定三项技术结合而成。,免疫学技术专题知识,第72页,七、免疫,PCR,（,immuno-PCR,，,IM-PCR,）,是将免疫学反应和,PCR,技术相结合而创建一个新检测技术，含有抗原、抗体反应特异性和,PCR,技术高效性。,基础原理：用,一段已知,DNA,分子作为标识物,，结合一抗或二抗后去检测对应抗原或抗体，再用,PCR,法扩增该,DNA,分子，扩增产物用琼脂糖电泳定性，依据该,DNA,分子存在是否，确定检测结果。,该方法与,ELISA,原理类似，不一样是以,DNA,分子作为标识物。,免疫,PCR,可采取直接法、间接法和双抗体夹心法,。,免疫学技术专题知识,第73页,免疫学技术专题知识,第74页,八、细胞凋亡检测技术,（一）形态学检测,应用电子显微镜或普通光学显微镜直接观察细胞大小、凋亡小体和其它凋亡细胞形态学改变；,应用一些可直接、间接产生荧光染料,如双苯并咪唑（,HO,）、,碘化丙啶（,PI,）、,Annexin V,等,使细胞着染，借助荧光显微镜区分凋亡细胞、坏死细胞和正常细胞。,免疫学技术专题知识,第75页,（二）生物化学检测方法,凋亡细胞染色质,DNA,在,核小体单位间连接处,断裂，形成,180200,bp,整数倍寡核苷酸片段，在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱（,DNA ladder,）。,（三）免疫学检测方法,原理：凋亡细胞染色质,DNA,断裂而产生核小体,DNA,，,可与组蛋白结合为复合物。应用抗组蛋白和抗,DNA,单抗，借助,ELISA,方法可测定细胞凋亡。,该技术优点是：可用于检测不一样培养细胞株或不一样动物起源细胞凋亡；灵敏度高，且,可检测早期细胞凋亡,。,免疫学技术专题知识,第76页,（四）分子生物学检测方法,常见技术为脱氧核糖核酸末端转移酶介导缺口末端标识法（,TUNEL,），,原理：凋亡细胞,DNA,链发生断裂而暴露,3,-,OH,末端，可借助末端转移酶（,TdT,）,将,脱氧核糖核酸与荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成衍生物,标识到,DNA 3,-,OH,末端，从而检测细胞凋亡。,TUNEL,法优点是：能对完整单个凋亡细胞或凋亡小体进行原位染色；适合用于不一样本检测；灵敏度远比普通组织化学和生化测定法高。,免疫学技术专题知识,第77页,免疫学技术专题知识,第78页,（五）流式细胞术,1,、亚“,G1,”,峰检测法,处于增殖周期细胞，其在不一样周期时相（,G,o,/G,1,、,S,、,G,2,/M,）,DNA,含量为,2,n4n,。,凋亡细胞核内,DNA,裂解成小片段，应用胞膜通透剂可使小分子量,DNA,片段穿过胞膜而丢失，仅剩大片段,DNA,，,这些失去个别,DNA,细胞，染色后形成一个,DNA,含量,2,n,（,即,G,1,期细胞）分布区，称为“亚,G1,峰”。,该技术缺点为：不能反应发生于,G,1,峰后,S,期和,G,2,期细胞凋亡；不能区分死细胞和活细胞。,免疫学技术专题知识,第79页,2、,HO/PI,染色法,原理：,HO,被活细胞摄取，与,DNA,结合后在紫外光下呈蓝色荧光；,PI,使死细胞着染，产生红色荧光。依据两种荧光所形成细胞二维直方图，可分辨正常活细胞、凋亡细胞和死细胞。,3、,Annexin,法,应用,Annexin V,，Annexin V,是一个,Ca,2+,依赖磷脂结合蛋白，含有易于结合到磷脂类如,PS,（磷脂酰丝氨酸）特征。,对,PS,有高度亲和性。,借助,FCM,可定量分析被标识凋亡与坏死细胞数。,免疫学技术专题知识,第80页,4、,caspase,活性检测,caspase,（胱天蛋白酶）,水平及活性升高乃细胞凋亡标志，并反应效应细胞细胞毒活性。应用能透过胞膜,c,aspase,荧光底物,，其被酶切后释放荧光基团，借助,FCM,检测所释放荧光强度，可推断,caspase,活性。,该法优点为：可在单细胞水平反抗原特异性,T,细胞细胞毒作用进行可视化和数量化分析。,免疫学技术专题知识,第81页,第二节,免疫分子检测,免疫学技术专题知识,第82页,一、免疫球蛋白测定,检测,IgG、IgA、IgM,含量常见单向免疫扩散法、火箭免疫电泳法、免疫比浊法以及免疫化学自动分析仪。,血清中,IgE,和,IgD,含量很低，须用,RIA、ELISA、RAST,等灵敏度较高方法测定。,免疫学技术专题知识,第83页,二、补体测定,（一）血清总补体活性测定,原理：应用家兔抗,SRBC,抗体致敏,SRBC,作为抗原-抗体复合物，激活待测血清中补体经典路径，造成,SRBC,溶解；若待测血清样品中补体含量降低或某种补体成份缺失，可影响此种溶血反应。通常以50%溶血作为判定反应结果终点，故称为50%溶血试验（50%,complement hemolysis，,CH50,）。,依据引发50%溶血所需最小补体量，计算血清总补体活性。,免疫学技术专题知识,第84页,（二）血清补体旁路路径活性测定,原理：家兔红细胞（,RRBC）,可直接激活人,B,因子，引发补体旁路路径活化，造成,RRBC,溶解。,（三）补体各成份测定,1、免疫溶血法 该法可用于,C4,、,C2,及,B,因子测定。以抗体致敏,SRBC,作为指示系统进行检测。,2、免疫化学法 常见方法有单向免疫扩散法、火箭免疫电泳法、免疫比浊法、,ELISA,及,RIA,等。,免疫学技术专题知识,第85页,三、细胞因子及其受体检测,（一）生物学检测法,原理为：依据,CK,特定生物学活性，采取对应指示系统（如各种依赖性细胞株或靶细胞），经过与标准品对比，判断样品中细胞因子活性水平，普通以活性单位（,U/ml,）,表示。,可分为促进细胞增殖或增殖抑制法、集落形成法、细胞毒活性测定法、细胞病变抑制法、趋化活性测定法等。,免疫学技术专题知识,第86页,生物学检测法优点：灵敏度高（达,pg,水平），并能直接显示,CK,生物活性。,生物学检测法缺点：各种,CK,可能含有相同功效，故干扰原因较多；一些抑制因子可降低,CK,活性；一些细胞同时表示,CK,受体，其与,CK,结合将影响生物学活性检测结果。,免疫学技术专题知识,第87页,（二）免疫学检测法,1、体液中,CK,检测,几乎全部,CK,均可借助免疫学方法进行检测。常见方法包含,ELISA,（,双抗体夹心法或竞争法）、,RIA,及免疫印迹法等。,一些细胞因子含量甚微样品（如脑脊液）可用,免疫,PCR,（immuno-PCR）,进行检测，极大地提升检测灵敏度（可达10,12,mol/L）。,免疫学技术专题知识,第88页,2、,单个细胞分泌,CK,检测,（1）反向溶血空斑试验（,reversed hemolytic plaque assay，RHPA）RHPA,是一个体外检测抗体分泌细胞试验。亦可将其用于测定,CK,分泌细胞。,原理：待测,CK,分泌细胞,+,抗,CK,抗体,+SPA-SRBC+,补体，4种成份与琼脂糖凝胶混匀，注入小室内；反应后造成,SRBC,溶解，在,CK,分泌细胞周围形成溶血空斑，每个空斑代表一个,CK,分泌细胞，空斑大小与细胞所分泌,CK,量成正比。,免疫学技术专题知识,第89页,（2）酶联免疫斑点试验（,ELISPOT,）,原理：抗,CK,抗体包被固相载体+待测分泌,CK,细胞+结合后洗去细胞+酶标抗,CK,抗体+底物，显色反应深浅测定结合在固相载体上,CK,量，并可在光镜下观察分泌,CK,细胞。,免疫学技术专题知识,第90页,免疫学技术专题知识,第91页,3、,细胞内,CK,检测,采取,FCM,免疫荧光技术,可从单细胞水平检测不一样细胞亚群中,CK，,用不一样颜色荧光标识抗,CK,抗体可在同一细胞内同时测定两种不一样,CK。,免疫学技术专题知识,第92页,免疫学检测法,优点：特异性强，可测出单一细胞因子含量；方法简便，无须细胞培养，便于大量样品检测；试验流程短，方法易标准化，重复性好,免疫学检测法,缺点：免疫学方法所检出细胞因子含量，与该因子生物活性并非必定平行；不一样单抗所识别细胞因子表位和亲和力不一样，所测结果可出现差异。,免疫学技术专题知识,第93页,（三）分子生物学检测法,应用细胞因子,cDNA,探针或寡核苷酸探,针，经放射性核素（,32,P,或,35,P,）、生物素,或地高辛标识，与提取细胞因子,mRNA,进行,杂交（,Northern blot,）；亦可在细胞或组织切,片上进行原位杂交分析；若同时结合免疫组化,技术，还可判定表示细胞因子基因细胞类型。,免疫学技术专题知识,第94页,分子生物学检测法优点：特异性高。,分子生物学检测法缺点：仅能检测,CK,基因表示情况，不能直接提供,CK,含量及生物活性等信息，故此法主要用于研究,CK,基因表示与调控。,免疫学技术专题知识,第95页,四、黏附分子检测,（一）细胞膜表面,AM,检测,1,、间接免疫荧光法组织细胞表面,AM,组织切片标本,+,抗,AM,单抗+羊抗小鼠,IgG,荧光抗体，进行间接免疫荧光染色，借助荧光显微镜观察表示,AM,阳性细胞数。,2、间接酶免疫组化法组织细胞表面,AM,组织切片标本+抗,AM,单抗+羊抗小鼠,IgG,酶标抗体，加入酶底物显色，显微镜观察表示,AM,阳性细胞数。,3,、流式细胞术内皮、淋巴细胞等表面,AM,待检细胞悬液+两种荧光素标识单抗，在流式细,胞仪上可同时检测胞膜表面两种不一样,AM。,免疫学技术专题知识,第96页,（二）可溶性,AM,测定,1、,ELISA,双抗体夹心：最常见于检测选择素家族和免疫球蛋白超家族组员,。,2、其它免疫测定方法：,RIA,或,IRMA,、化学发光免疫测定、时间分辨荧光免疫测定方法等,免疫学技术专题知识,第97页,第三节,免疫细胞检测,一、免疫细胞分离与纯化,（一）白细胞分离,1、自然沉降法,2、高分子聚合物加速沉降法,免疫学技术专题知识,第98页,（二）,外周血单个核细胞（,PBMC）,分离,1、,聚蔗糖-泛影葡胺（,ficoll-hypaque，F-H）,密度梯度离心法,2、,Percoll,密度梯度离心法,（连续和不连续）,免疫学技术专题知识,第99页,（三）淋巴细胞纯化与亚群分离,1、去除红细胞,普通采取无菌蒸馏水低渗,裂解法或,0.83%,氯化,铵处理法。,2、去除血小板,离心洗涤或胎牛血清（,FCS）,梯度离心法，,因,FCS,可让单个核细胞经过，而阻止血小板经过。,免疫学技术专题知识,第100页,3,、去除单核细胞和粒细胞,（1）黏附法,玻璃纤维或葡聚糖凝胶,Sephadex G-10,柱，清,除发生黏附细胞,（2）羰基铁粉吞噬法,单核细胞吞噬羰基铁粉后，用磁铁将细胞吸至,管底,（3）苯丙氨酸甲酯法,苯丙氨酸甲酯含有,亲,溶酶体,性质，用该法可溶,解含溶酶体细胞（如单核、粒细胞等）。,免疫学技术专题知识,第101页,4、淋巴细胞亚群分离,（1）E,花环分离法,T,细胞表示,SRBC,受体，能与,SRBC,结合形成,E,花环，而,B,细胞则不能。经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心，可将,T、B,细胞分离。,（2）尼龙棉柱分离法,B,细胞易黏附于尼龙棉纤维（聚酰胺纤维）表面，而,T,细胞则不易黏附，借此可将,T,细胞与,B,细胞分离。,免疫学技术专题知识,第102页,（3）亲和板结合分离法（洗淘法）,直接结正当：抗体包被,塑料平皿或细胞培养瓶,（板）,+细胞，吸附表示特定抗原细胞。,间接结正当：包被抗小鼠,IgG,抗体（第二抗体）+与单抗结合淋巴细胞，被吸附固定而分离。,特异性抗原（配体）包被+表示对应受体细胞，该细胞被分离。,免疫学技术专题知识,第103页,优点：可同时进行细胞阳性分选和阴性分选，且所获细胞量较大。,缺点：亲和板结合分离法普通适合进行阴性分选。另外，包被抗体宜采取不含,Fc,段（,Fab）,2,抗体片段，以免发生非特异性吸附。,免疫学技术专题知识,第104页,（4）补体细胞毒分离法,抗体+细胞+补体，经过补体依赖细胞毒作用（,CDC,）,而去除对应细胞，用于细胞阴性分选。,（5）流式细胞术分选法,免疫学技术专题知识,第105页,直接法：将特异性抗体与磁性微粒交联，称为免疫磁珠（,IMB,），,其可与表示对应膜抗原细胞结合；应用强磁场分离,IMB,及其所吸附细胞，从而对特定细胞进行阴性或阳性分选。,间接法：用抗小鼠,IgG,抗体（第二抗体）包被磁性微珠，可与任何已结合鼠源性单克隆抗体（一抗）细胞发生反应，从而对细胞进行分离。,（,6,）磁性激活细胞分离器（,MACS,）,分离法,免疫学技术专题知识,第106页,MACS,分离法优点：,所获细胞纯度高（,93%99%,），获率可达,90%,，活细胞率,95%,；分离效果可与流式细胞术相媲美，但比后者省时且费用低，操作简单。,缺点：阳性分选中，抗体可造成细胞活化或细胞凋亡。,免疫学技术专题知识,第107页,（四）单核,-,吞噬细胞分离和搜集,1,、将,PBMC,经过,Percoll,连续密度梯度离心法或洗淘法（阳性分选）可获取单核细胞，但所得细胞数量较少。,2,、斑蝥敷贴法能够从组织渗出液中取得数量较多且较纯巨噬细胞，亦无需作深入分离。,3,、以灭菌,巯基乙醇酸盐,肉汤培养基（或无菌液体石蜡）注入小鼠腹腔内，引发无菌性炎性渗出，从腹腔冲洗液中可取得大量巨噬细胞（,85%,）。,免疫学技术专题知识,第108页,二、淋巴细胞及其亚群检测,（一）,T,细胞检测计数,1,、间接免疫荧光法,应用抗,CD3/CD4/CD8,单抗与,PBMC,结合，再加入荧光素标识抗小鼠,IgG,抗体（第二抗体），在荧光显微镜下观察并计数。,2,、酶免疫组化法,1,）碱性磷酸酶,-,抗碱性磷酸酶（,APAAP,）法；,2,）,ABC,法（间接法）,细胞