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2022宫腔液细胞外囊泡在子宫内膜容受性中的研究进展(全文)
摘要
子宫内膜容受性是指子宫内膜允许囊胚定位、黏附、穿透、植入从而促进 胚胎着床、发育的能力。种植期子宫内膜的特征以及子宫内膜容受性标志 物一直以来都是研究热点，尽管已经取得了较大进展，但仍缺乏公认的预 测临床妊娠的标志物。已有研究显示，抽吸宫腔液对胚胎种植过程没有负 面影响，宫腔液检查可作为无创检测的一种手段；同时宫腔液中含有细胞 外囊泡，细胞外囊泡中miRNA 、蛋白质、DNA 及脂质在卵泡发育成熟、 胚胎发育及着床等生殖过程中起重要作用，将来有望成为子宫内膜容受性 标志物并作为治疗靶点。本文将对宫腔液细胞外囊泡在子宫内膜容受性中 的研究进展进行综述。
统计数据显示，目前全球有超过50万对夫妇因不孕影响他们的社会生 活和精神状态［1］。成功的妊娠需要经历配子发生、受精、着床和胚胎发 育等过程。子宫内膜容受性(endometrial receptivity ER)是胚胎着床 的必要条件，子宫内膜仅在月经周期的特定时间内具有容受性，这段时间 称为种植窗(windows of implantation，WOI )。在正常月经周期的女 性中，WOI通常为月经周期的第19~21日［2 ］。在着床过程中，子宫内 膜结构和功能改变以及胚胎与母体的相互作用，有助于胚胎着床成功［3 ］。
Craciunas等［4 ］ 一项纳入163项研究的meta分析结果表明，子宫内 膜厚度及形态、子宫容积、子宫内膜容受性阵列(endometrial receptivity array, ERA)、宫腔液中白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor， LIF)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor， TNF)以及宫腔镜下腺体 开和血管发育等指标均与临床妊娠相关，其中，一些现代分子学标志物 有望用于评估ER，但仍处于研究阶段。近年来基因组学检测寻找ER标志 物的方法已应用于临床实践中，例如ERA通过活检将子宫内膜分为三个阶 段：容受前期、容受期和容受后期［5 ］,并按照检测结果提供了个体化移 植时期选择，从而提高胚胎种植率°Ruiz-Alonso等［6］研究显示25.9% 的反复着床失败(repeated implantation failure RIF)患者 WOI 发生 改变，通过个性化移植可以提高妊娠结局；但在首次胚胎移植中常规行 ERA并不改善妊娠结局［7］。同时，因为需要子宫内膜活检的有创性操作， 胚胎移植只能在下一个周期进行，从而限制了 ERA的临床应用。
基于对无创检测方法的寻求，最近的研究表明抽吸宫腔液这一操作对胚胎 种植没有负面影响［8］，可作为无创检测手段进行研究；同时显示宫腔液 中含有细胞外囊泡(extracellular vesicl,eEVs ) ［9］，并在母-胎的相互 作用中起关键作用。本文就宫腔液EVs在ER方面的研究展开综述。
一. 宫腔液EVs的基本概述
宫腔液主要由子宫内膜腺上皮细胞分泌，对于滋养胚胎至关重要。EVs是 由细胞分泌的具有磷脂双分子层结构的囊泡，根据其大小及生物学来源可 以分为外泌体、微囊泡和凋亡小体。Ng等［9］在2013年首次报道人子 宫内膜上皮细胞系ECC1可以产生EVs，同时也证实了人类宫腔液中存在
EVs。
目前已经在许多体液中检测到EVs，如卵泡液、宫腔液、血液、乳汁、唾 液、脑脊液及尿液等；此外，在胚胎培养基中也检测到EVs。EVs可以携 带并转移多种调控因子，如微小RNA (microRNA , miRNA )、蛋白质、 mRNA 、代谢产物等；利用体积小的优势，跨越细胞间屏障相对容易，并 且可以免受细胞外降解或修饰，通过与靶细胞质膜融合、内吞等方式在细 胞之间传递信息［10 ］；在卵泡发育成熟、胚胎发育及着床等生殖过程中 起重要作用。
1. 外泌体：1987年，Johnstone等［11 ］首次在成熟网织红细胞培养中 鉴定出了外泌体。外泌体直径在30~150 nm 之间，包含有蛋白质、RNA、 脂质成分等。其表面有不同类型的蛋白质分子，如四联体跨膜蛋白(CD63、 CD81 )、整合素、免疫球蛋白、细胞骨架相关蛋白、转运相关蛋白、热休 克相关蛋白及参与膜运输和囊泡形成的蛋白等。外泌体也携带不同类型的 小RNA，如tRNA、miRNA 等［12］，可参与抗原呈递、免疫激活、免 疫抑制和免疫耐受等免疫相关过程［13 ］。外泌体通过其miRNAs组成反 映了其细胞起源和母细胞的生理状态，这使得外泌体可以作为多种疾病的 生物标志物候选之一 ［14 ］。
2. 微囊泡：几乎所有真核细胞在凋亡或激活过程中都会从质膜上脱落出小 的膜碎片，这些膜碎片被称为微囊泡。1967年，Wolf教授［15］首次描 述了微囊泡，它可以在亲代细胞和受体细胞之间运输生物活性分子如细胞 骨架相关蛋白、热休克蛋白、整合素［16 ］,来影响细胞间通信。作为细 胞间通讯的中介，微囊泡与外泌体一样可以参与信号转导以及免疫调节 ［17 ］。因此，微囊泡也可能作为生物标志物用于诊断人类疾病发生发展。
3. 凋亡小体：由凋亡细胞在循环中释放的大小介于50~50 nm 之间的异 质性EVs被称为凋亡细胞来源的EVs (apoptotic EVs，Apo-EVs )［ 18 ］： 其中，直径介于10~50 nm 之间的Apo-EVs称为凋亡小体，直径介 于 50 10 nm 的 Apo-EVs 称为凋亡微囊泡(apoptotic microvesicles, Apo-MVs )［19］。与外泌体和微囊泡不同，凋亡小体包含完整细胞器、 遗传物质和少量糖基化蛋白，其功能仍在研究中，已知凋亡小体的两个关 键作用是清除凋亡细胞和介导细胞间通讯。凋亡小体的清除机制缺陷可引 起自身免疫反应［19 ］。
在大多数文献中，因其功能相似，EVs、微囊泡和外泌体这3个术语可以 互换。EVs的膜受体和分子内容决定了其功能，EVs中包含有蛋白质、生 物活性脂质、各种RNA和DNA，以及其他细胞调节因子。到目前为止， 关于ER的多数研究聚焦于EVs中的基因(特别是miRNA )和蛋白质。
二. 、EVs中miRNA 与胚胎着床 miRNA 是一种由内源性基因编码的18~24个核苷酸组成的非编码单链
RNA ［20］,可以选择性地从细胞转移到EVs中，随后再转移到其他细胞。 作为基因表达的负调控因子，通过与RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC )结合实现基因沉默。单个miRNA 可以调控 多个靶mRNA ，而单个mRNA也可被多个miRNA 调控，这意味着它们
之间的调控相当复杂［21］。miRNAs 在生物发育过程中发挥重要的调节 作用，其水平在不同细胞类型和不同发育阶段均发生变化，通过特异性地 与mRNA 的3，端非编码区域结合后在转录水平调控其下游蛋白表达，直 接或间接影响细胞的发育、增殖、黏附、血管生成、迁移和转移、植入过 程［22］。它不仅影响胚胎滋养细胞的分化、迁移和侵袭能力，还参与调 节子宫内膜功能，包括上皮间充质转化、迁移和子宫内膜蜕膜化［23 ］。
Ng等［9］通过分析来自人子宫内膜上皮细胞系和其来源的EVs中的 miRNA ，共检测到227种miRNA ，其中13种是EVs特有的，miR2c、 miR-17和miR-106a含量最丰富；生物信息学分析提示EVs中miRNA 的靶基因与多种生物学过程相关，如与蜕膜化和滋养层细胞分化相关的 Hippo信号通路［24 ］、维持上皮和滋养层完整性所需的连接蛋白家族成 员［25 ］、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factorVEGF )、 酪氨酸激酶信号转导及转录激活因子(Janus Kinase-signal transducer and activator of transcriptionJAK-STAT )、toll样受体等与着床相关 的信号通路［26 ］。
Tan等［27 ］研究显示miR-1-5p在具有容受性的人子宫内膜上皮细胞 系来源的EVs中富集，而阻断miR-1-5p 可以影响正常胚胎着床； miR-1-5p 可以激活黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)和 磷脂酰肌醇 3 激酶/蛋白激酶 B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)信号通路来调控细胞迁移和侵袭，从而增强细胞植 入能力。然而，miR-1-5p下游的具体分子机制还有待进一步研究。该 团队另一项研究表明，小鼠子宫内膜来源的EVs中miR-34c-5p可靶向调 控生长抑制特异性蛋白(growth arrest specific，1 GAS1)从而引起反 复种植失败；此外，宫腔液中miR-34c-5p 还可通过靶向调控RAB27B 来抑制EVs的释放［28 ］。另有学者认为，在牛的子宫内膜上皮细胞中加 入着床前后宫腔冲洗中提取的EVs，导致子宫内膜上皮细胞中与免疫相关 的转录本下调；用miR-98孵育牛子宫内膜上皮细胞，可导致组织蛋白酶 C ( cathepsin C， CTSC )和白细胞介素-6 ( interleukin 6， IL-6)的下 调，因此miR-98被认为是参与母体免疫系统形成和EVs诱导基因表达变 化的潜在调节因子［29 ］。
Vilell等 ［ 30 ］证实宫腔液外泌体携带的miR-30d可被小鼠囊胚内化并 起转录组修饰因子的作用，导致ITGB3、ITGA7、CDH5等由整合素介导 的参与黏附和胚胎发育的基因过表达，进而影响胚胎着床。Balaguer等
［31 ］以miR-30d基因敲除小鼠为模型显示，母体miR-30d缺陷而非胚 胎miR-30d缺陷导致ER明显下降。总之，宫腔液外泌体中miR-30d参 与ER调控，并可能成为ER的潜在标志物。Li等［32］首次比较了健康 女性自然周期中黄体生成素(luteinizing hormone， LH ) +2与LH+7、 接受控制性卵巢刺激(controlled ovarian stimulation COS )女性中人 绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG )+2 与 hCG+7的宫腔液EVs全转录组，结果显示12个小非编码RNA包括11 种miRNAs 在两组中均差异表达。功能分析提示这些miRNA 除与EVs 转运功能相关外，与免疫应答、细胞外基质(extracellular matrixECM ) 重构和细胞连接等生物过程密切相关；差异基因富集分析结果显示与 Hippo 和转化生长因子-^(transforming growth factor (3, TGF- 0)信 号通路高度相关。TGF- 3信号通路可调节人类胚胎干细胞向中胚层或内胚 层分化［33 ］; Hippo信号通路控制小鼠胚胎细胞向滋养外胚层或内细胞 团的分化［34 ］,抑制Hippo信号通路可以减少滋养层的附着和生长［35 ］。 因此，宫腔液EVs可能通过miRNA 在胚胎中靶向调控Hippo和TGF- 0 信号通路影响胚胎着床。
尽管目前在细胞水平、动物实验甚至人体研究中已检测出子宫内膜细胞/ 宫腔液EVs中许多差异性表达的miRNA 参与了胚胎黏附、血管生成及细 胞迁移、侵袭等过程，但是目前尚无关于差异性miRNA 作用于其靶向 mRNA 甚至影响下游蛋白质表达的机制研究，尚需要更深入地研究宫腔液 EVs的转录组及其具体作用机制，探索潜在的ER标志物的可能。
三. EVs中蛋白质与胚胎着床
宫腔液EVs中蛋白质组成随月经周期呈现动态变化［36 ］。在卵泡期雌激 素为主要激素时，外泌体蛋白组中富含细胞骨架重组和信号级联相关蛋白。 而在排卵后，孕激素为主要激素时，外泌体蛋白质组转变为与基质重组和 胚胎植入相关。外泌体的蛋白组学研究表明其通过多种方式来参与植入和 早期妊娠过程。
Greening等［36 ］通过体外实验检测人子宫内膜上皮细胞外泌体的蛋白 质组分显示，分泌期宫腔液外泌体包含许多与胚胎植入有关的蛋白质。其 中fibulin1(FBLN1 )是一种与ECM重构、细胞黏附、迁移以及基底膜 相互作用有关的分泌糖蛋白［37 ］，在月经周期、着床和妊娠等不同阶段 受到高度调控［36 ］，表明FBLN1可能是参与胚胎着床的关键分子。此外， 在分泌期宫腔液外泌体中含有大量富半胱氨酸61 ( cysteine-rich 61， CYR61 )。Greening等［36 ］证实CYR61与ECM 重构有关，并可以通 过激活FAK信号通路增加滋养细胞黏附能力。在胎盘发育过程中，存在于 滋养层细胞中的CYR61还可促进子宫血管向胚胎方向生长［38 ］。
Braundmeier等［39 ］在一项体外实验中证实人子宫上皮细胞分泌的EVs 含有细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellularmatrix metalloproteinase inducer， EMMPRIN )，可以刺激子宫基质细胞中金 属蛋白酶的产生，进而影响子宫内膜基质重塑。在妊娠建立过程中，
EMMPRIN 通过调节基质蛋白酶-2和基质蛋白酶-14的表达影响组织重塑 和发育进而在胚胎与腔上皮细胞的黏附和融合中发挥关键作用［40］。最 近，Luddi等［41 ］报道在人类宫腔冲洗液的外泌体中孕激素相关子宫内 膜蛋白 （progesterone associated endometrial proteins , PAEP ）表达 在分泌早期（黄体早期和中期）升高，随后下降；伴随雌激素受体在黄体 中期上调和孕激素受体在黄体期逐渐下调，最终有利于胚胎着床。
Rai等［42 ］比较不孕和健康女性增殖期与分泌期宫腔液EVs中蛋白质， 与不孕女性相比，健康女性宫腔液EVs中富含与抗氧化活性（SOD1、 GSTO1、MPO 、CAT ）、胚胎着床（PRDX2、IDHC ）、子宫内膜容受（S1A4、 FGB、SER-PING1、CLU、ANXA2 ）和着床（CAT、YWHAE 、PPIA ）相 关的蛋白质。健康女性分泌期与增殖期相比，侵袭相关蛋白（LGALS1/3、 S1A4/11 ）显著富集。这提示宫腔液EVs中蛋白质表达水平可反映子宫 内膜周期及其容受性变化oEVs也可携带细胞因子如IL-10IL-1a、IL-18、 IL-32、TNF- a和IL-6等，妊娠期间外周血EVs中细胞因子水平较非妊娠 期增加，提示细胞因子可能有助于调节母体对胎儿的免疫反应［43 ］。总 之，宫腔液EVs中丰富的蛋白质参与胚胎着床、胎盘发育及母-胎免疫等 生物学过程，可能成为ER标志物。期待将来更多的研究着眼于EVs中与 ER相关的蛋白质及其作用机制研究，从而发现可以适用于临床的标志物。
四. EVs中脂质、DNA与胚胎着床
脂质在改变膜的物理性质、生物功能及为细胞供能方面起重要作用，目前 对于子宫内膜来源的EVs中脂质研究较少。有学者研究显示前列腺鳞状上 皮细胞和前列腺癌细胞来源的EVs与它们的母细胞相比富含某些类型的脂 质，主要为鞘磷脂、胆固醇、磷脂酰丝氨酸、神经酰胺及其衍生物［ 44-45 ］, 以及一些饱和脂肪酸［46 ］。相比之下，磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂 酰胆碱和磷脂酰乙醇胺在其母细胞含量更多［44 ］。鲜有关于EVs中DNA 含量的报道，有研究指出EVs中的双链DNA ［47］、线粒体DNA可通过 外泌体在细胞间运输［48 ］。目前尚无宫腔液EVs中脂质、DNA与胚胎着 床的相关研究。
五. 展望
综上所述，宫腔液中细胞外囊泡中分子种类丰富，多种miRNA 、蛋白质 参与ER的调控，EVs作为潜在的ER标志物有广泛的应用前景。目前多数 关于EVs在生殖方面的研究主要为动物模型及体外实验，多数仅集中在探 索某一差异表达的基因或者蛋白质，缺乏对于其基因组学或蛋白质组学的 总体性描述。随着生物技术的进一步发展，期待未来宫腔液EVs在ER的 研究进一步深入，发现潜在的ER标志物，进而有助于提高辅助生殖技术 的结局。