青岛农业大学细胞工程教学计划.doc

绪论
细胞工程(cell engineering)是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的实验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。又称细胞技术，是生物技术的重要内容之一。
生物技术是以生命科学为基础，运用生物体系和工程学原理生产生物制品和发明新物种的一门综合技术。
细胞工程的研究内容：细胞工程基本技术；细胞、组织、器官培养；原生质体培养；细胞融合及培养
生物技术重要涉及：细胞工程、基因工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程和生物化工程。
细胞学说的提出：施旺，施莱登（1838年）
192023H aberlandt提出了细胞全能性学说
细胞工程分类（填空）:植物细胞工程和动物细胞工程
1.细胞工程的应用：（一）、脱毒和快速繁殖 许多植物，特别是无性繁殖植物，带有病毒，并直接传给子代，严重影响产量和质量。一般茎尖生长点不带病毒。所以，运用茎尖培养再生的植株，也许不带病毒，再进行大量繁殖生产脱毒苗。脱毒苗用于生产可明显提高产量、质量和商品价值。甘薯、马铃薯、草莓、果树、花卉等。（二）、细胞工程育种 1. 运用培养变异，筛选优良突变体 植物离体培养，可以明显提高突变率，并且会有各种各样的生理和形态突变，如株高、花色、植株形态、生育期、耐性等等。可以从中选择优良突变体，哺育新品种。2、运用远缘杂交幼胚培养，获得杂种植株，克服其杂交不亲和性。有些植物远缘杂交，能正常受精，但受精胚往往败育。此种情况下，可以将幼胚在败育前进行离体培养，以获得缘远杂种植株。3.运用细胞融合技术，克服远缘杂交不亲和性。
野生种往往有许多优良性状，但大部分野生种与栽培种杂交不亲和，严重影响了野生种优良遗传基因的应用。运用细胞融合，可以克服这种杂交不亲和性，获得体细胞杂种，使野生种的运用成为也许。（三）、离体种质保存随着地球不断开发、生态环境破坏，种质资源日趋枯竭，大量有用基因损失。运用组织培养法，超低温保存（-196℃）或试管保存，为保存和抢救濒临灭绝的生物带来希望。（四）、细胞培养生产有用物质运用细胞培养生产次生物质，如药物、色素、食品添加剂、酶、农药等
2. 细胞工程重要研究内容（1）动植物细胞与组织培养 重要涉及细胞培养、组织培养和器官培养。（2）细胞融合（3）染色体工程：按人们的需要来添加、削减或替换染色体的一种技术。重要用于新品种的哺育。（4）胚胎工程：重要是对动物的胚胎进行某种人为的工程技术操作获得人们所需要的成体动物，涉及胚胎分割、胚胎融合、卵核称植、体外受精、胚胎培养、胚胎移植、性别鉴定、胚胎冷冻技术等。（5）细胞遗传工程：重要涉及克隆和转基因技术。
第一章实验室的设备及其基本操作技术
第一节 实验室的设备
实验室设计最基本应当有三室：准备室、无菌操作室和培养室
第二节 培养基及其配制
1. 培养基的成分及作用
2，一般培养基中的五类物质各有什么作用？1）无机营养成分，涉及大量元素N，P，K，Ga，Mg，S和微量元素Fe, B, Mn, Cu, Co, Zn, Mo等; 2）有机营养成分，常用有机成分：糖类（蔗糖），维生素，肌醇，腺嘌呤，氨基酸。重要采用的是蔗糖，提供处在异养状态的植物组织所需要的碳元素；3）维生素，重要使用的有B1, B6和B5,补充离体状态下细胞内生维生素的局限性，提高细胞的活力；4）激素，涉及生长素、分裂素、脱落酸、赤霉素和乙烯。激素：生长素（根），细胞分裂素（芽），赤霉素（细胞伸长）；5）其他添加物质，例如琼脂作为培养基固化剂、山梨醇作为渗透压调节剂、活性炭作为吸附剂等。
4、蔗糖在培养基中有何作用？作为碳源为植物提供能源，为有机化合物的合成提供碳架，细胞内调节渗透压，对形态的发生的特殊作用等。
11、培养基内加入活性炭的目的是什么？应注意什么问题？
活性碳可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，涉及琼脂中所含的杂质、培养物分泌的酚和醌类物质、蔗糖在高在压消毒时产生的5-羟甲糖醛、激素等。
2.植物激素
5、生长素类物质大体可分为哪几类，目前植物组织培养中重要使用了哪些生长素，生长素在离体培养中有何作用？1.吲哚类，2.奈酸类，3.苯氧羧酸类。植物组织培养中生长素一方面用于诱导愈伤组织的形成和生根，另一方面是与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长以及某些植物胚状体的诱导。
6、在植物组织培养中，细胞分裂素有何作用？
在植物组织培养中细胞分裂素的重要功能是促进细胞的分裂和分化，打破顶端优势，诱导芽分化与增殖，促进组织和器官的不定芽发育。
3.几种常用培养基
基本培养基种类：MS,B5,N6,White(P26)
（1）高盐平衡培养基：MS培养基、LS培养基、BL培养基、BM培养基和ER培养基。特点：无机盐浓度较高，元素间的比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性；营养丰富；微量元素种类全，浓度高。
（2）高硝态氮培养基：B5培养基，N6培养基及SH培养基等。特点：硝酸钾的含量高，氨态氮的含量低，具有较高的盐酸硫胺素。
（3）中盐培养基：H培养基、Nitsch培养基、Miller培养基和Blaydes培养基。特点：大量元素无机盐约为MS的一般，微量元素种类减少而含量增高，维生素种类比MS多。
（4）低盐培养基：White培养基、WS培养基、HE培养基、改良Nitsch培养基及HB培养基等。特点：无机盐含量低，有机成分含量相对也很低。
4. 培养基的配制
1、 生长素和细胞分裂素母液如何制备？生长素类(NAA、IBA等)先用1—2毫升95%酒精将其溶解,然后缓缓加入蒸馏水定容。细胞分裂素类(6—BA、KT等)先用少量(0.5—1当量浓度盐酸),然后缓缓加入蒸馏水定容,倒入瓶内,存于冰箱。如发现贮存后又产生沉淀,可加温使之溶解后再用。赤霉素需过滤灭菌。
2、 简述固体培养基的制备过程。将烧杯放入适量的水（终体积的3/4左右），按大量元素、微量元素、铁盐及有机成分的顺序，依次吸取各母液的需要量。2. 按所需浓度加激素，或其它成分，如AgNO3等。3.  加蔗糖，一般30g/L。4. 定容5、 pH值测定（5.8） 。6.  加琼脂，一般6-8g/L，溶化 （电炉、微波炉等）。7.  分注、封口（铝铂纸、牛皮纸、塑料纸等）。8.   灭菌 121℃，20分。
第三节 无菌操作技术
维持实验室环境相对无菌应采用哪些措施？答：其灭菌方法是通过气体熏蒸和紫外线照射或其他方法。气体熏蒸：熏蒸剂常用甲醛加高锰酸钾，可用每100ml甲醛加5g高锰酸钾为一个使用单位，具体的做法是在每20m2的范围内放置1个单位剂量。注意：为避免其气体对人体的危害并达成较好的消毒效果，一般熏蒸期间应将实验室封闭3~5d。以后在使用过程中，接种室还应定期熏蒸。紫外线照射：用紫外线灯照射0.5h，以保证接种室的无菌环境。其他：实验室每次使用前还可喷洒75%的酒精、过氧乙酸或2%的新洁而灭溶液进行接种室消毒。其他操作室的环境控制可根据情况选用紫外灯定期照射或其他方法
污染的起因涉及四个方面，1）植物材料表面灭菌不彻底或存在有内生菌；2）灭菌设备和无菌操作设备的异常；3）无菌操作技术不规范；4）培养条件不洁净
第四节 外植体的选择与解决
外植体：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。
三种来源：1.生长在自然环境下的植物 2.在温室控制环境条件下生长的植物 3.无菌环境下培养的植物（最优）。
1. 外植体的选择1、选择优良的基因型 实验一方面应明确目的。例如，蔬菜、作物等的脱毒快繁，是为了脱去病毒，提高产量和质量，就应选择本地栽培确认的高产优质的品种作为脱毒材料，并且品种一定要可靠。花卉、欣赏植物的快繁，也应选择有价值的植物。2、取材
从生长旺盛、健壮、无病虫害的植株上取材。母株代谢旺盛期切取的外植体再生能力强，实验容易成功。 3、外植体大小选择 一般0.5-1cm为宜。因外植体不同而不同。如运用茎尖培养，脱毒快繁，外植体宜小，茎尖大小对脱毒效果非常明显。再如幼胚培养，胚龄也非常重要。4、 选择外植体的时期 外植体的生长动态往往与该物种的生长节律（生物钟）有关。因此，最佳在植物生长的最适宜时期取材培养，会得到较好效果。（春天生长旺盛的植株，在春天培养会取得较好效果）
二、外植体的解决
1.取材母株的预解决 人工管理，促使母株生长旺盛、代谢活跃，从其上取材培养，容易成功。2.外植体休眠的解决 有些植物的种子、幼胚或芽，存在休眠。为了打破休眠，可运用低温解决，或赤霉素等化学物质解决因植物不同解决温度和时间有所不同。3、 外植体的灭菌 大田或温室植物材料，都带有大量的细菌和真菌，这是组织培养的一大障碍，所以材料必须进行杀菌消毒（表面杀菌）。
外植体消毒方法：取材后 →将老的组织去掉 → 自来水冲洗 → 洗衣粉水洗（简朴杀菌） →自来水冲洗 → （超净工作台）70%酒精解决 → 消毒剂解决 → 灭菌蒸馏水冲洗3-5遍。
消毒剂种类有很多，如次氯酸钠（效果应当比较好，无毒、无污染，见光氧化，影响杀菌效果）、升汞（效果应当比较好）、漂白粉、高锰酸钾、双氧水、福尔马林等。一般多用0.1%升汞。杀毒时间：一般酒精10秒，升汞5-12分钟。
升汞解决方法：升汞+NaS → 絮状沉淀（至絮状沉淀不再产生为止）→ + FeSO4 (中和过多的NaS)。
第五节 培养条件
植物离体培养的环境条件及其对培养的影响：温度大多数在20-30℃之间，通常控制在25±2℃的恒温条件下培养；一般光照12-16h,光强1000-5000lux。；因此需要通风。一般培养容器使用棉塞、铝箔、专用盖等封口，容器内外空气是流通的。；湿度过高过低都不利于培养物生长。室内相对湿度70-80％。
3、离体培养过程中人工光照的设立有何规律？在培养初期、对于大多数培养类型来讲只需要散射光或弱光照或黑暗条件下。当外植体细胞启动分裂后或进入分化培养阶段，则需要根据植物类型增强光照
第二章 细胞全能性
第一节 培养细胞展现生命特性属性
1，植物细胞全能性的概念及其意义：植物细胞工程的基础理论是植物细胞的全能性理论，即每每个植物的体细胞或性细胞都具有该植物的全套遗基因，并在条件合适的情况下可以发挥该物种的各种功能和具有发育成为一个正常和完整的独立个体的能力。根据这一理论，组织培养技术通过发明各种合适的培养条件，促使细胞或组织发挥某一功能（例如合成药物）或生长发育成完整的个体以达成特定的某种目的（例如快速繁殖植物种苗）。
2.生命特性属性：新陈代谢、应激性、自我复制
细胞脱分化（cell dedifferentiation ）：（定义）培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化。静止细胞启动分裂是分化细胞成功脱分化的重要标志。蛋白体的出现和细胞质密度增长被认为是细胞开始脱分化的标志。
细胞分化（Differentiation）：（定义）是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。
极性（polarity）：（定义）是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。
玻璃化：植物组织培养中分化出半透明的畸形试管植株（玻璃化苗）的现象，称为玻璃化现象。
褐变：外植体在脱分化和再分化过程中，分泌褐色物质使培养基和外植体自身变褐的现象。
分化细胞的脱分化需要两个条件：创伤和外源激素。
简述植物细胞脱分化的过程启动阶段：蛋白体的出现和细胞质增生；演变阶段：细胞核移向中央、质体转化成原质体；脱分化终结期：回复到分生细胞状态，细胞开始分裂
影响植物细胞脱分化和再分化的因子：重要涉及内因和外因两个方面。内因重要指植物的遗传特性和生理状态。外因重要涉及植物细胞营养条件（无机营养、有机营养、植物激素、天然提取物等）和环境条件（渗透压、酸碱度、温度、湿度、光照等）
8、愈伤组织: 在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在外植体切面上产生。实质上是一团无序生长的细胞，这些细胞大多处在随机分裂的状态。
3. 细胞分化和组织分化4. 器官分化和植株形成
器官发生方式：1）先芽后根：先分化芽，芽形成后，在芽的基部长出根进而形成完整植株。2）先根后芽：先分化根，再在根上产生不定芽进而形成完整植株。3）在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。
36、培养条件下，植物细胞通过再分化形成完整个体有哪两种途径？试比较这两种途径。

器官发生途径
胚胎发生途径
实现方式
愈伤组织诱导形态发生和胚状体发育两种途径
体细胞胚发生途径
植株类型
双子叶植物，如茄科、菊科、十字花科及豆科的一部分种等
多数集中于禾本科、伞形科、芸香科、葫芦科、豆科的一部分种特别是豆科牧草和裸子植物中的松科
注意事项
愈伤组织诱导形态发生是与适量激素和合适培养基密切相关的
培养过程中需通过超低温保存技术保存胚性瘀伤组织或定期重新建立胚性悬浮培养细胞，且应尽也许缩短每个环节的所需时间，是保持分化的有效措施

第三章 植物组织器官培养
第一节 植物组织培养及器官形成
1. 植物组织培养的意义
植物组织培养：指在无菌条件下，将离体的植物器官（如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等）、组织（如胚乳、皮层等）、细胞（体细胞、生殖细胞等）、胚胎（成熟和未成熟的胚）、原生质体等培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，诱导产生愈伤组织或完整植株的实验技术。
继代培养：外植体在培养基上培养一段时间后，营养物质枯竭、水分散失，并且积累一些代谢产物，需将培养物转到新的培养基上继续培养，这种转移称为继代培养或传代培养。
拟分生组织：是指培养物中出现的类似分生组织的细胞群，它是脱分化后的培养物发生一系列细胞分裂而产生的一团小型、薄壁、液泡小的细胞组织。也叫做生长中心或分生组织结节。
植物组织培养的基本环节：（1）培养材料的采集l（2）培养材料的消毒解决（3）制备外植体（4）接种和培养（5）生根培养l（6）炼苗和移栽
l植物快速繁殖技术在园艺和农业生产中具有广泛的用途，重要有以下几个方面：（1）克服高度杂合物种因有性繁殖而引起的后代严重分离。（2）名优植物或濒危植物的快速繁殖。（3）无病毒苗木生产。4）单独繁殖雌株或雄株。（5）种质资源保存。
适合进行组培快繁的植物有哪些？ 1）,通过脱毒后繁殖成为不带病毒（virus free）的植株,由此而使生产力得到大幅度的提高,例如马铃薯,香蕉;2）,有性繁殖时变异幅度大的品系,可以从这些群体中选择优良的个体,进行无性繁殖,生产出整齐划一的大量种苗;果树,兰花;3）,雌雄异株植物的繁殖,通过快速繁殖技术繁殖具有更高栽培价值的雌性植株或雄性植株,如芦笋； 4）,需要用目的产品作为种苗材料进行种植的物种;如大蒜,甘蔗等； 5）,稀有、濒危植物种； 6）,自然繁殖率低的新品种，涉及新引进的品种;
离体培养条件下，茎、芽和根的再生方式大体有几种在组织培养中，通过茎芽和根而再生植株的方式大体有3种：1.先芽后根：多数植物；2.先根后芽：颠茄；3.在不同部位分别形成芽和根，最后通过微管组织联系形成再生植株。
简述器官发生的过程1.愈伤组织诱导，2.“生长中心”形成，3. 器官原基和器官形成
影响器官发生的因素有哪些？
（1）外植体：母体植株的遗传基础与生理状态，（2）激素(激素调控理论)，（3）培养基种类和培养方法（物理因素，化学因素），（4）环境条件（温度，光照）
第二节 体细胞胚胎发生
1. 体细胞胚胎发生的途径及类型2. 体细胞胚胎发生的机制3. 影响体细胞胚胎发生的因素
8、影响体细胞胚发生的因素有哪些？（1）、外源激素：生长素特别是2，4-D；（2）培养基：低无机盐浓度和较高的硝态氮浓度；（3）基因型；（4）组织起源，距活体胚胎发育较近的组织和成熟及未成熟的胚胎在离体条件下更有助于细胞胚的诱导。
体细胞胚或胚状体（定义）：离体培养下没有通过受精过程，但通过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。
体细胞胚胎发生: 指体细胞在未经性细胞融合的情况下，模拟有性胚胎发生的各个阶段而发育出新个体的形态发生过程。
胚性发育：幼胚接种到培养基上以后，仍然按照在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚(有时甚至也许类似种子)，然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株
离体胚培养：胚培养就是采用人工的方法将胚从种子中分离出来，在人工培养的条件下，使其他发育成正常植株。
九．体细胞胚的形成途径：（简答）1. 体细胞胚从外植体上直接发生：诱导阶段;胚胎发育阶段2. 间接发生：A.通过愈伤组织的体细胞胚的形成：诱导愈伤组织的形成→诱导愈伤组织胚性化→体细胞胚的形成 B.通过悬浮细胞的体细胞胚的形成：诱导愈伤组织的形成→诱导愈伤组织胚性化→悬浮培养的胚性细胞团→体细胞胚的形成。
l影响胚状体发生和发育的因素l（1）供体植物的基因型（2）外植体的来源和培养物的生理状况（3）与胚状体发生相关的基因表达（4）培养基中外源激素（5）培养基的氮源（6）天然提取物和活性碳对胚状体形成的作用

胚状体的发育大约要通过哪几个时期?体细胞胚的大多一方面起源于一个胚性细胞，胚性细胞通过一次分裂形成二细胞原胚，最后通过球性胚、鱼雷形胚、心形胚和子叶形胚形成胚状体。
14、离体培养条件下，胚状体产生有几种方式?
（1）直接途径：即不通过愈伤组织阶段，从外植体直接产生体细胞胚； （2）间接方式：外植体一方面诱导产生愈伤组织，再在愈伤组织上产生体细胞胚。
第三节 幼胚培养
1. 幼胚培养的意义离体胚胎培养可以克服种、属间受精障碍，克服杂交后胚的衰亡，保证种内或种间杂交的成功，或用于无性繁殖困难的植物的培养。胚培养还可以打破种子休眠，缩短育种周期，克服种子生活力低下和自然不育等，对于植物界物种进化具有极其重要的意义。
2. 幼胚培养时胚的发育方式有哪几种？各有什么特点？
答：幼胚培养常见的生长方式有3种：胚性发育 特点：形成成熟胚。一般一个幼胚将来就是一个植株。早熟萌发 特点：可出现丛生胚现象。愈伤组织 特点：大多为胚性愈伤组织，易分化成植株。胚性愈伤组织是很好的遗传受体和分离原生质体的来源
根据在培养中所取的外植体的部位不同，植物胚胎培养涉及：胚培养，胚乳培养，胚珠培养，子房培养。
3. 幼胚培养方法l
关键技术是幼胚剥离：需借助解剖镜，且注意保湿，和操作迅速。幼胚培养的关键技术：取材时期：多为球形胚至鱼雷形胚阶段。
体细胞胚与合子胚有何异同？
界定：1）体细胞胚是离体培养的产物，只限于离体培养范围使用，以区别于无融合生殖胚2）体细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚。3）体细胞通过了胚胎发育过程，以区别于离体培养中器官发生形成个体的途径。

合子胚
体细胞胚
生殖类型
有性
无性
细胞来源
性细胞
体细胞

均通过最初的胚性细胞不均等分裂以及以后的
球形期、心形期、鱼雷期等重要发育时期
形态结构
胚柄
有、明显
无真正胚柄
子叶
规范
不规范
胚体积
大
小
生理生化特性
贮藏物
高
低
含水量
低
高
休眠
有
无

第四节 花药、花粉培养
花药培养（定义）：把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上，使其发育和分化成为植株的过程。
花粉培养（定义）：又叫小孢子培养，是从花药中分离除花粉粒，使之成为分散的或游离的状态，通过培养使花粉粒脱分化，进而发育成完整植株的过程。花粉培养属于细胞培养的范畴。
花粉培养取材时期：四分体 小孢子时期；
花药培养取材时期：单核晚期，双核初期。
六．花药培养的基本程序：外植体选择—外植体预解决—外植体消毒—剥取花药—接种—诱导培养—分化培养。
1. 花药、花粉培养的意义
单倍体在植物遗传育种中的应用（1）控制杂种分离，缩短育种周期2）提高常规育种的选择效率（3）单倍体是诱变育种的良好材料
2. 花药、花粉培养再生途径
诱导单倍体的途径（1）孤雌生殖（2）孤雄生殖（3）无融合生殖（4）体细胞减数分裂
3. 影响花药、花粉培养的因素
4. 花药培养方法
花药培养的程序大体如下：（1） 从植株上取花粉单核期的花蕾或幼穗；l（2） 在保湿条件下低温预解决；（3） 对花药进行表面消毒；（4） 接种到培养基上，在适宜温度下进行培养；（5） 将花粉胚或花粉愈伤组织转入再生培养基中，进行植株再生培养；（6） 花粉植株的染色体加倍（在试管苗阶段或移栽成活后）；（7） 花粉植株移栽。
5. 游离花粉粒培养方法
七．花粉分离方法：1）机械分离法：将花药置于盛有少量液体培养基或与培养基等渗的蔗糖溶液的培养皿中，用平头的玻璃棒或注射器内管轻轻挤压花药，使其散出花粉。（2）花药漂浮培养自然释放法：将通过一定期间低温解决的花药，接种于液体培养基中，培养数天后，花药开裂，释放出花粉粒。（3）磁拌法:将花药接种于具有液体培养基的三角瓶中，然后放入一根磁棒，置于磁力搅拌器上，低速转至花药呈透明状。
通过离体培养获得单倍体的途径有哪些？助细胞或胚囊的无配子生殖产生单倍体；卵细胞、助细胞和反足细胞发育成单倍体；非正常发育的大孢子四分体产生单倍体；通过子房或花药培养得到单倍体
花药培养中再生植株的形成途径与再生植株倍性有何关系？
答：花药通过两种途径再生：一是由花药诱导形成的胚状体途径；二是花药愈伤组织途径。
通过胚状体途径产生的花粉植株几乎全是单倍体，而经愈伤组织产生的花粉植株中有不少是二倍体，并且愈伤组织继代培养时间愈长，二倍体的比例愈高。
第五节 人工种子
1. 人工种子的定义2. 人工种子的优越性与局限性3. 人工种子的制作
人工种子具有以下几个特点：（1） 具有发育良好的体细胞胚，并能发育成正常的完整植株。（2） 具有人工胚乳可提供种胚发育的营养。（3）具有能起到保护作用的人工种皮。
用于制备人工种子的繁殖体重要有哪些？答：重要有体细胞胚、微型营养变态器官和芽繁殖体
一．人工种子（artificial seeds）：将植物组织培养产生的胚状体包裹上用有机化合物和营养物质制作的人工种皮，具有形成完整植株能力的繁殖体。
根据包被的限度可将人工种子分为三大类：裸露的或休眠的繁殖体、人工种皮包被的繁殖体、水凝胶包埋再包被的繁殖体。
二．繁殖体的种类及其培养技术：体细胞胚、微型变态器官、微芽。
三．人工种子由以下三部分组成：繁殖体，人工胚乳，人工种皮。
四．包埋介质的规定：1、要能对繁殖体起保护作用，要对繁殖体没有毒害。2、规定具有一定的缓冲强度，以保证繁殖体在生产、运送和种植操作中的安全。3、可以提供类似于胚乳的营养物质以供繁殖体发芽的需要。4、应具有适当的杀菌剂。
五．抱负的人工种皮：1具有一定的封闭性以保证人工胚乳的各种成分不易流失；2具有良好的透气性，以保证繁殖体维持生理活性的需要；3有一定的坚硬度，以加强人工种子的耐储运性和适于机械化操作；4无毒无害，能保证繁殖体顺利穿透发芽。
第四章 茎尖分生组织培养
第一节 茎尖分生组织培养的目的和应用
1. 形态建成研究2. 无病株的生产3. 营养繁殖4. 育种中的应用
第二节 脱毒苗的哺育
1. 病毒的危害及哺育无毒苗的意义2. 病毒侵染的特点3. 热解决脱毒4. 茎尖培养脱毒5. 热解决结合茎尖培养脱毒6. 脱毒苗在生产中的应用7. 几种重要植物的脱毒苗生产技术
一．植物脱毒：运用植物组织培养技术脱出植物细胞中侵染的病毒，生产健康的繁殖材料。
二．脱毒 基本原理：病毒在植物体内的分布具有不均匀性。
三．脱毒苗制备流程：索取材料的病毒检测 外植体的选择及预解决 茎尖分生组织培养再生植株 脱毒效果检测 脱毒苗的保存与繁殖
四．（填空、简答）培养物的增殖方式：1.腋芽增殖2. 不定芽增殖3. 体细胞胚增殖4. 愈伤组织增殖
19. 为什么茎尖分生组织培养可以除去植物病毒？
答：由于病毒重要通过维管束和胞间连丝传播，在植物茎尖分生组织无维管束，且胞间连丝不发达，病毒运转速度慢；加之分生组织内细胞分裂和生长速度快，病毒扩散的速度赶不上细胞分裂和生长速度，所以茎尖生长点病毒数量很少，几乎检测不出。

12、为什么茎尖分生组织培养可以可以除去植物病毒？
答：因素：
病毒在植物体内的分布不均匀性，在分生组织中不带或很少带有病毒。
其中证明病毒的分布不均匀性的假说：能量竞争、转导克制、激素克制、酶缺少、克制因子
13、哪些因素影响茎尖培养的脱毒效果？
答：影响因素：1.母体材料病毒侵染的限度：单一病毒感染的植株脱毒较容易。2.起始培养的茎尖大小：一般不带叶原基的生长点培养脱毒效果最佳3.外植体的生理状态：顶芽的脱毒效果比侧芽好，生长旺盛季节的芽为外植体脱毒比休眠体芽或快进入休眠的芽的脱毒效果好。
32、如何检测再生植株的脱毒效果？
答：再生植株后，一般在18个月以内进行病毒鉴定，由于病毒的潜伏期一般为6~12个月以上。通过指示植物鉴定和血清学鉴定及其他方法鉴定：1.指示植物鉴定法：常用指示植物有：千日红、曼陀罗和心叶烟。将待测植物的汁液接种到指示植物上，假如被测植株带毒，则指示植物会出现特定症状。2.血清法：可分为试管沉淀法（抗原-抗体沉淀反映）、免疫双扩散（同左）、酶联免疫吸附测验（抗原-抗体反映及酶的催化反映结合）
电镜检测技术：分汁液提取染色、免疫吸附电镜、病毒粒子修饰等；3.核酸杂交 e）聚合酶链式反映
3、指示植物：具有可以辨别某种病毒专化性状的寄生植物
第五章 原生质体培养与细胞融合
第一节 原生质体分离与培养
1. 原生质体培养的意义2. 原生质体培养的发展历史3. 原生质体的分离4. 原生质体培养
原生质体（protoplast）是指除去细胞壁的裸细胞;是体细胞杂交育种的材料是转基因的良好受体;是开展基础理论研究的良好材料;是分离细胞器的良好材料
2．简述酶法分离植物原生质体的基本原理。
植物细胞壁由纤维素，半纤维素，果胶质等组成，通过用酶把原生质体外的细胞壁分解，便能得到完整的原生质体。
原生质体纯化有哪些方法？（填空、简答）
答：方法有：沉降法：在酶解解决中用相对分子质量较小的甘露醇作为渗透压调节剂时，将收集的滤液低速离心，使原生质体沉降于管底。漂浮法：在酶解解决中用相对分子质量较大的蔗糖作为渗透压调节剂时，将收集的滤液于1000r/m的转速下离心10min，原生质体将漂浮于溶液表面，细胞碎片等杂质将下沉到管底。界面法：运用比重不同的溶液，通过离心后使完整无损的原生质体处在两液相的界面之间，而细胞碎片等杂质则下沉到管底。
原生质体的培养方法有哪些？各有何优缺陷？

优点
缺陷
液体浅层培养法
操作简便，对原生质体的伤害较小，通气性好，代谢物易扩散，易于补充新鲜培养基，形成细胞团或小愈伤组织后易于转移。
原生质体在培养基中分布不均匀，经常发生原生质体之间的黏连现象，或导致局部原生质体的密度过高，从而影响了原生质体再生细胞的进一步生长发育，并且难以定点观测和跟踪单个原生质体的生长发育过程
悬滴培养法
所需材料少，生长快，容易添加新鲜培养基，不易污染，并且由于微滴的体积小，在一个培养基中可以做很多种培养基的对照实验，有助于原生质体的低密度培养
原生质体分布不均匀，容易集中在小微中央。此外由于微滴与空气的接触面积大，水分容易蒸发而导致培养基成分浓度变高。
微滴培养法
可用倒置显微镜观测原生质体的发育过程，易于添加新鲜培养基，可用于较多组合的实验或进行融合体及单个原生质体的培养
与悬浮培养法相似，原生质体易于聚集在小滴的中央，微滴容易挥发。
固体培养法
原生质体被彼此分开并固定了位置，可以避免细胞间有害代谢产物的影响，并便于定点观测，有助于跟踪观测单个原生质体发育过程，易于记录原生质体的分裂频率和植板率
对操作规定较严格，在原生质体悬浮液与琼脂或琼脂糖培养基混合时温度必须合适，太高会影响活力，太低培养基凝固太快使原生质体分布不均匀，并且原生质体的生长发育比液体浅层法要慢。
液体浅层-固体平板双层培养法
优点：固体培养基中营养成分可以缓慢地释放到液体培养基中，以补充培养物对营养的消耗，产生的一些有害物质可被固体培养基吸取，有助于培养物的生长。在下层固体培养基中假如添加一定量的活性碳，可有效地吸附培养物产生的有害物质，促进原生质体的分裂及细胞团的形成
琼脂糖珠培养法
优点：通气性好
饲养层培养法
优点：可提高原生质体的植板率

第二节 细胞融合与培养
1. 细胞融合的意义2. 细胞融合的方法3. 培养方法4. 杂种细胞的选择5. 体细胞杂种鉴定
四．原生质体活力测定方法：（P114）
1.形态辨认法 2.荧光素双醋酸酯（FDA）染色法：有活力的原生质体产生绿色荧光。3.酚藏花红染色法：有活力的原生质体不能被染色。4、荧光增白剂染色法：有活力的原生质体随着细胞壁的再生产生绿色荧光。5、伊凡蓝染色法：有活力的原生质体不能被染色。
※五．植物体细胞杂交：又称为原生质体融合，是指将植物不同种、属、甚至科间的原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。
植物细胞杂交的类型：1）体细胞杂交2）体细胞-配子杂交3）配子间细胞杂交4）微细胞杂交
原生质体融合的种类（完整限度）：1）对称融合 2）非对称融合
※六．原生质体的融合方法之一: PEG诱导融合法
1）特点：优点是成本低；融合子产生的异核率高；不受物种限制。缺陷是融合过程繁琐，PEG对细胞有毒害。
2）作用机理：PEG分子具有轻微的负极性，可与带正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，在原生质体之间形成分子桥，使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合；PEG还鞥增长类脂膜的流动性，使原生质体的核、细胞器发生融合成为也许。
七．原生质体的融合方法之二：电融合的基本过程
细胞膜的接触：原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，使原生质体紧密接触排列成串。
膜的击穿：给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。
优点：1）不存在对细胞的毒害问题2）融合效率高3）融合技术操作简便
八．（填空）原生质体的融合产物：异核体（核未融合）、 同核体（同一亲本融合 AA）、 未发生融合的双亲原生质体。
30、体细胞杂交和原生质体融合有哪些类型？其产物和再生个体有何特点？
答：细胞杂交类型有：体细胞-体细胞杂交、配子-体细胞杂交、配子间杂交、微细胞杂交
原生质体融合有：对称融合、非对称融合（A细胞核+B细胞质、A完整细胞+B细胞质、A完整细胞+B细胞质和部分核物质）其产物和再生个体特点：对种质资源的开发和运用品有深远的意义；克服了远缘杂交不亲和；产生了新的核外遗传系统
33、使细胞核失活的途径有哪些？
答：使细胞核失活的方法有物理和化学方法：物理方法：常用射线解决，如X射线、γ射线等；化学方法：常用试剂有碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸
5、试述PEG融合法和电融合法的基本原理。
答：PEG融合法的基本原理：原生质体融合一方面必须使两个原生质体紧密接触，质膜之间的距离要小于10Å。由于PEG分子有带负电荷的醚键，具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成氢键，在原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生黏连。当用高Ca2+和高PH溶液清洗后，Ca2+和PEG被清洗掉，打破了电荷平衡，使原生质体某些正电荷与另一些原生质体和负电荷连接起来，进而促使原生质体的融合。此外，PEG能增长类似脂膜的流动性，这也是原生质体的核和细胞器发生融合成为也许。
电融合法的基本原理：根据原生质体的融合过程设计的，实质上它是借助于电场和电脉冲的作用来加速原生质体的融合过程，即给予了原生质体融合一个更有利的外部条件。融合程序涉及细胞膜的接触和膜的击穿
原生质体是去掉细胞壁的单细胞，它是在离体培养条件下可以再生完整植株的最小单位。每个原生质体都具有该个体的所有遗传信息，在适宜的培养条件下，具有再生成与其亲本相似的个体的全能性。原生质培养（Protoplast culture）的重要目的是通过原生质体的融合，克服远缘杂交障碍，实现体细胞杂交（Somatic hybridization），从而产生杂交后代。
原生质体的分离（1）机械分离方法（2）酶解分离法影响原生质体活力的因素
滋养培养是运用可以分泌生物活性物质的细胞或组织培养物作为滋养者，来促进原生质体的分裂和生长。
影响原生质体培养的因素l（1）原生体的活力 （2）原生质体密度 （3）细胞壁再生速度 （4）培养条件
原生质体融合与体细胞杂交：两种异源原生质体在诱导剂诱导下互相接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合，并形成杂种细胞的过程称为细胞融合，或细胞杂交。假如融合的细胞为体细胞则称体细胞杂交。l细胞融合具有重要意义，它可克服种、属以上植物有性杂交不亲和性障碍，实现远缘杂交，为广泛重组遗传物质开辟新途径。
l原生质体融合：（1）自发融合（2）诱发融合1）NaNO3诱导融合3）高pH高钙离子诱导融合3)聚乙二醇（PEG）诱导融合4）PEG与高pH、高钙离子相结合的融合法5）电击融合
体细胞杂交技术在农业生产中的应用（1）体细胞杂交合成新物种（2）体细胞杂交可哺育抗病新品种（3）胞质杂种在育种上的应用
具有一个亲本细胞核和两个亲本细胞质的体细胞杂种称为胞质杂种。不对称融合的供体—受体系统，使得一个亲本的原生质体的细胞核失活（细胞质供体），另一个亲本的原生质体细胞质的线粒体失活（细胞质受体）。
、哪些因素会影响原生质体培养？答：影响因素有：浓度：激素的浓度、无机盐的浓度、有机成分的浓度；渗透压；营养成分完全性；培养基的条件： PH、激素等；培养条件：光照、温度
6、非对称融合：运用物理或化学的方法使亲本的核或细胞质失活后再进行融合
第六章 体细胞无性系变异
1. 培养细胞变异的类型2. 影响体细胞无性系变异的因素3. 植株再生的调控4. 优良变异系的筛选方法5. 体细胞无性系变异的应用
6、体细胞无性系变异：植物的组织、细胞、原生质体在离体培养的条件下所得的培养物及再生植株的变异叫体细胞
8、离体培养物的遗传与变异有何特点？
答：特点：遗传稳定性：一般有较高的遗传稳定性；变异的普遍性：各种植物离体培养中变异普遍发生变异局限性变异的嵌合性：同一个有机体重同时存在有遗传组成不同的细胞。
一．体细胞无性系：由任何形式的细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系。
体细胞无性系变异：由体细胞无性系表现出来的变异。
从对生物遗传的影响而言，细胞工程技术自身即包含了双重性：遗传稳定性和变异性。
二．离体培养中的遗传与变异特点：遗传稳定性；变异的普遍性；变异的局限性；嵌合性
8，细胞无性突变筛选育种有哪些优缺陷？优点有：1）变异广泛 各种性状都也许发生变异，但变异并不完全随机：有些性状的变异频率比较高，有些变异导致个体死亡而无法表达，多数变异（DNA分子的变异）并不表达或表达方式和水平难以察觉。2）后代稳定快 多数变异是单基因变异：显性变异可以直接选择运用；隐性变异可以通过1次自交纯合，得到表现。3）可与辐射和其他化学诱变相结合 通过多种方法的结合也许显著提高离体细胞的变异频率。离体培养细胞的辐射诱变效果比个体水平的辐射的效果要好，其中最重要的是嵌合现象比较少，特别是通过胚胎再生途径的情况更是如此。4）特别适合进行抗性突变体的筛选 可以通过在培养基中添加筛选剂而简朴地对上百万个细胞进行有效的筛选。缺陷有：1），自发突变和诱发突变的随机性，即难以进行定向诱变；2），某些基因高度稳定，即某些性状不会发生突变；3），多