毛细管电泳测定阿片肽方法的探索.doc

毛细管电泳测定阿片肽方法的探索（全面版）资料
毛细管电泳测定阿片肽方法的探索
项目完成人员：董标 董方霆 梁月琴 吴胜明 杨征*
项目完成单位：军事医学科学院 生物医学分析中心
*中国人民解放军第307医院

摘 要 阿片肽是一类具有广泛作用的神经肽，放射免疫分析（RIA）是目前测定生物体内微量阿片肽的一种灵敏方法，但也存在诸多缺点。为了开辟阿片肽定量的新途径，我们以阿片肽的标准品（脑啡肽、强啡肽、b-内啡肽）为分离目标，采用毛细管电泳技术对此进行摸索。以荧光素异硫氰酸盐（FITC）为衍生化试剂，建立用毛细管区带电泳-激光诱导荧光检测测定亮氨酸脑啡肽（Leu-ENK）的方法，检测限达10-14mol，线性范围是35.2~563.1 fmol/mL，（n=7）r=0.9985。测得样品微透析液中脑啡肽的含量为7.4´10-15 mol/mL，并对串联质谱测定阿片肽的方法进行尝试。

阿片肽存在于哺乳动物的组织和体液中，作用极为广泛，具有镇痛、抑制呼吸和参与应激反应等功能，与学习和记忆、生殖内分泌、免疫功能的调节也密切相关[1]。阿片肽的定量测定最常用的方法是放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA），它是通过专一活性（specific activity）高的示踪物，观察抗原与抗体结合反应产物来定量微量物质的一种分析方法。其缺点是一个抗体和其它肽的交叉免疫反应，限制了分子的专一性；其次放免试剂盒的成本较高，一种放免试剂盒只能测定其中一种阿片肽，操作复杂费时，使用时接触有生物毒性的放射性物质（如125 I），易对人体造成损害。毛细管电泳是上世纪80年代初迅速发展起来的一门分离分析技术，具有高效、快速、灵敏、样品用量少等特点，在生命科学、环境科学、食品科学、临床等领域有着广泛的应用[2-3]。毛细管电泳的分离模式众多，分离机理也各不相同，对样品来源受到限制的少量体积样品（如微透析液）分析，尤其是毛细管电泳-激光诱导荧光检测（CE-LIF），已成为首选技术。目前，CE-LIF用于直接测定微透析液中物质主要集中在一些氨基酸和生物胺等小分子物质方面[4-5]，未见测定多肽、蛋白等生物大分子的报道。为了开辟阿片肽定量的新途径，对生物样品中微量的阿片肽能同时测定，我们以阿片肽的标准品（脑啡肽、强啡肽、b-内啡肽）为分离目标，采用毛细管电泳技术对此进行摸索。
一、实验部分
1.1仪器与试剂
P/ACE5000型毛细管电泳仪（Beckman 公司，美国），配有紫外-可见检测器和氩离子激光诱导荧光检测器（lex = 488nm，lem = 513nm），Gold System数据处理系统；弹性石英毛细管柱，50、75mm内径，购自河北永年光导纤维厂。质谱仪为电喷雾四极杆飞行时间串联质谱Q-TOF 2，英国micromass公司；亮氨酸脑啡肽（Leu-ENK）纯度99%、含量79%，强啡肽A（DYN A）纯度99%、含量72%，b-内啡肽（b-EP）纯度99%、含量77%，均购自sigma公司；荧光素异硫氰酸盐（FITC）异构体Ι、三羟基甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸钠（SDS）为进口分装；四硼酸钠、硼砂、氢氧化钠等试剂均为国产分析纯。实验用水均为Milli-Q级，实验室自制。微透析液用微透析探针采自大鼠脑部的伏隔核区，分子量截留大于3500D，由合作单位提供。
1.2 缓冲液的配制
Tris-H3PO4缓冲液：称取一定量的Tris，水溶解后，用H3PO4调pH，定容至所需浓。
Tris-硼砂缓冲液：称取Tris和硼砂,适量水溶解后，用NaOH调pH，定容至所需浓度。
硼砂-硼酸缓冲液（含SDS）：称取适量硼砂、硼酸、SDS，加一定量的水溶解后，用NaOH调pH，定容至刻度。
1.3 标准品溶液的配制
精密称取一定量的阿片肽标准品，用去离子水溶解，配成浓度为1mg/mL的储备液，放-20℃保存，临用前稀释到所需的浓度。微透析液每次取5mL，未作任何处理，直接进行衍生化分析。
1.4 样品的衍生化过程
所有衍生化过程都在200mL具塞离心管中进行。取一定量的样品液和0.2mol/L pH9.0碳酸钠盐缓冲液，衍生化时加入一定量的FITC溶液（0.2mg/mL，乙腈溶解，含1%甲醇、0.25‰吡啶v/v），涡旋混匀后避光室温反应12-14h。空白对照按相同方法配制，每次样品衍生化时均同时制备空白对照。
1.5 电泳条件
柱子使用前用0.1mol/L的NaOH，H2O、运行缓冲液分别洗柱10min，每次进样前用H2O压力冲洗2min，缓冲液冲洗4min。每分析4-5次后更换新的运行缓冲液，UV或LIF检测。

二、结果与讨论
2.1分离模式的选择
P/ACE5000型毛细管电泳仪配有检测器（波长200nm、214nm、254nm、280nm）和激光诱导荧光（LIF）检测器（lex/lem 488/520nm）。由于UV检测器的通用性，对于蛋白质、肽类样品不需要任何处理即可检测，我们首先用UV检测方法对阿片肽标准品进行分离。采用MEKC的分离模式对阿片肽标准品分别进样分离，仅Leu-ENK脑啡肽出现色谱峰。采用CZE分离，Leu-ENK、b-EP、DYN A在不同的保留时间出峰，混合后进样，三者能完全分开，见图1、2。在相同进样量情况下，Leu-ENK色谱峰的吸收强度约是MECC分离时的色谱峰强度的10多倍，故此确定CZE为分离模式。配制一系列不同浓度的阿片肽标准混合液，进行分离。阿片肽的UV最小检测限约为2´10-12 mol/mL。文献报道用RIA测定脑组织中内源性阿片肽的浓度仅为pg/mg的水平，UV检测的灵敏度远低于实际样品的含量。LIF检测是CE所有检测方法中灵敏度最高的一种方法。但是大多数物质的荧光量子产率很低，或不发荧光。特别是感兴趣的一些生物大分子，如氨基酸、多肽和多数蛋白质等。因此，需借助衍生或荧光标记技术，使待测组分转变为能发荧光的衍生物，提高检测灵敏度。不同的荧光试剂有不同的激发和发射波长，标记的对象也不尽相同。常用的荧光衍生试剂见表1–1。
表1–1 常用的荧光衍生试剂
衍生试剂
激发和发射波长
反应物
荧光素异硫氰酸盐
（fluorescein isothiocyanate, FITC）
lex 490nm
lem 519nm
氨基酸、多肽、蛋白质
荧光胺
（fluorecamine）
lex 390nm
lem 450nm
伯氨基酸
邻苯二甲醛
（o-phthaldialdehyde，OPA）
lex 350nm
lem 450nm
氨基酸、多肽、蛋白质、胺
萘二醛衍生物
（naphthalene-2，3-dicarboxyaldehyde，NDA）
lex 442nm
lem 490nm
氨基酸，多肽，生物胺
3-（4-羧基甲酰基）-2-奎宁羧醛
[3-（4-carboxybenzoyl）-2-quinoline，CBQCA]
lex 456nm
lem 552nm
氨基酸、多肽
四甲基罗丹明异硫氰酸盐
（tetramethylrhodamine isothiocyanate，TRITC）
lex 543nm
lem 570 nm
氨基酸、多肽
异硫氰酸苯脂
（phenyl-isothiocyanate，PITC）
lex 290nm
lem 345nm
氨基酸、多肽、蛋白质
9-芴基甲基氯甲酚酯
（9-fluorenylnethyl chloroformate，FMOC）
lex 260nm
lem 305nm
氨基酸
恰当地选择激发波长和荧光标记试剂，对提高检测灵敏度有着重要意义。毛细管电泳仪配备的LIF检测器，其lex/lem为固定波长（488/520 nm），限制了荧光试剂的选择范围，最适合的荧光衍生试剂仅有FITC。
图1 MEKC和CZE分离脑啡肽标准品电泳图 MEKC的分离条件：毛细管柱：50mm ´57cm ；电压：20KV， 50mmol/L pH8.5硼砂，含50 mmol/LSDS，检测：（UV）200nm 柱温20℃，压力进样30s。脑啡肽0.5mg/mL
CZE分离条件：毛细管柱：50mm ´37cm ；电压：15KV
缓冲液： 50 mmol/L pH2.5Tris-H3PO4，检测：（UV）200nm 柱温20℃，压力进样4s。脑啡肽0.5mg/mL
ENK
ENK
ENK
DYN
b-EP
图2 阿片肽标准品混合物的CZE分离图
CZE分离条件：毛细管柱：50mm ´37cm ；电压：15KV，缓冲液： 50 mmol/L pH2.5Tris-H3PO4，检测：（UV）200nm 柱温20℃，压力进样2s。脑啡肽、强啡肽、内啡肽均为0.5mg/mL。

2.2样品衍生化条件的优化
FITC用于标记胺、氨基酸、抗体等衍生化条件已有很多研究[6-8]，用于多肽的衍生化还未见文献报道。为了达到最佳的检测灵敏度和分离效率，对柱前衍生条件进行优化是必需的。影响衍生化的因素很多，有反应时间、pH、缓冲液等，我们以Leu-ENK为对象对这些因素考察。文献中溶解FITC的溶剂有丙酮、乙腈、甲醇。经比较发现，用乙腈作溶剂时，分离色谱图上FITC副产物的峰少，FITC-ENK色谱峰的荧光强度与丙酮、甲醇作溶剂时相近，故选择乙腈作为FITC的溶剂。FITC衍生化的过程不快，随着标记化合物的不同，文献上报道的反应时间也不同。衍生化时微量吡啶的存在，会加速反应完成，且起到稳定衍生化产物的作用[5]
A
3
4
1
2
荧光相对强度
min
B
FITC-ENK
4
3
2
1
min
C
1
4
3
2
{
FITC-EP
min
D
4
3
FITC-DYN
2
{
min
图3 CZE-LIF分离三种FITC衍生化的阿片肽标准品电泳图
A空白对照，B 脑啡肽标准品，C 内啡肽标准品，D 强啡肽标准品，1、2、3、4为FITC及其降解产物峰。分离条件：75mm ´ 67cm，60 mmol/L pH9.4 Tris-硼砂缓冲液，电压350kv/cm，
LIF检测：lex/lem 488/520 nm，柱温25℃， 压力进样3s。

在优化的衍生条件下对阿片肽的标准品Leu-ENK、b-EP、DYN A分别进行CZE-LIF分析，结果如图3。脑啡肽的FITC-ENK为一单峰，而b-EP和DYN均为多个色谱峰，可能是多重标记造成的[9]，故强啡肽和b-内啡肽不适宜用FITC进行衍生化测定，无法对b-EP和DYN进行定量分析。
2.3分离条件的优化
进样方式的选择：电动进样与样品溶液的离子强度和各组分的淌度有关，存在“电歧视”现象，故均采用最常用的压力进样方式。电泳分离效果的指标主要考察FITC-ENK峰与FITC及其降解产物色谱峰的分离情况。比较了不同毛细管长度（47、57、67cm）和内径（50、75mm）的分离情况。毛细管柱长分离度好，出峰时间延长；在毛细管柱长度相同的情况下，50mm内径柱分离好于75mm，但由于进样量小，检测限低于后者近一个数量级。综合各种因素，我们选择的毛细管柱为75mm ´ 67cm。考察Tris-硼砂缓冲液不同浓度（20、40、60、80 mmol/L）的分离效果，60 mmol/L分析效果最好。电泳缓冲液的浓度太低，不仅样品区带会发生电扩散，而且电渗流（EOF）的速度过快，降低FITC衍生物的有效淌度差异，从而降低分离效率。随着缓冲液的浓度增加，电渗流速度降低，溶质在毛细管内的迁移速率下降，因此迁移时间延长。但浓度太高，产生的焦耳热的增加也会降低分辨率和分离效率。缓冲液pH是又一影响电泳分离的重要因素，比较pH为8.6、9.0、9.4、9.8、10.0缓冲液的分离结果，选择pH9.4的Tris-硼砂缓冲液。
2.4工作曲线的建立
取Leu-ENK储备液，用水稀释配制一系列不同浓度（mg/mL）0.05、0.08、0.10、0.20、0.40、0.80、1.00的Leu-ENK标准液，各取80mL，按1.4项下方法操作，加入40m L的FITC 和40m L碳酸盐缓冲液，衍生化后进行CZE-LIF分析，所得结果见表2-2。以峰面积A对其相应的浓度C（fmol/mL）进行回归分析，结果见图4，得到回归方程 A =0.49466+0.08592C n=7，r=0.9985。
表2-2 脑啡肽的测定结果
衍生化后脑啡肽的浓度（fmol/mL）
测定的色谱峰面积
35.2
3.29889
56.3
5.53304
70.4
6.20926
140.8
14.15606
281.5
23.09028
422.3
36.54417
563.1
49.49354
图4 ENK的线性回归曲线

C
FITC
A
B
荧光相对强度
min
min
min
FITC-ENK
FITC-ENK
FITC-ENK
{
D
min
图5 CZE-LIF分离FITC衍生化的脑啡肽标准品电泳图
A空白对照，B ENK标准品35.2 fmol/mL.，C ENK标准品70.4 fmol/mL D ENK标准品140.8 fmol/mL，
分离条件：75mm ´ 67cm，60 mmol/L pH9.4 Tris-硼砂缓冲液，电压350kv/cm，LIF检测：lex/lem 488/520 nm，柱温25℃， 压力进样2s。

以3倍信噪比计算检出限，得到ENK检测限为1.6 ´ 10-15 mol/ mL，电泳图见图5。连续进样5次来考察所建立电泳方法的重复性，色谱峰面积和保留时间的相对标准偏差（RSD）分别为10.36%和0.72%。色谱峰面积的RSD较大，部分原因是衍生化后样品中含有易挥发的溶剂乙腈。一段时间后，由于乙腈的挥发，样品的体积变小，浓度相对变大所致。文献中报道CE-LIF的浓度检测限达10-15mol/L水平，是在样品浓度过高的情况下对FITC进行衍生化，然后再逐级稀释到所需浓度，不涉及实际微量样品的分析测定。这种条件下得到的检测限实际上只反映了LIF检测器的检测灵敏度，并不能真实反映整个分析方法的检测限。用建立的方法对实际样品进行测定，测得微透析液中ENK的含量为7.4´10-15 mol/mL，见图6。

A
C
B
FITC-ENK
FITC-ENK
↓
图6 实际样品测定的CZE-LIF图
A 空白对照 B 脑啡肽标准品 C 微透析液
分离条件：75mm ´ 67cm，60 mmol/L pH9.4 Tris-硼砂缓冲液，电压350kv/cm，
LIF检测：lex/lem 488/520 nm，柱温25℃， 压力进样3s
2.5串联质谱法测定阿片肽
我们还尝试建立串联质谱Q-TOF测定阿片肽方法，根据质谱峰强度来定量。配制一系列不同浓度的阿片肽标准品进行测定，检出限为5´ 10-14 mol/ mL。分析微透析液样品，未检出阿片肽，见图7。另外，由于影响质谱峰（离子流）的强度因素很多，用其定量较为困难。
A
B
图7 阿片肽标准品与微透析样品的Q-TOF质谱图
A：三种阿片肽混合物 100fmol/ mL。 B 微透析液样品
MS-MS测定条件：Cone电压 45Ｖ。质量扫描范围 0.5～ 2ｋｕ。源温 80℃。去溶剂气体温度150℃，去溶剂气体流量300L/h 。碰撞气体压力0.24 ＭＰａ。碰撞能量 3 0～ 50Ｖ。
ENK
DYN-A
b-EP
三、结论
CE用于神经肽方面的研究已有不少报道[10-13]，其中Förtüs-Matei A.等[11，13] 以阿片肽标准品为分析对象，建立CE的分离方法，用MEKC分离合成的强啡肽、脑啡肽及其类似物，没有应用于实际样品。用CE直接测定微透析液中阿片肽的研究至今尚为见报道，我们用毛细管电泳技术对阿片肽定量进行摸索，建立CZE-LIF测定Leu-ENK的方法，并测定了微透析液中脑啡肽的含量。这对于研究脑啡肽的作用机制，具有一定的现实意义。建立的CZE-LIF测定ENK的方法还需要在实际应用中进一步完善。

参考文献
1. Olson G.A.，Olson R.D.，Kastin，A.J.，peptides 14（1993）：1339-1378
2. 林炳承 著，毛细管电泳导论，北京，科学出版社，1996：180-243
3. 邓延倬，何金兰 编著，高效毛细管电泳，北京，科学出版社，1996：285-333
4. Hernandez L.，Tucci S.，Guzman N et al，J. Chromatogr. A，1993，652（2）：393-398
5. Robert F.，Bert L.，Denoroy L et al，Anal. Chem.，1995，67（11）：1838-1844
6. Dabek-Zlotorynska E.，Maruszak W.，J. Chromatogr. B，1998，714（1）：77-85
7. Hutt L.D.，Glavin D.P.，Bada J.L. et al，Anal. Chem.，1999，71（18）：4000-4006
8. Verzola B.，Gelfi C.，Righetti P.G.，J. Chromatogr. A，2000，868（1）：85-99
9. Novotny M.V.，Cobb K.A.，Liu J.P.，electrophoresis，1990，11：735-749
10.Förtüs-Matei A.，Li J.J.，Waldon K.C.，J. Chromatogr. B，1997，695：39-47
11.German I.，Roper M.G.，Kalra S.P. et al，electrophoresis，2001，22，3659-3667
12. Förtüs-Matei A.，Day R.，St-Pierre S.A. et al，electrophoresis，2000，21，715-723
13．Phillips T.M.， Analytica Chimica Acta，1998，372：209-218
大气中甲醛的测定方法
【D-JQ】

　　甲醛(HCHO又名蚁醛)为无色液体，分子量30.03，有刺激性气味。对空气比重为1.04。易溶于水、醇和醚。其35%～40%的水溶液称福尔马林，此溶液在室温下极易挥发，加热更甚。甲醛易聚合成多聚甲醛，这是甲醛水溶液混浊的原因。甲醛的聚合物受热易发生解聚作用，在室温下能放出微量气态甲醛。
　　甲醛污染主要来源于工业上制造树脂(酚醛树脂，脲醛树脂等)、塑料、皮革、造纸、人造纤维、胶合板等。另外用作消毒、防腐和熏蒸剂等时，由于直接使用污染空气。
　　接触甲醛后对皮肤和粘膜有强烈刺激作用。长期接触低浓度甲醛蒸汽，可有头痛、软弱无力等。在甲醛浓度达到20～70mg/m3的车间内工作，工人有丧失食欲、体重减轻、持久性头痛、心悸和失眠等现象。甲醛的嗅觉阈在0.06～1.2mg/m3，眼刺激阈低至0.01～1.9mg/m3，并个体间的差异也很大。
　　家具用的颗粒板、聚合板、碎料板等多以脲甲醛树脂做粘合剂，当遇热、潮解时释放甲醛，此外地毯、烟草、除臭剂、消毒剂等也释放甲醛，因此甲醛是室内最广泛的空气污染物之一，已引起严重的环境卫生问题。甲醛对人体危害除引起刺激性慢性疾病外，还能与空气中的离子性氯化物反应生成致癌物——二氯甲基醚，已引起人们的关注。
　　甲醛的测定方法有酚试剂比色法〔1〕、乙酰丙酮比色法〔1〕、变色酸比色法〔1〕、盐酸副玫瑰苯胺比色法、4－氨基－3－联氨－5－巯基－1，2，4－三氮杂茂(简称AHMT)比色法〔3〕等化学方法。仪器法有微分脉冲极谱法、高效液相色谱法和气相色谱法〔4〕。乙酰丙酮比色法对共存的酚和乙醛等无干扰，操作简易、重现性好。变色酸比色法显色稳定，但需使用浓硫酸，操作不便，且共存的酚有干扰测定。两方法的灵敏度相同，均需在沸水浴中加热显色，变色酸加热时间较长些。酚试剂比色法在常温下显色，且灵敏度比上述两个方法都好，已被推荐为公共场所空气中甲醛卫生检验标准方法，( 标准报批稿)〔2〕。AHMT法在室温下就能显色，且SO32－、NO2－共存时不干扰测定，灵敏度比上述比色法均好，已被推荐为室内空气中甲醛卫生检验标准方法(报批稿)〔3〕。气相色谱法选择性好，干扰因素小，也被推荐为公共场所中空气中甲醛卫生检验标准方法(报批稿)〔4〕。扩散法被动式个体监测器由于不用采样泵，体积小重量轻等优点对室内空气中甲醛和个体接触量监测是很有用的。
　　一、酚试剂比色法〔1、2〕
　　(一)原理
　　空气中甲醛被酚试剂溶液吸收，反应生成嗪，嗪在酸性溶液中被高铁离子氧化形成蓝绿色化合物，比色定量。
　　(二)仪器
　　(1)气泡吸收管　普通型，有10ml刻度线。
　　(2)空气采样器　流量范围0.1～1L/min，流量稳定。使用时，用皂膜流量计校准采样系列在采样前和采样后的流量，流量误差应小于5%。
　　(3)具塞比色管　10ml。
　　(4)分光光度计　用10mm比色皿，在波长630nm下，测定吸光度。
　　(三)试剂
　　(1)吸收原液　称量0.1g酚试剂〔盐酸3－甲基2－苯并噻唑酮腙，C6H4SN(CH3)C：NNH2·HCl，简称MBTH〕加水溶解，倾于100ml具塞量筒中，加水至刻度。放冰箱保存。可稳定三天。
　　(2)吸收液　吸量5ml吸收原液，加95ml水。混匀，即为吸收液。采样时，临用现配。
　　(3)0.1mol/L盐酸溶液　量取8.2ml盐酸加水稀释至lL。
　　(4)10g/L硫酸铁铵溶液　称量1.0g硫酸铁铵〔NH4Fe(SO4)2·12H2O优级纯〕，用0.1mol/L盐酸溶液溶解，并稀释至100ml。
　　(5)　碘溶液称量12.7g升华碘和30g碘化钾，加水溶解，稀释至1L。
　　(6)　碘酸钾标准溶液准确称量3.5668g，经105℃烘干2h的碘酸钾(优级纯)，溶解于水，移入1L容量瓶中，再用水稀释至刻度。
　　(7)5g/L淀粉溶液　称量0.5g可溶性淀粉，用少量水调成糊状后，再加刚煮沸的水至100ml，冷却后，加入0.1g水杨酸保存。
　　(8)硫代硫酸钠标准溶液〔C(Na2S2O3)＝0.1000mol/L〕称量26g硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)，溶于新煮沸冷却的水中，加入0.2g无水碳酸钠，再用水稀释至1L。贮于棕色瓶中，如混浊应过滤。放置一周后，标定其准确浓度。
　　标定方法：准确量取25.00ml 0.1000mol/L碘酸钾标准溶液，于250ml碘量瓶中，加入75ml新煮沸冷却的水，加3g碘化钾及10ml冰乙酸溶液，摇匀后，暗处放置3min，用待标定的0.1mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定析出的碘，至淡黄色。加入1ml 0.5%淀粉溶液，呈蓝色。再继续滴定至蓝色刚刚褪去，即为终点。记录所用硫代硫酸钠溶液体积(V，ml)。重复滴定两次，两次所用硫代硫酸钠溶液体积误差不超过0.05ml。其准确浓度用下式计算：

　　(9)甲醛标准溶液
　　①贮备溶液：量取2.8ml含量为36%～38%甲醛溶液，放入1L容量瓶中，加水稀释至刻度。此溶液1ml约含1mg甲醛。其准确浓度用下述碘量法标定。此液可稳定三个月。
　　标定方法：准确量取20.00ml待标定的甲醛贮备溶液，于250ml碘量瓶中，加入20.00ml碘标准溶液，15ml 1mol/L氢氧化钠溶液，放置15min。加入20ml 0.5mol/L硫酸溶液，再放置15min，用0.1000mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定，直至溶液呈现淡黄色时，加入1ml 5%淀粉溶液，继续滴定至恰使蓝色褪尽为止。记录所用硫代硫酸钠标准溶液体积(V2，ml)。同时，用水作试剂空白滴定，记录空白滴定所用硫代硫酸钠溶液的体积(V1，ml)。样品滴定和空白滴定各重复两次，两次滴定所用硫代硫酸钠的体积误差不超过0.05ml。甲醛溶液的浓度用下式计算：

　　式中M——硫代硫酸钠溶液的浓度，mol/L；
　　15——甲醛的摩尔质量的1/2
　　20——标定时所取甲醛标准贮备溶液体积的毫升数。
　　②工作溶液：临用时，将甲醛标准贮备溶液用水稀释成1.00ml含10μg甲醛。立即再取此溶液10.00ml，加入100ml容量瓶中，加入5ml吸收原液，用水稀释至刻度。此溶液1.0ml含1μg甲醛。放置30min后，用于配制标准色列管。此标准溶液可稳定24h。
　　(四)采样
　　用一个内装10ml吸收液的气泡吸收管，以0.5L/min流量，采气10L。并记录采样时的温度和大气压力。采样后应在24h内分析。
　　(五)分析步骤
　　1.标准曲线的绘制
　　按下表制备标准色列管。

　　于标准色列各管中，加入0.4ml 1%硫酸铁铵溶液，混匀，放置15min，用10mm比色皿，以水作参比，在波长630nm下，测定各管溶液的吸光度。以甲醛含量(μg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归线的斜率。以斜率的倒数作为样品测定的计算因子Bs(μg)。
　　2.样品测定
　　采样后，用水补充到采样前吸收液的体积。准确取5ml样品溶液于比色管中。然后，按绘制标准曲线的操作步骤，测定吸光度。
　　在每批样品测定的同时，用5ml未采样的吸收液，按相同操作步骤作试剂空白的测定。
　　(六)计算

　　式中c——空气中甲醛浓度，mg/m3；
　　A——样品溶液的吸光度；
　　A0——试剂空白溶液的吸光度；
　　Bs——用标准溶液绘制标准曲线得到的计算因子，μg；
　　V0——换算成标准状况下的采样体积，L。
　　(七)说明
　　(1)灵敏度和检出限　5ml吸收液中含有0.2μg甲醛应有0.079±0.012吸光度，检出限为0.05μg/5ml。当采样10L时，最低检出浓度为0.01mg/m3。
　　(2)方法的重现性　当甲醛含量为0.1～1.5μg/5ml时，重复测定的相对标准差为5%～3%。
　　(3)方法的准确度　当甲醛含量在0，4～1.0μg/5ml时，样品加标准的回收率为93%～101%。
　　(4)测定范围若用5ml样品溶液，其测定范围为0.1～2μg甲醛。当采样体积为10L时，则可测浓度范围为0.02～0.4mg/m3。
　　(5)室温低于15℃时，显色不完全。应在25℃水浴中保温操作。
　　(6)干扰及排除20μg酚、2μg乙醛以及二氧化氮在一般情况下，对本法无干扰；但乙醛(＞2μg)和丙醛与MBTH反应也产生蓝色染料。此时所测得样品溶液中醛的含量，是以甲醛表示的总醛量。二氧化硫的干扰，可将气样先通过硫酸锰滤纸过滤，予以排除。
　　硫酸锰滤纸的制法：取10ml浓度为100g/l的硫酸锰(MnSO4)水溶液，滴加到250cm2玻璃纤维滤纸上，风干后切成2×5mm碎片，装入15×150mm的U形玻璃管中，采样时，将此管接在甲醛吸收管之前。此法制成的硫酸锰滤纸，吸收二氧化硫的效能受大气湿度影响很大。当相对湿度大于88%，采气速度1L/min，二氧化硫浓度为1mg/m3时，能消除95%以上的二氧化硫，此滤纸可维持50h有效。当相对湿度为15%～30%时，吸收二氧化硫的效能逐渐降低。所以相对湿度很低时，应换用新制备的硫酸锰滤纸。
　　(7)本法显色反应是甲醛与酚试剂缩合生成吖嗪，适宜pH值范围3～7，而以pH＝4～5最好，见图6－45。

　　(8)甲醛标定的原理　甲醛在碱性介质中被碘氧化成甲酸，剩余的碘在酸性条件下用Na2S2O3滴定，从而计算甲醛的量。其反应式

　　(9)甲醛标准液及样品溶液的稳定性。甲醛如直接吸收在纯水中，则很不稳定。放置3～4h降低约10%；放置24h将降低约68%。当在0.005%酚试剂作吸收液中，则放置24h都是稳定的，见表6－28故甲醛标准稀溶液宜用含0.005%酚试剂的吸收液配制。
　　表6－28　甲醛在水及酚试剂中稳定性比较

　　(10)酚试剂用量与显色关系见表6－29，以加入0.2～0.4mg为宜(即5ml吸收液中酚试剂质量)。
　　表6－29　酚试剂用量与显色关系

　　(11)本法氧化剂选用硫酸铁铵，但硫酸铁铵水溶液易水解而形成Fe(OH)3乳浊现象，影响比色，故改用酸性溶剂配制。但酸度也不宜过大，否则原色太深。经试验选用0.1mol/L HCl作溶剂为宜。用1%三氯化铁与1.6%氨基磺酸的混合液作氧化剂，并可防止氮氧化物的干扰。但因试剂原色太深影响比色。本反应加入硫酸铁铵的量不宜过多，否则空白管吸光度值高，影响比色，以加1%硫酸铁铵0.4ml为好。
　　(12)标准曲线　根据本法所规定的条件，在分光光度计上，用1cm比色皿，波长630nm下，甲醛浓度与吸光度的关系见图6－46。
　　(13)显色温度低于15℃时反应慢，显色不完全。20～35℃时15min显色达最完全，放置时间4h稳定不变。

　　(14)采样效率　在现场用双管采样，浓度范围在0.38～1.35mg/m3，采样效率为92.3%～97.7%。
　　二、AHMT比色法
　　(一)原理
　　空气中甲醛被吸收液吸收，在碱性溶液中与4－氨基－3联氨－5巯基－三氮杂茂(AHMT)发生反应，经高碘酸钾氧化形成红色化合物，比色定量。
　　(二)仪器
　　(1)气泡吸收管　普通型，有10ml刻度线。
　　(2)空气采样器　流量范围0.1～1Lmin，流量稳定。使用时，用皂膜流量计校准采样系列在采样前和采样后的流量，流量误差应小于5%。
　　(3)具塞比色管　10ml。
　　(4)分光光度计　用20mm比色皿，在波长550nm下，测定吸光度。
　　(三)试剂

　　(2)5mol/L氢氧化钠溶液　取20g氢氧化钠溶于适量蒸馏水中，稍冷后，加蒸馏水至100ml。
　　(3)AHMT溶液　取0.5gAHMT溶于100ml 0.2mol/L盐酸溶液中，此溶液置于暗处保存。
　　(4)高碘酸钾溶液取0.75gKIO4于100ml 0.2mol/L氢氧化钠溶液中，置于水浴上加热使其溶解。
　　(5)标准溶液配制及标定方法同一法。临用时，用吸收液稀释成1.00ml含1μg甲醛的标准溶液。
　　(四)采样
　　用一个内装10ml吸收液的气泡吸收管，以0.5L/min流量，采气20L。记录采样时的温度和大气压力。
　　(五)分析步骤
　　1.标准曲线的绘制
　　按下表制备标准色列管。

　　于标准色列各管中，加2ml 5mol/L氢氧化钠溶液和2mlAHMT溶液，轻轻摇动数次，混匀，在室温下静置20min，加入2ml高碘酸钾溶液，轻轻振摇5min，用20mm比色皿，以水作参比，在波长550nm下，测定各管溶液吸光度。以甲醛含量(μg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归线的斜率。以斜率倒数作为样品测定的计算因子Bs(μg)。
　　2.样品测定
　　采样后，用少量吸收液补充至采样前吸收液的体积。准确量取2ml样品溶液于比色管中，按标准曲线绘制的操作步骤，测定样品溶液吸光度。
　　在每批样品测定的同时，用未采样的吸收液，按相同的操作步骤作试剂空白测定。
　　(六)计算

　　式中　c——空气中甲醛浓度，mg/m3
　　A——样品溶液的吸光度；
　　A0——试剂空白溶液的吸光度；
　　Bs——用标准溶液绘制标准曲线得到的计算因子，μg；
　　V0——换算成标准状况下的采样体积，L。
　　(七)说明
　　(1)方法灵敏度　2ml样品溶液中含有1μg甲醛应有0.175吸光度。
　　(2)检出限和测定范围　本法检出限为0.13μg/2ml，当采气体积为20L时，最低检出浓度为0.032mg/m3；若用2ml样品溶液，其测定范围为0.2～2.0μg甲醛。当采气体积为20L时，吸收液总量为10ml，则可测浓度范围为0.05～0.8mg/m3。
　　(3)精密度　当甲醛含量为1.0μg/2ml、2.0μg/2ml和3.0μg/2ml时，三个实验室重复测定的相对标准差的平均值分别为3.3%、3.0%和2.6%。
　　(4)准确度　4个实验室加标量在0.5～3.0μg范围时，其回收率范围为93%～99%，平均回收率为97%。
　　(5)乙醛、丙醛、正丁醛、丙烯醛、丁烯醛、乙二醛、苯(甲)醛、甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、仲丁醇、异丁醇、异戊醇、乙酸乙酯对本法无影响；大气中共存的二氧化氮和二氧化硫对测定无干扰。
　　(6)本法显色反应式

　　三、气相色谱法〔4〕
　　(一)原理
　　空气中甲醛在酸性条件下吸附在涂有2，4－二硝基苯肼的6201担体上，生成稳定的甲醛腙。用二氧化碳洗脱后，经OV-1色谱柱分离，用氢焰离子化检测器测定，以保留时间定性，峰高定量。
　　(二)仪器
　　(1)采样管　用长100mm，内径5mm的玻璃管，内装150mg吸附剂，两端用玻璃棉堵塞，采样管两端套上塑料帽密封备用。
　　(2)空气采样器　流量范围0.2～1.0L/min，流量稳定。使用时，用皂膜流量计校准采样系列在采样前和采样后的流量，流量误差应小于5%。
　　(3)具塞比色管　5ml。
　　(4)微量注射器　10μl，体积刻度应校正。
　　(5)气相色谱仪　附氢焰离子化检测器。
　　(三)试剂
　　(1)二硫化碳需重新蒸馏进行纯化，处理方法见第六章第三节中“一、溶剂洗脱气相色谱法”。
　　(2)2，4－二硝基苯肼溶液　称取0.5g 2，4－二硝基苯肼于250ml容量瓶中，用二氯甲烷稀释至刻度。
　　(3)吸附剂　称量10g 6201担体(60～80目)，用40ml 2，4－二硝基苯肼二氯甲烷溶液分二次涂敷，减压，干燥，备用。
　　(4)2mol/L盐酸溶液。
　　(5)甲醛标准溶液　配制和标定方法同一法(533页)。
　　(6)色谱固定液　OV－1。
　　(7)色谱担体　Shimalitew(80～100目)。
　　(四)采样
　　采样时，取下采样管两端的塑料密封帽。将采样管的进气口玻璃棉取出，向管内吸附剂上加一滴(约50μl)2mol/L盐酸溶液，然后，再用玻璃棉堵好，将加入盐酸溶液的一端垂直朝下，另一端连接空气采样器上。以0.5L/min的流量，采气50L，采样后，将管的两端套上塑料帽，并记录采样时的温度和大气压力。
　　(五)分析步骤
　　1.气相色谱测试条件
　　分析时，应根据气相色谱仪的型号和性能，制定能分析甲醛的最佳测试条件。
　　色谱柱：柱长2m，内径3mm的玻璃管，内装OV-1+Shimalitew担体＝1.5＋100。
　　柱温：230℃。
　　检测室温度：260℃。
　　汽化室温度：260℃。
　　载气(N2)流量：70ml/min。
　　氢气流量：40ml/min。
　　空气流量：450ml/min。
　　2.绘制标准曲线和测定校正因子。
　　在作样品测定的同时，绘制标准曲线或测定校正因子。
　　(1)标准曲线的绘制　取5支采样管，各管取下一端玻璃棉，直接向吸附剂表面滴加一滴(约50μl)2mol/L盐酸溶液。然后，用微量注射器分别准确加入甲醛标准溶液(1.00ml含1mg甲醛)，制成在采样管中的吸附剂上甲醛含量在1～20μg范围内有4个浓度点标准管，另一支采样管不加甲醛作为零浓度点，