农杆菌的转化流程.doc

农杆菌的转化流程
方案一
1。 农杆菌的培养及感受态的制备① 农杆菌菌株划YM平板，26-28℃培养48 h；② 挑取单菌落接种到40 ml 无抗生素的YM液体培养基中，250 r/min， 26—28℃悬浮培养12-16 h； ③ 将菌液转入灭过菌的50 ml离心管中，4℃，8000 r/min，离心8 min；④ 弃上清，加入用100 mM NaCl （4℃预冷)重悬收集的农杆菌；⑤4℃,8000 r/min， 离心8 min;
⑥ 弃上清,加入原始菌液1/50体积（800ml/管（此时的感受态农杆菌可以直接用于转化）并分装成100ml）的20 mM CaCl2重悬菌体;⑦ 置液氮中10 s，放入—20℃冰箱中保存备用。

2.农杆菌的转化(冻融法）
将感受态农杆菌置于冰上，加入1mg质粒DNA（体积不宜超过10 m l）,充分混匀，冰上放置30 min；② 置液氮中快速冷却约1min后迅速转入37℃水浴中，待其融化；③ 加1 ml 无抗生素的YM 液体培养基于28℃，230 r/min 培养2-4 h；（或直接用1 mlml，留500 m l于管中④ 3000 r/min 离心2 min收集菌体，将上清吸去500 培养菌直接涂布含抗生素的YM平板）;⑤ 重悬菌体并涂布到含有适当抗生素的YM平板上吹干, 28℃培养48 h;⑥ 挑取单菌落接种到筛选液体YM培养基中，28℃,250 r/min 培养48 h，将菌液用于保存或转化；注：EHA105抗利福平霉素，LBA4404抗硫酸链霉素.在转化前后的所有培养基中均可加入相应的这两种抗生素，以防止杂菌污染。以上挑菌及抗生素加入工作均在超净台上进行。
3．转基因烟草体系的建立⑴ 烟草无菌苗的培养：① 70%乙醇消毒烟草种子30 s后，用无菌水清洗两次，更换NaClO处理25—30 min,无菌水清洗四次;② 将灭菌后的种子移至1/2 MS固体培养基（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4)、1。0 mg/L维生素、2。0 mg/L 苷氨酸、3％ 蔗糖、0.6-0。7％ 琼脂(KOH 调至pH 5。7—5.8），于25—26℃，14 h光照/10 h黑暗条件下萌发;③ 14天后，将萌发出的烟草幼苗转移至含有相同1/2 MS培养基的组织培养盒中，同样条件下继续培养4—6周,小苗长出后可用于叶盘转化。⑵ 农杆菌介导的烟草叶盘转化和愈伤组织的筛选
于无菌条件下将无菌苗的成熟叶片除去叶边缘和主要叶脉，切成0。5 cm的小方块，浸泡在MS液体培养基悬浮的用于转化的农杆菌菌液中；② 10 min后取出叶片于灭菌的滤纸上吸去菌液，以叶片上表面接触培养基，8—9片/培养皿，排列于倒有共培养基（MS（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4）、1。0 1℃光照培养箱中，14±mg/L维生素、2。0 mg/L甘氨酸、3％ 蔗糖、0。6—0.7%琼脂、pH 5。7-5.8)的平皿中，置于24 h光照/10 h黑暗条件下共培养48 h；③ 1℃恒温摇床上振荡漂洗45—60±当看到叶片与培养基接触边缘长出白色农杆菌时,将叶片转移至不加激素的MS液体培养基中，约28 min,夹出叶片放于灭菌的滤纸上除去多余的液体培养基；④ 将叶片上表面朝向培养基，8片/皿排列于生芽筛选培养基（MS（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4)、500 mg/L Carbincine、300 mg/L Kanamicine、0。1 mg/L NAA、1.0 mg/L BAP、0.59 g/L MES、1。0 mg/L 1℃光照培养箱中,14 h光照/10±维生素、2。0 mg/L甘氨酸、3%蔗糖、0.6-0.7%琼脂、pH 5.7—5。8）上，置于24 h黑暗条件下培养1个月;⑤ 待愈伤组织长出绿芽时,切下绿芽并转入生根培养基（MS（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4）、200 mg/L Carbincine、100 mg/L Kanamicine、1。0 mg/L维生素、2.0 1℃光照培养箱中，14 h光照/10±mg/L甘氨酸、1.5％蔗糖、0.6—0.7%琼脂、pH 5。7—5.8）中进行筛选（9棵/组培盒),置于24 h黑暗条件下培养筛选；⑥ 将能在生根培养基中长出根的幼苗的芽切下,再次插入到生根培养基中，在相同培养 条件下继续筛选，挑选能长出根的烟草幼苗植入土壤生长.

根癌农杆菌转化烟草 方案二1）农杆菌感受态细胞的制备(1)挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3ml的YEB液体培养基（含链霉素Sm 100ug/ml)中，28°C振荡培养过夜；（2）取过夜培养菌液500ml接种于50ml YEB（Sm 100ug/ml)液体培养基中，28°C振荡培养至OD600为0。5;（3）5，000rpm， 离心5min； （4）加10ml 0.15M NaCl悬浮农杆菌细胞,5，000rpm, 离心5min;（5）1ml 预冷的20mM CaCl2悬浮细胞,冰浴，分装成100m l,液氮中速冻1分钟,置—70°C保存备用。2）植物表达载体向农杆菌感受态细胞的转化取200ml感受态细胞，加入1mg构建好的质粒DNA,液氮中速冻1分钟,37°C水浴5分钟，然后加入1ml YEB培养基，28°C慢速振荡培养4小时；1,000 rpm离心30sec，弃上清，加入0.1ml YEB培养基重新悬浮细胞,涂布于含有100ug/ml Kan 和125ug/ml Sm的YEB平板上，28°C培养约48小时.3）阳性克隆的鉴定 挑取平板上长出的单菌落，接种于YEB液体培养液(含有100ug/ml Kan 和125ug/ml Sm）中，28°C振荡培养过夜;小量提取质粒DNA,以质粒DNA为模板进行PCR扩增鉴定。4)用于转化烟草的农杆菌菌液的准备将含有植物表达载体的农杆菌接种于YEB液体培养液(含有100ug/ml Kan和125ug/ml Sm)中，28°C振荡培养至OD600为0.6~0.8；4000rpm,室温离心10分钟，用MS盐溶液(PH7.0）重新悬浮菌体，使用时采用MS盐溶液稀释至原体积的20~50倍.5)烟草转化（1）烟草叶片的无菌处理 取温室生长的烟草叶片，流水下冲洗掉表面杂物，再用蒸馏水洗涤；70%的乙醇灭菌30秒后，无菌水冲洗一次；2.5％次氯酸钠处理8～10分钟；无菌水冲洗三次，备用；（2）无菌的烟草叶片切去边缘和主要叶脉,切成0.4´0。6cm2大小;（3)切好的外植体在农杆菌菌液中浸泡10分钟；（4)用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，转入上铺一层滤纸的MS基本培养基，28°C暗培养；(5）三天后，将材料转到含有抗生素的分化培养基（MS+3mg/L 6-BA+0。2mg/L NAA+ Kan 75~100ug/ml + Cb 500ug/ml）中进行培养；（6）待抗性芽生长至2~3cm高时，切下小芽转入生根培养基中诱导生根，生根培养基配方：MS基本培养基+ Kan 100ug/ml + Cb 500ug/ml。