响应面优化超声辅助提取肉苁蓉多糖的工艺研究.doc

毕 业 论 文

题 目: 响应面优化超声辅助提取肉苁蓉多糖的工艺研究
学 院: 生 命 科 学 学 院
专 业: 生 物 科 学
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指导教师:

目录
摘要 3
关键词 3
1.材料与方法 5
1.1 材料 5
1.1.1实验材料 5
1.1.2 主要仪器与试剂 5
1.2实验方法 6
1.2.1 超声波辅助提取肉苁蓉多糖的工艺流程 6
1.2.2 多糖含量的测定 6
1.2.3 标准曲线的绘制 6
1.2.4 超声波辅助提取肉苁蓉多糖的适宜提取工艺参数的确定 6
1.2.5 多糖提取率的计算公式 6
2.结果与讨论 6
2.1 标准曲线的绘制 6
2.2单因素实验结果 7
2.2.1超声温度对多糖提取率的影响 7
2.2.2料液比对多糖提取率的影响 8
2.2.3超声功率对多糖提取率的影响 8
2.2.4提取次数对多糖提取率的影响 9
2.2.5 超声时间对多糖提取率的影响 10
2.3 响应面设计试验结果 11
2.3.1响应面设计与结果 11
2.3.2 回归模型的建立与分析 13
3.结论 22
参考文献: 22

2

响应面优化超声辅助提取肉苁蓉多糖的工艺研究
白金金
指导教师:张继(研究员)
(西北师范大学 生命科学学院,甘肃 兰州 730070)
摘要:本文利用响应曲面法对肉苁蓉多糖的提取条件进行优化。应用超声波辅助提取肉苁蓉多糖,在单因素试验的基础上,根据Box-Behnken 中心组合设计原理,选取超声时间、超声温度、超声功率、料液比4因素进行响应曲面分析,建立肉苁蓉多糖得率的二次多项数学模型.在分析各因素的显著性和交互作用后,得出肉苁蓉多糖提取工艺的最佳条件为: 超声时间40min,超声温度66℃,料液比1∶21,超声功率55%,提取次数1次,在此条件下肉苁蓉多糖提取率达到36.9274%。
关键词: 肉苁蓉; 多糖; 响应曲面法
Optimization of Microwave-water extraction of polysaccharides from dried Herba Cistanche using response surface methodology
Bai jin-jin
Guidance teacher: Zhang ji
(College of Life Science,Northwest Normal University,Lanzhou, Gansu,China ,730070)
Abstract：Microwave-water technique was applied for polysaccharides extraction from dried Herba Cistanche and the effects of processing parameters on extraction efficiency was optimized using response surface methodology (RSM). Four independent variables were investigated, including the ratio of water to raw material (mL/g),extraction time (min),Microwave power (%) and temperature (℃). A quadratic polynomial mathematical model with good correlation was constructed and employed to the optimization. The optimiaed extraction conditions were determined as: the ratio of water to raw material as20:1, extraction time of 44min,and temperature of 60℃,under which the experimental extraction yield of crude Herba Cistanche polysaccharides was19.12%.
Key words: Herba Cistanche;polysaccharides;response surface methodology (RSM)

肉苁蓉(Cistanche deserticola Y. C. Ma)为列当科肉苁蓉属多年生高等寄生植物，主要生长在盐碱地和戈壁滩一带，寄生在梭梭等植物的根上[1]。 它具有补肾益精、润肠通便和延缓衰老之功能，常被用于补肾壮阳药物中。肉苁蓉中主要的活性成份物质是苯乙醇糖甙类化合物(phenylethanoidglycosides, PeG)、肉苁蓉多糖和甜菜碱。其中PeG 具有清除自由基和抗衰老作用，肉苁蓉多糖可以增强机体的免疫功能，甜菜碱具有抗脂肪肝和抗肿瘤以及扩张外周血管和降压的作用[2]。传统的中草药有效成份的提取一般是在原材料预处理后，用稀酸、稀碱或有机溶剂在高温下浸提，然后再浓缩，进行色谱分离。其中浸提时间一般在4 h 以上，耗时较长。由于PeG、肉苁蓉多糖和甜菜碱都是胞内分泌，所以必须将肉苁蓉细胞破碎才能将其有效成份提取出来。超声波是可在弹性介质中传播的一种机械波。 从微观上讲，超声波可以与介质分子相互作用；宏观上，超声波可在流体中产生空化作用、热效应、冲击力等综合效应。 超声波现已广泛用于高分子化合物的降解、有机合成、提取分离等方面，如从青蒿中提取青蒿素、从盐藻中提取胡萝卜素，均取得了比较满意的效果。
龚立冬[3] 利用毛细管电泳电化学检测法研究荒漠肉苁蓉多糖的单糖组成及相对摩尔比为:葡萄糖:半乳糖:鼠李糖:阿拉伯糖:果糖=10∶0.75∶2.34∶1.29∶1.31 。A.Ebringerova 等 从荒漠肉苁蓉中分离得到cistan A 。主要由L-阿拉伯糖, D-半乳糖 L-鼠李糖和半乳糖醛酸组成, 其摩尔比为6.3∶10.0∶1.0∶0.8 ，并含有微量的D-木糖和D-葡萄糖, 平均相对分子量为2.01 ×105 。董群等[ 4] 用冷水从荒漠肉苁蓉中提取分离得到2 个主要的均一多糖CDA-1A 和CDA-3B 。CDA-1A 由葡萄糖组成, 平均分子质量1.0 ×104 ;化学和光谱分析表明CDA-1A 以α-D-Glcp-(1 ,6)为主链α-(1 ,4)-D-glucan 和α-(1 ,6)-glucan 为支链连接在O-6 上。国内学者研究表明，荒漠肉苁蓉多糖对CCl4 所致肝郁脾虚模型小鼠的作用, 证明荒漠肉苁蓉多糖能明显改善小鼠食欲减退和体质量下降, 明显对抗CCl4 造成的肝损伤;同时能降低因肝脾功能损伤造成的血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶的升高[15]；高慧等的研究证明荒漠肉苁蓉能明显促进体外人成纤维细胞的生长, 这种促生长作用与观察剂量有相关性, 浓度过低或过高都会影响这一作用的发挥, 12.5 μg/mL效果明显高于其它浓度；陈志伟等[ 17] 研究表明, 肉苁蓉多糖能明显促进骨髓G0/G1 期细胞向S 期细胞以及S 期细胞向G2/M 期细胞的转化,G2/M 期细胞比例明显升高, 增殖指数(PI)也明显升高。因此荒漠肉苁蓉多糖可能通过促使骨髓抑制贫血小鼠骨髓细胞周期的转化, 促进骨髓造血功能的恢复, 并促进红系巨核系造血。
欧阳杰等[4]研究了循环超声强化提取肉苁蓉中多糖和甜菜碱的工艺条件. 实验结果表明，将肉苁蓉粉碎至40 目，液固比为60 ml/g 时提取较为适宜. 循环超声提取多糖和甜菜碱的较优工艺条件是：提取温度40℃，超声功率1000 W，提取时间10 min，在此条件下，多糖的提取量为46.9 mg/g，甜菜碱的提取量为136.5 mg/g，分别相当于沸水回流7 h 时提取量的107.3%和103.8%。
玄国东等[5]选用提取时间、提取温度、提取固液比3 个反应因素作为研究对象, 以多糖提取率为考察指标, 通过响应面分析方法优化肉苁蓉多糖的提取工艺条件。研究提取肉苁蓉多糖的最优工艺条件，实验结果表明, 最优工艺条件为提取时间193.0 min、温度94.59 ℃、固液比10.89, 多糖提取率的理论值为85.5%。
超声波是指频率高于2×104 Hz 的声波，是可在弹性介质中传播的一种机械波. 从微观上讲，超声波可以与介质分子相互作用；宏观上，超声波可在流体中产生空化作用、热效应、冲击力等综合效应. 超声波现已广泛用于高分子化合物的降解、有机合成、提取分离等方面，如从青蒿中提取青蒿素、从盐藻中提取胡萝卜素，均取得了比较满意的效果。
本研究从肉苁蓉肉质茎中提取水溶性多糖,使其资源得到充分利用.多糖是由单糖之间脱水形成糖苷键[5] ,并由糖苷键线性或者分枝连接组成的多聚合物,广泛地分布于动物、植物、微生物等几乎所有的有机体中[5-7]。研究[8] 表明多糖类物质具有增强人体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降糖及改善糖尿病症状的作用。因此,本实验就肉苁蓉多糖做了初步研究,对其活性多糖资源的开发利用有着重要意义。
响应面分析法(response surface methodology,RSM)是一种优化反应条件和加工工艺参数的有效方法,广泛应用于化学化工、生物工程、食品工业等方面[9]。它与正交试验设计法不同,具有试验周期短,求得的回归方程精度高，能研究几种因素间交互作用等优点[10-11]。本实验拟在单因素试验的基础上，利用响应面分析法对肉苁蓉多糖提取工艺条件进行优化。
1.材料与方法
1.1 材料
1.1.1实验材料
肉苁蓉肉质茎
1.1.2 主要仪器与试剂
紫外可见分光光度计、超声清洗仪、离心机、1000ml容量瓶、10mL 具塞试管、移液管、20-1000μl移液枪、比色皿、100ml容量瓶、苯酚、浓硫酸、标准葡萄糖
1.2实验方法
1.2.1 超声波辅助提取肉苁蓉多糖的工艺流程
肉苁蓉肉质茎→粉碎过筛→干燥→称重→蒸馏水提取(超声波辅助提取)→离心，取上清液→抽滤,取滤液→旋转蒸发→真空干燥至恒重→肉苁蓉多糖
1.2.2 多糖含量的测定
采用苯酚硫酸法
1.2.3 标准曲线的绘制
分别精密吸取标准葡萄糖溶液0.0、002、0.04、0.06、0.08、0.10、0.20、0.40、0.50、0.80mL 于10mL 具塞试管中,各管加蒸馏水至1ml,然后各试管中加入5%苯酚溶液1ml,再向各试管中加入浓硫酸5ml,混匀,放置10min,于490 nm 处测定其吸光度。以葡萄糖标准溶液浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制标准曲线.得其线性回归方程为:Y=0.0697x-0.0019(R2=0.9985)结果如图1所示。
1.2.4 超声波辅助提取肉苁蓉多糖的适宜提取工艺参数的确定
在预实验的基础上,选取超声时间、超声温度、料液比、超声功率进行多因素优化实验.参照文献报道[12-13],多因素实验采用Box-Behnken设计,利用响应曲面进行分析优化。
1.2.5 多糖提取率的计算公式
超声波辅助提取肉苁蓉多糖的得率
Y(%)＝me ／mo ×100%
其中:me 代表超声波辅助提取得到的肉苁蓉多糖的质量(g), mo 代表肉苁蓉粉的质量(g)。
2.结果与讨论
2.1 标准曲线的绘制

图1 标准曲线
Figure1 Standard curve
2.2单因素实验结果
2.2.1超声温度对多糖提取率的影响
料液比(g/ml)1∶20,超声时间 60min,超声功率100%,提取次数1次,考察超声温度30、40、50、60、70、80℃对肉苁蓉多糖提取率的影响,结果如图2所示.

图2 温度对肉苁蓉多糖提取率的影响
Figure2 Effects of temperature on extraction rate of polysaccharides from Nitraria Sibirica Pall
由图2可知:随着温度的升高，在80℃之前得率处于升高趋势,总糖含量处于下降趋势,40℃之后得率趋于平缓无显著变化,总糖含量呈现上升趋势,在60℃~70℃之间上升较快,从得到的多糖溶液还发现,随着温度的升高,多糖色泽加深。而且温度较低时的多糖溶液较温度较高时的多糖溶液难过滤.考虑到高温可能对多糖结构与活性有一定影响,所以选择60℃~70℃作为提取的适宜温度。
2.2.2料液比对多糖提取率的影响
超声温度60℃,超声时间 60min ,超声功率100%,提取次数1次,考察料液比(g/ml)1∶8、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25对肉苁蓉多糖提取率的影响,结果如图3所示

图3 料液比对肉苁蓉多糖提取率的影响
Figure3 Effects of liquid to solid ratio on extraction rate of polysaccharides from Nitraria Sibirica Pall
由图3可知:随着料液比的增加,得率随之增加,这是因为加水量越大则提取出来的多糖越容易溶解,损失就越少,在10∶1~20∶1之间上升较显著，而在20∶1~30∶1之间呈现下降趋势,在1∶20~1∶25之间上升较显著,从得率和总糖含量综合考虑,料液比选择15∶1~25∶1之间为宜。
2.2.3超声功率对多糖提取率的影响
料液比(g/ml)1∶20,超声时间 60min ,超声温度60℃,提取次数1次,考察超声功率40、50、60、80、100%对肉苁蓉多糖提取率的影响,结果如图4所示。

图4 超声功率对肉苁蓉多糖提取率的影响
Figure4 Effects of ultrasonic power on extraction rate of
polysaccharides from Nitraria Sibirica Pall
由图4可知:随着超声功率的增加,得率处于下降趋势,功率在60、80、100%的得率无显著变化,而总糖含量随着功率的增加基本处于升高趋势,功率在60%~80%之间上升较显著,之后总糖含量迅速下降,可能是到高功率对多糖结构与活性有一定影响,综合得率与总糖含量,功率选择在60%~80%之间为宜。
2.2.5 超声时间对多糖提取率的影响
料液比(g:ml)1:20,超声温度 60℃,超声功率100%,提取次数1次,考察超声时间15、30、45、75、90min对肉苁蓉多糖提取率的影响,结果如图6所示。

图5 超声时间对肉苁蓉多糖提取率的影响
Figure5 Effects of ultrasonic time on extraction rate of polysaccharides from Nitraria Sibirica Pall
由图6可知:超声时间在15~30min之间,得率和总糖含量均上升显著,得率在30~180min,呈现下降趋势,时间在60min~180min无显著变化,而总糖含量60min~120min之间呈现上升趋势,但变化不是很明显,随后迅速下降,这可能是多糖已基本提取完毕,从节省能源,减少生产周期考虑,综合得率与总糖含量,提取时间以60min~70min之间为宜。
23 响应面设计试验结果
2.3.1响应面设计与结果
根据Box. Benhnken的中心组合实验设计原理[14],综合单因素实验影响结果,选取提取时间(X1)、温度(X2)和料液比(X3)、超声功率(X4)对肉苁蓉多糖提取率影响显著的三个因素,在单因素实验的基础上采用四因素三水平响应面分析方法,试验因素与水平设计见表1,响应面分析方案及实验结果见表2。

表1 试验因素和水平
Table 1 Test factors and level
因素
单位
低水平
中水平
高水平
时间X1
min
30
45
60
超声功率X2
W
80
90
100
温度X3
℃
50
60
70
料液比X4
mL／g
15
20
25
表2 实验方案及结果
Table 2 Experimental solutions and results
序号
时间(min)
功率(W)
温度(℃)
液料比(mL/g)
得率(%)
1
30
80
60
20
13.32
2
60
80
60
20
13.68
3
30
100
60
20
14.55
4
60
100
60
20
15.01
5
45
90
50
15
11.32
6
45
90
70
15
14.56
7
45
90
50
25
12.04
8
45
90
70
25
15.00
9
30
90
60
15
14.58
10
60
90
60
15
14.01
11
30
90
60
25
14.12
12
60
90
60
25
14.23
13
45
80
50
20
10.32
14
45
100
50
20
12.12
15
45
80
70
20
14.76
16
45
100
70
20
14.56
17
30
90
50
20
12.16
18
60
90
50
20
13.32
19
30
90
70
20
14.87
20
60
90
70
20
14.32
21
45
80
60
15
13.26
22
45
100
60
15
14.03
23
45
80
60
25
13.78
24
45
100
60
25
14.76
25
45
90
60
20
16.11
26
45
90
60
20
15.91
27
45
90
60
20
16.21
28
45
90
60

20
15.91
29
45
90
60
20
15.81
2.3.2 回归模型的建立与分析
通过SAS数据分析软件对表2中数据进行处理,得到回归模型的方差分析结果(表3)以及多元二次回归方程模型(不带编码),方程的准确性通过多元回归系数R2及修正的多元回归系数RAdj2检验(表4)。统计软件是国际上认可的SAS统计分析软件。其中以肉苁蓉得率和肉苁蓉多糖提取率的吸光度为响应值。采用SAS RSREG程序对响应值与各因素进行回归拟合后,得到回归方程:

回归方程中各变量对指标(响应值)影响的显著性,由F检验来判定,概率p(F>Fα)的值越小,则相应变量的显著程度越高。
由得率的方差分析(表3)中可以看出模型的p-value小于0.0001,表明该模型方程极显著。各因素中一次项X1、X2、X3、X4是极显著的,二次项X22、X32、X42 也是极显著的,其次是交互项X2X3也是极显著的,由此可见,各具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。由表4可以看出,相关系数R2=0.9249,说明响应值(得率)的变化有92.49%来源于所选变量,即提取温度、提取时间、料水比和提取功率。因此,回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系。
通过软件分析,得到超声提取肉苁蓉多糖的理论最优条件为超声时间:40.44min、超声温度:66.08℃、料液比:1:21.35、超声功率:55.41%,但考虑到实际操作的便利,将肉苁蓉多糖的最佳提取条件工艺修正为超声时间:40min、超声温度:66℃、料液比:1:21、超声功率:55%.得率为36.9274%,总糖含量为36.9274%。
Response1 Yield

表3方差分析
Table 3 Analysis of variance
Source
Sum of Squares
df
Mean Square
F Value
p-value
Prob > F
Model
55.73
14
3.98
23.01
< 0.0001
X1-time
0.078
1
0.078
0.45
0.5118
X2-ultrosoundwave power
2.91
1
2.91
16.82
0.0011
X3-temperature
23.49
1
23.49
135.78
< 0.0001
X4-liquid／material
0.39
1
0.39
2.27
0.1543
X1 X2
2.500E-003
1
2.500E-003
0.014
0.9060
X1 X3
0.73
1
0.73
4.23
0.0590
X1 X4
0.12
1
0.12
0.67
0.4274
X2 X3
1.00
1
1.00
5.78
0.0306
X2 X4
0.011
1
0.011
0.064
0.8044
X3 X4
0.020
1
0.020
0.11
0.7414
X12
2.90
1
2.90
16.77
0.0011
X22
8.90
1
8.90
51.43
< 0.0001
X32
20.35
1
20.35
117.62
< 0.0001
X42
6.21
1
6.21
35.91
< 0.0001
Residual
2.41
14
0.17

Lack of Fit
2.31
10
0.23
5.57

Pure Error
0.11
4
0.027

Cor Total
58.15
28

表4 方程的准确性检验
Table 5 The accuracy of the equation inspection
Std.Dev.
0.42
R-Squared
0.9583
Mean
14.09
Adj R-Squared
0.9167
C.V.%
2.95
Pred R-Squared
0.7679
PRESS
13.5
Adeq Precision
17.831
响应面图形是响应值对各试验因子所构成的三维空间的曲面图,从响应面分析图上可形象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用。当特征值均为正值时,响应面分析图为山谷形曲面,有极小值存在;当特征值为负值时,为山丘曲面,有极大值存在;当特征值有正有负时,为马鞍形曲面,无极值存在[15],根据回归方程得出不同因子的响应面分析图及相应等值线图,结果见图6~11。由图6~11可较为直观地看出各因素对水溶性多糖得率和总糖含量的影响,若曲线越陡峭,则表明该因素对多糖得率和总糖含量的影响越大,相应表现为响应值变化的大小。而由等值线图可以看出存在极值的条件应该在圆心处。

图6 超声时间和和超声功率的响应曲面与等高线
Figure 6　Response surface plot and contour plot of ultrasonic power and ultrasonic time

图7 超声时间和超声温度的响应曲面与等高线
Figure 7 Response surface plot and contour plot of ultrasonic time and ultrasonic temperature

图8 超声时间和液料比的响应曲面与等高线
Figure 8 Response surface plot and contour plot of ultrasonic time and ratio of water to raw material

图9 超声功率和超声温度的响应曲面与等高线
Figure 9 Response surface plot and contour plot of ultrasonic power and ultrasonic temperature

图10 超声时间和超声温度的响应曲面与等高线
Figure 10 Response surface plot and contour plot of ultrasonic power and ratio of water to raw material

图11 超声温度和液料比的响应曲面与等高线
Figure 11 Response surface plot and contour plot of ultrasonic temperature and ratio of water to raw material

3.结论
通过单因素试验设计,以及在此基础上通过四因素三水平响应面法试验,建立了响应值与各因素之间的数学模型,依此模型可以预测理论提取率。根据此二次回归模型,确定肉苁蓉多糖的提取最佳工艺条件为:提取温度66℃、提取时40min、液料比1∶21、提取功率55%,此条件下肉苁蓉多糖得率达36.9274%,样品中多糖含量为36.9274%。
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[18] 玄国东, 刘春泉响应面分析法优化肉苁蓉多糖提取反应的研究 食品科技 2008（02）：159-161

致 谢
首先，感谢西北师范大学，在这里我得到了很好的锻炼和成长。如果没有这四年的学习也就不会有今天这个优秀的我。其次，应该感谢我的导师，感谢张继老师对我细心的关怀和耐心的指导，在实验中为我指点迷津，帮助我开拓研究思路，精心点拨、热忱鼓励。张老师一丝不苟的作风，严谨求实的态度，踏踏实实的精神，不仅授我以文，而且不倦教诲，教我做人，虽历时两载，却给以终生受益无穷之道。
我也非常我的师兄、师姐，还有王叔和杨阿姨，感谢他们热心的帮助以及真诚的鼓励，感谢他们的接纳和照顾，让我真正成为实验室里的一员，也让我度过了一段快乐的时光。
当然，我也很感谢我的班主任和我的同学，四年的陪伴我们是朋友更是亲人，是你们的关怀和鼓励使我勇往直前，也是你们让我懂得了什么团结互助的意义。
最后，感谢我的父母，养育之恩无以回报，唯有以寸草之心报三春之晖；感谢我所有的亲人，你们的关怀是我不断前进的动力。

22

指导教师预评评语

指导教师
张继
职称
研究员
预评成绩

年 月 日
答辩小组评审意见
答辩小组评定成绩

答辩
委员
会终
评意
见
答辩委员会终评成绩

答辩小组组长（签字）：
年 月 日

答辩委员会主任（签章）：
年 月 日