PCR技术原理及实验操作.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,PCR,理论基础及基本操作,李 静,2012.2.21,1,第一节,PCR,技术,聚合酶链式反应,P,olymerase,C,hain,R,eaction,PCR,的基本原理,PCR,的成分,PCR,的操作步骤,2,一、,PCR,的基本原理和步骤,基本原理,DNA,复制,碱基互补配对原则,A=T,，,G=C,3,一级结构的文字式缩写,基因,TGCAGGTTAAAGG,它的互补链,:,ACGTCCAATTTCC,(,误,),CCTTTAACCTGCA,(,正,),3,-ACGTCCAATTTCC-5,(,正,),A,T,G,C,A,A,A,-T,A-,T,A,T,C,G,C,G,G,C,G,C,A,T,T,T,A,T,G,C,C,G,A-,T,A,-T,A,T,C,G,G,C,G,C,A,-T,AT,GC,TA,CG,TA,A-T,A-T,AT,CG,GC,G-C,4,二、,PCR,的成分,模板（,Template DNA,）,引物（,Primer,）,Taq,DNA,聚合酶,dNTP,Taq,聚合酶缓冲液（,Taq,Buffer,）,所有成分在同一离心管中,5,模板,是一段单链或者双链,DNA,，提供用于进行,PCR,扩增的原始信息,对模板的纯度,要求低，但不能混有蛋白酶、核酸酶、,DNA,聚合酶抑制剂、,DNA,结合蛋白等,模板浓度过高会导致非特异性扩增增加,模板,DNA,应该尽量保持低温保存,6,引物,一段短的单链,DNA,片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，,DNA,聚合酶可由其,3,端开始合成新的核酸链,引物浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降,；浓度过低产物量少,7,Taq,DNA,聚合酶,以,DNA,为复制模板，从将,DNA,由,5,端点开始复制到,3,端的酶。,DNA,聚合酶的主要活性是催化,DNA,的合成（在具备模板、引物、,dNTP,等的情况下）及其相辅的活性。,必须一直保存于20，内含甘油保存,最适反应温度,72,，即延伸温度,在配制,PCR,体系的最后加,入,酶量增加使反应特异性下降；酶量过少影响反应产量,8,dNTP,脱氧核糖核苷三磷酸的缩写，是包括,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dUTP,等在内的统称，即合成新的,DNA,链的材料,4种,dNTP,的浓度相等,浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量,9,Buffer,维持,Taq,酶扩增的最适条件和稳定性,Mg,2+,是,Taq,DNA,聚合酶的激活剂,过高,:,非特异扩增增加,过低,:使,Taq,酶活性丧失，反应产物减少,10,注意事项,所有的,PCR,体系都应该在,-20,保存,除了,ddH,2,O,之外，完全融化之后再加入，以免影响浓度,配制反应体系应在冰上操作或快速进行，以减少非特异性扩增,体系配制完成之后应马上进行,PCR,反应,分装处理，专人专用，防止交互污染,11,三、,PCR,的步骤,12,三个步骤,变性(,denaturation)-,高温下将模板,DNA,双链打开,退火(,annealing)-,引物在较低温度下以共价键结合到模板,DNA,互补部位,延伸(,extension)-,Taq,酶作用下，不断向引物,3,端添加,DNTP,，,DNA,链不断延伸,反应液中含有所有成分，以温度变化来控制反应阶段：,变性,94,度，退火,58,度，延伸,72,度。,13,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（）,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复,13,步,2530,轮,目的,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,单链,与引物复性,DNA,变性,形成,2,条单链,子链延伸,DNA,加倍,14,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（）,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复,13,步,2530,轮,目的,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,单链,与引物复性,子链延伸,DNA,加倍,DNA,变性,形成,2,条单链,模板,DNA,95,变 性,第一轮扩增,15,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,58,引物,1,引物,2,DNA,引物,退 火,16,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,引物,1,引物,2,DNA,引物,72,Taq,酶,Taq,酶,延 伸,17,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,第,1,轮结束,95,第,2,轮开始,18,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,50,Taq,Taq,Taq,Taq,72,19,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,72,第,2,轮结束,20,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,模板,DNA,第,1,轮扩增,第,2,轮扩增,第,3,轮扩增,第,4,轮扩增,第,5,轮扩增,第,6,轮扩增,21,PCR,的特点,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,灵敏度高,皮克,(pg=10,-12,),量级扩增到微克,(ug=10,-6,),水平,能从,100,万个细胞中检出一个靶细胞,病毒检测的灵敏度可达,3,个,RFU,细菌检测的最小检出率为,3,个细菌,简便、快速,一次性加好反应液，,2,4,小时完成扩增,扩增产物一般用电泳分析,对标本的纯度要求低,血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提,DNA,22,PCR,的反应体系,23,标准的,PCR,反应体系,10,X,扩增缓冲液：,5l,模板,DNA:0.12g,引物：各0.21,mol/L,4,种,dNTP:,各200,mol/L,Mg,2+,:1.5mmol/L,Taq DNA,聚合酶：2.5,U,ddH,2,O,补齐,总体积：,5,0,l,可以按照比例放大或者缩小体系，不同的,PCR,反应需要优化,按照实验方案进行即可,24,PCR实验的设计,除实验样品外，每个PCR反应都必须有阳性和阴性对照-针对模板,阳性：验证PCR反应体系和条件的正确性,阴性：验证PCR反应有无污染,25,PCR,循环参数,94,，,3min,；,94,，,45s,；,58,，,1min,；循环,30,次,72,，,1min,；,72,，,10min,；,16,保温,（热力学参数）,26,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（）,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复,13,步,2530,轮,目的,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,单链,与引物复性,DNA,变性,形成,2,条单链,子链延伸,DNA,加倍,27,94,，,3min,；,94,，,45s,；,58,，,1min,；循环,30,次,72,，,1min,；,72,，,10min,；,16,保温,94,预变性，,3min,使,DNA,双链完全打开,退火：,58,，,1min,温度由引物长度和,GC,含量决定。,增加温度能减少引物与模板的非特异性结合，降低温度可增加反应的灵敏性。,变性：,94,变性，,45s,使双链,DNA,解链为单链,延伸：,72,，,1min,温度为,Taq,酶最适反应温度,72,时间由扩增片段的长度决定,1min,扩增,1KB,28,循环次数：,主要取决于模板,DNA,的浓度,次数过多：扩增效率降低,错误掺入率增加,29,第二节 凝胶电泳,(,gel electrophoresis),电泳概念,基本原理,Q,6,r,:,迁移率,Q:,电荷量,r:,粒子半径（分子量）,:,介质粘度,30,电泳的用途,分离,鉴定纯度,测定分子量,凝胶电泳的种类,琼脂糖凝胶电泳(,),聚丙烯酰胺凝胶电泳,31,琼脂糖凝胶电泳,(,agarose gel electrophoresis),分离核酸原理,操作要点,应用范围,32,（一）,分离核酸原理,电荷效应,分子筛效应,分子构象,33,1.电荷效应,核酸是,两性电解质,pH=3.5,正电荷,pH=8.0,8.3,负电荷，向正极移动,在电泳缓冲液中，,DNA,带负电荷，在电场作用下向正极移动,电泳不能使用蒸馏水，必须使用电泳缓冲液,34,2.分子筛效应,小分子,移动快,，大分子移动慢,35,3.分子构象,闭环超螺旋线状,DNA,开环,DNA,+,-,36,（二）操作要点,支持物,凝胶浓度的选择,DNA,分子量标准,电泳缓冲液,样品制备,电泳条件,DNA,电泳染色,37,1.支持物,-,琼脂糖,琼脂糖是由,1,，,3,连接的,B-D-,半乳呋喃糖和,1,，,4,连接的,3,，,6,脱水,-L-,半乳呋喃糖相间联结而成。琼脂中除琼脂糖外，尚含有琼脂糖果胶,(Agaropectin),和丙酮酸等带电荷基团分子，在琼脂糖制备过程中尽可能地,去除掉这些带电荷分子,，以便获得品质优良的电荷,中性产品,。,38,商品化的琼脂糖,西班牙,琼脂糖,agrose,与,细菌培养用,琼脂,agar,的区别,39,2.凝胶浓度的选择,40,凝胶的制备,注意：使用电泳缓冲液进行配制；加热过程中要不时摇动，使附着于壁上的琼脂糖颗粒进入溶液溶解。,41,42,3.,DNA marker,上样,3,l,，,750bp,条带为,50ng,，其它,25ng,上样,3,l,，,500bp,条带为,50ng,，其它,25ng,43,DNA,长度标准曲线,44,4.电泳缓冲液,Tris-,乙酸(,TAE)pH 8.0,Tris-,硼酸(,TBE)pH 8.0,Tris-,磷酸(,TPE)pH 8.0,凝胶制备时一定要使用电泳缓冲液,45,5.样品制备,DNA,样品,每条带100,ng,上样缓冲液,50%甘油/蔗糖,0.5%溴酚蓝/二甲苯青,作用：上色；沉降,46,点 样,47,48,6.电泳条件,恒压电泳,低压:12,V/cm,中压:810,V/cm,高压：几十,V/cm,温度：1525,49,7.电泳染色,溴化乙锭(,ethidium bromide,EB,),荧光基团，在紫外光下显色,50,紫外灯下显色,51,Pipetman移液器（枪）的使用,法国,Gilson,德国,Eppendorf,芬兰,Dragon,工欲善其事必先利其器,52,根据实验需要选择合适量程的移液器,在该过程中，,千万不要将按钮旋出量程,，否则会卡内部机械装置而损坏了移液枪。,53,卡紧的标志是略为超过,O,型环，并可以看到连接部分形成清晰的密封圈,54,用大拇指将按钮按下至第一档，然后,慢慢松开,按钮回原点。接着将按钮按至第一档排出液体，稍停片刻继续按按钮至,第二档吹出,残余的液体。最后,先,将移液器从液体中,取出,，,后松开,按钮。,注意按至吸液档时不要插入液面之下，否则会产生气泡。,吸液档（第一档）和放液档（第二档）,55,移液器的正确放置,使用完毕，可以将其,竖直挂在,移液枪架上，但要小心别掉下来。当移液器枪头里,有液体时，切勿将移液器水平放置,或倒置，以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。,56,57,用大量程的移液器移取小体积的液体,移液体积需保证在移液器所提供的量程范围之内才符合准确度和精确度数值的要求,吸取具有强挥发性的液体,如果一定要移取强挥发性的液体，应该在移液结束后立刻拆开移液器，让蒸汽挥发,移液速度和放液速度过快,慢吸慢放，不会产生气泡，移液准确,58,59,60,细节决定成败！,61,