微生物基因组学专家讲座.pptx

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aquaticus,)3,、罗氏制药,DNA,自动测序仪发展,AppliedBiosystems,美国应用生物系统企业,生物信息学分析软硬件设施,微生物基因组学专家讲座,第4页,DNA,测序有几个方法，但到当前为止最惯用,是,20,世纪,70,年代中期创造链终止（,Sanger,法）,Sanger is the only chemist to have received two Nobel Prizes in Chemistry,the first as the sole recipient in 1958 for his work on insulin,and the second in 1980,shared with Paul Berg and Walter Gilbert,for the sequencing of nucleic acids.,微生物基因组学专家讲座,第5页,“,双脱氧末端终止”含义,微生物基因组学专家讲座,第6页,Sanger,双脱氧末端终止法测序原理,微生物基因组学专家讲座,第7页,自动化测序,荧光染料标识物创造：,使链终止法用于自动化测序，用不一样荧光色彩标识,ddNTP,如,ddATP,标识红色荧光，,ddCTP,标识蓝色荧光，,ddGTP,标识黄色荧光，,ddTTP,标识绿色荧光。因为每种,ddNTP,带有各自特定荧光颜色，而简化为由,1,个泳道同时判读,4,种碱基。,微生物基因组学专家讲座,第8页,微生物基因组学专家讲座,第9页,微生物基因组学专家讲座,第10页,第一代测序技术：,Sanger,等创造双脱氧核苷酸末端终止法和,Gilbert,等创造化学降解法。,第二代测序技术,循环阵列合成测序法,第三代测序技术,（单分子测序，直接测序）,近期出现,Helicos,企业,Heliscope,单分子测序仪、,Pacific Biosciences,企业,SMRT,技术和,Oxford Nanopore Technologies,企业正在研究,纳米孔单分子技术,，被认为是第三代测序技术。,测序技术展望,非光学显微镜成像：将核苷酸空间线性排列方式可视化。,微生物基因组学专家讲座,第11页,美国,X,奖基金会,年,10,月,4,日宣告设置一项金额高达,1000,万美元,奖金，激励科学家“多快好省”地绘制出人类基因图谱。,规则：在,30,天内以高准确度测序,100,个百岁老人基因组样本，并覆盖,98%,基因组，每个基因组测序费用控制在,1000,美元,或以下。,微生物基因组学专家讲座,第12页,微生物基因组测序策略,1.,随机测序法 即不考虑方向性，随机对靶,DNA,进行测序，最终采取计算机拼装而得到完整序列信息。该方法又包含两种方法。,鸟枪法 它包含有三种消化法,限制性内切酶消化法超声波处理法胰,DNA,酶消化法,微生物基因组学专家讲座,第13页,人工转座子法,转座子是含有跳跃功效,DNA,元件，是细菌或酵母染色体上特定基因区，利用转座酶可使转座子随机插入靶,DNA,。,优点：,一次体外反应即可形成大量转座子插入。,能够在其上加入更有利于,DNA,测序（或制图）基因元件。,人工合成转座子两头带有特殊引物位点，所以插入位点两侧序列可有效快速地得以确定。,微生物基因组学专家讲座,第14页,一段,DNA,次序能够从原位上单独复制或断裂下来，环化后插入另一位点，并对其后基因起调控作用，此过程称,转座,。,转座子,(transposons),在原核生物与真核生物基因组中存在着可从一个染色体位点转移到另一位点一些,DNA,序列。（文件上有时形象地称其为是跳跃基因，,jumping gene,）。,微生物基因组学专家讲座,第15页,1951.Barbara McClintock,提出转作和跳跃基因概念,DNA,1967,年,Shapiro,才在,E.coli,中发觉了转座因子,微生物基因组学专家讲座,第16页,微生物基因组学专家讲座,第17页,2.,定向测序法,是指特定地从目标片段某一端开始测序，直至把靶片段测完。定向测序法包含引物测序法和定向缺失测序法。,引物测序法,即在第一次测序结果基础上，设计新寡核苷酸，来充当下一次测序反应引物，并依次类推，从而循序渐进取得靶,DNA,全部序列。,微生物基因组学专家讲座,第18页,定向缺失法,定向缺失法是将一个靶,DNA,变成若干套嵌套缺失突变体，使靶序列中远不可测区段逐步落入可用通用引物进行测序方法。,微生物基因组学专家讲座,第19页,微生物基因组学专家讲座,第20页,作图法测序与序列组装,微生物基因组学专家讲座,第21页,两种大规模基因组测序策略比较,项 目,策 略,全基因组霰弹法,逐步克隆法,遗传背景,不需要,需要（需构建准确物理图谱）,速度,快,慢,费用,低,高,计算机性能,高（以全基因组为单位进行拼接）,低（以,BAC,为单位进行拼接）,适用范围,工作框架图,精细图,代表测序物种,果蝇、水稻,人、线虫,微生物基因组学专家讲座,第22页,23,当前惯用人造染色体载体,细菌人工染色体载体（,BAC,）,酵母人工染色体载体（,YAC,）,黏粒载体（,cosmid,）,P1,人工染色体载体（,PAC,）,微生物基因组学专家讲座,第23页,pYAC4,CEN4,EcoRI,URA3,TEL,BamHI,TEL,ori,Ap,r,TRP1,ARS1,YAC,载体复制元件和标志基因,YAC,载体应含有以下元件：,酵母染色体端粒序列,酵母染色体复制子,酵母染色体着丝粒序列,酵母系统选择标识,大肠杆菌复制子标识,YAC,载体装载量为,250-400 kb,微生物基因组学专家讲座,第24页,酵母人工染色体（,Yeast artificial chromosomes,简称,YAC,），是一个能够克隆长达,400Kb,DNA,片段载体，含有酵母细胞中必需端粒、着丝点和复制起始序列。,微生物基因组学专家讲座,第25页,细菌人工染色体（,Bacterial artificial chromosome,，,BAC,）是指一个以,F,质粒（,F-plasmid,）为基础建构而成细菌染色体克隆载体，惯用来克隆,150kb,左右大小,DNA,片段，最多可保留,300kb,个碱基对。,微生物基因组学专家讲座,第26页,（四）影响测序原因,不论采取随机测序还是定向测序都可碰到以下影响原因。,1.,计算机设备。,2.,靶,DNA,性质。,3.,完成测序所需时间。,4.,采取测序策略。,微生物基因组学专家讲座,第27页,三微生物基因组注释,（一）概念：在微生物基因测序基础上，对其基本结构和部件进行认定，以深入研究其功效。,微生物基因组学专家讲座,第28页,（二）微生物基因组注释内容,1.,碱基组成份析，即,G+C Mol%,测定。,G+C,含量是物种一个主要特征，在微生物分类上含有主要意义，是主要参数之一。,2,开放阅读框判定：,3,编码序列分析,微生物基因组学专家讲座,第29页,4.tRNA,基因检索：依据特异三叶草结构来判定，可采取专门分析软件。,5.rRNA,基因检索：利用现有已知,16srRNA,序列来判定基因组含,rRNA,基因。,6.,特殊序列检索,7.,复制原点判定,（,1,）判定目标 复制原点即微生物基因组,1,号碱基位置。,（,2,）判定原理 复制原点有其特殊结构。如,E.coli,复制原点为为一段,245,个,bp,序列，其中包含有四个核苷酸,9,聚体,“,TTATCCACT,”,。,（,3,）判定方法 可采取特殊分析软件。,微生物基因组学专家讲座,第30页,微生物基因组学专家讲座,第31页,8.,同源性基因检索,（,1,）目标 对每一未知基因均进行同源性搜索以确定其基因初步特征。,（,2,）搜索原理 依据其结构、排列同源性。,（,3,）搜索方法 采取美国,BLAST,软件。,微生物基因组学专家讲座,第32页,四微生物基因组图谱,微生物基因组图谱主要包含两种，即遗传图谱和物理图谱。,(,一,),遗传图谱,1.,概念 是经过突变表型判定出来其基因组上一系列基因图，包含各个基因在基因组中排列次序和准确定位。,微生物基因组学专家讲座,第33页,2.,建立基因遗传图谱方法,(1),中止杂交法 即将两个菌株共同培养,并每隔一段时间中止培养,以判定其基因型,并以判定一些基因转化次序和位置。,(2),噬菌体转导试验,PI,噬菌体是普遍性转导噬菌体。它可在供体菌DNA,断裂时，误将,DNA,片段包装于本身而带入受体菌基因组中，并形成稳定转导子。也可将紧密联锁几个基因也转导过去（此为共转导）。,微生物基因组学专家讲座,第34页,（二）物理图谱,1,物理图谱概念：是在,DNA,分子上指出限制性内切酶限制性位点、数目及其限制性片段大小与排列次序图谱，又叫限制性图谱。,2,构建微生物基因物理图谱意义,（,1,）用于基因克隆；,（,2,）用于序列分析；,（,3,）用于,southern,杂交和,RFLP,多态性分析。,3,构建物理图谱方法,（,1,）限制性内切酶部分消化法（,2,）双酶消化法 （,3,）内外切酶混合消化 （,4,）分子杂交 （,5,）,Southern,十字杂交法,微生物基因组学专家讲座,第35页,五、微生物基因组功效分析,1,、依据目标基因组性状而推测可能基因组功效。,如致病岛,G+C mol%,与细菌本身,G+C mol%,有很大差异。致病岛或耐药岛等。,2,、依据已知数据库进行同源性搜索。,美国,NIH,GenBank,；欧洲分子生物学试验数据库（,FMBL,）日本,DNA,数据库,(DDBJ),3,、利用不一样条件、不一样作用原因影响而判定未知基因功效。,如用过氧化氢酶处理沙门氏菌而取得该菌对,H,2,O,2,氧化应激反应基因。,4,、采取基因敲除方法来推测或确定基因功效。,微生物基因组学专家讲座,第36页,六、研究基因组功效意义,1,加速致病基因研究,2,寻找灵敏而特异性病原分子标识,病原微生物特异性,DNA,序列能够作为分子标识用于疾病诊疗。,3,促进新药发觉和疫苗发展,（,1,）促进新药发觉 （,2,）疫苗研究,4,促进微生物分类发展,微生物基因组学专家讲座,第37页,5.,提升对人类相关基因功效认识,（,1,）一些人类遗传性疾病，如结肠癌、肝豆状核变性、肾上腺脑白质营养不良等，在细菌基因组分析中，也存在类似蛋白物。,（,2,）能够利用微生物做模拟，去检测高等生物基因性状和功效。,（,3,）从基因水平去揭露人类疾病与病原微生物之间关系，如发病机理，人类与病原微生物之间相互作用基因机理等。,微生物基因组学专家讲座,第38页,七、微生物基因组功效学研究现实状况,（一）微生物基因组序列测定,1.,病毒基因组序列测定,2.,原核细胞微生物序列测定,1994,年美国发起微生物基因组计划，实质上就是以细菌基因组计划为开始生物工程（不包含病毒）。,3.,真核细胞微生物序列测定,1996,年第一个完成酿酒酵母测序，至当前为止，已经有数种真菌测序完成，还有,246,中正在测序之中。,微生物基因组学专家讲座,第39页,（二）微生物基因组测序碱基数,1.,病毒基因碱基数：最小病毒，如乙肝病毒，只有,3kb,碱基数，而最大痘病毒则有,300kb,碱基数。,2.,细菌基因组碱基数：细菌基因组碱基数一样差异很大，小至支原体为,50,万,bp,，大至黄色粘球菌为,900,万,bp,。,3.,真菌碱基数：当前测定微孢子虫为,300,万,bp,。,4,人类碱基数为,31.647,亿,bp,。,微生物基因组学专家讲座,第40页,（三）微生物基因组数,1.,病毒基因组数 由数个至数百个。,2.,细菌基因组数 由数百个至数千个。如百脉根中间根瘤菌为,8000,个基因组。,3.,真菌基因组数 基本上同细菌。如酿酒酵母为,6000,个。,附：人类基因组数为,2-2.5,万个，线虫,2,万个，果蝇,1-1.5,万个。,微生物基因组学专家讲座,第41页,人类基因组计划,HGP(Human Genome Projects),凯克,加州大学,微生物基因组学专家讲座,第42页,年,6,月,26,人类基因组工作草图绘制成功。,年,3,月 果蝇。,12,月拟南芥基因组完整图谱。,年,:HGP,和美国塞莱拉企业将各自测定人类基因组工作框架图分别发表在,Nature,和,Science,上。,年，,12,月,Nature,小鼠基因组。,在人类基因组计划中，包含对五种生物基因组研究：大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇和小鼠，称之为人类五种“模式生物”。,微生物基因组学专家讲座,第43页,微生物基因组学专家讲座,第44页,4,以杨焕明 在,Science,水稻全基因组框架序列图。,基因总数：约为人类,2,倍；其中,10000,个基因功效已确定水稻,“,垃圾,”,序列多位于基因外，人类,“,垃圾,”,序列多位于基因内；水稻基因平均,4500bp,人类基因平均,7bp,。,拟南芥约有,25000,个基因，,80%,在水稻中都存在，二者之间相关信号传导基因差异最大。,微生物基因组学专家讲座,第45页,微生物基因组学专家讲座,第46页,微生物基因组学专家讲座,第47页,中国家蚕基因组计划项目主持人、中国工程院院士,向仲怀,中国家蚕基因组计划主要攻关教授，西南农业大学教授,夏庆友,正在做测试。,微生物基因组学专家讲座,第48页,年,人类表观基因组计划,(Human Epigenome Project),于,10,月,7,日正式开启。这是世界上首项针对控制人类基因,“,开,”,和,“,关,”,主要化学改变进行图谱绘制工作，它将帮助科学家建立人类遗传与疾病之间关键联络。,年,10,月,国际人类基因组计划合作组织在,Nature,发了杂志上宣告误差小于,10,万分之一,人类基因组完成图已成功绘就,。已将原来,15,万个,“,缺隙,”,降低到,341,个。完成图显示人类基因组只含有,2,2.5,万,个基因。,年,8,月,在（,Nature,）杂志发表了,水稻基因组“精细图”,，覆盖率达,95.3,，中国对国际水稻基因组计划贡献率达,20,，共定位了,37,500,个基因，还率先完成了对着丝粒测序。,年,9,月,1,日出版,Nature和,9,月,2,日出版,Science,杂志，黑猩猩和人类基因组序列相同性到达,99,；即使考虑到序列插入或删除，二者相同性也有,96,。封面文章。,年,10,月,28,日,迄今最古老人类基因组测序完成，起源：,中国科学报,线粒体,微生物基因组学专家讲座,第49页,（四）微生物基因组结构和功效一些特点,1.,病毒基因组结构和功效特点,（,1,）病毒小，结构简单，与细菌和真核细胞生物相比，其基因组很小，各种病毒间也差异很大，约相差,1,2,个数量级。,（,2,）病毒基因组,（,3,）多数,RNA,病毒基因组是连续，也有一部分,RNA,病毒基因组是不连续,微生物基因组学专家讲座,第50页,（,4基因组重合现象,病毒基因组重合现象是,Sanger 1977,年研究,E.coli,噬菌体,174,时发觉。该噬菌体是单链,DNA,分子，有,5375,个核苷酸，可编码,11,种蛋白质，总分子量为,25,万左右，相当于,6078,个核苷酸编码产物。,病毒基因组重合现象能够有两种情况：完全重合 部分重合,（,5,）病毒大部分基因编码蛋白质，只有一少部分基因不编码蛋白质，这种不编码蛋白质基因普通少于,5,。,如,174,噬菌体不编码核苷酸为,217,，占总基因数,4.04,，（,217/5375,），这些不编码基因多数为基因表示调控基因。,人类不编码蛋白基因为,98,，只有,2,是编码蛋白基因微生物基因组学专家讲座,第51页,莲人在绿杨津,采 一,玉漱声歌新阙,采莲人在绿杨津，在绿杨津一阙新；,一阙新歌声漱玉,，,歌声漱玉采莲人,。,微生物基因组学专家讲座,第52页,微生物基因组学专家讲座,第53页,（,6,）在病毒基因中，功效相当蛋白质基因或,rRNA,基因往往聚集在基因组一个或几个特定部位，形成一个功效单元或转录单元。它们能够一起转录成含有多个,mRNA,多顺反子，再剪接成单顺反子，再翻译成蛋白质，如腺病毒等。,（,7,）除反转录病毒外，其它病毒均为单倍体，每个基因在病毒颗粒中只出现一次。反转录病毒基因组则有,2,个拷贝。,（,8,）噬菌体基因是连续，而真核细胞病毒基因组鲜有内含子。除正链,RNA,病毒外，真核细胞病毒都是转录成,mRNA,前体，再剪切加工，去掉内含子，形成成熟,mRNA,。,（,9,）病毒适应性基因丢失,微生物基因组学专家讲座,第54页,2.,细菌基因组结构和功效一些特点,（,1,）细菌染色体数目 以前认为细菌染色体数只有一条，经基因组研究后，确定了细菌染色体数是,1,条以上。,2,细菌基因组结构是连续，无内含子，因而转录后不需要剪切就可形成成熟,mRNA,转录起始前，有,3-10,个,bp,SD,序列（即与,tRNA,结合序列）。,微生物基因组学专家讲座,第55页,微生物基因组学专家讲座,第56页,3,含有操纵子结构，其中结构基因为多顺反子。4,在多数情况下，结构基因在细菌染色体基因组中都是单拷贝，但编码,rRNA,基因则是多拷贝,5,有编码同功酶同基因（,isogene,）。,6,细菌基因组不出现基因重合现象。,7,在,DNA,分子上，含有各种功效识别区，如复制起始区,(oric),。复制终止区,(Terc),，转录起始区和终止区等。这些区域往往含有特殊序列，并含有反向重复序列。,8,在基因或操纵子终末，往往含有特殊终止序列，它可使转录终止，并使,RNA,聚合酶从,DNA,链上脱落。,微生物基因组学专家讲座,第57页,9,毒立岛在细菌中普遍存在。,毒力岛概念,是指编码细菌毒力基因簇分子量较大染色体或质粒,DNA,片段。此概念是1990,年由,Hacker,等在研究泌尿系统致病性,E,coli,编码毒力两个相关基因而提出。毒力岛又叫致病岛或毒力块、毒力盒（,virulence blocks or virulence cassettes,）等,10,细菌基因单向转移在细菌之间，甚至在古细菌和真细菌之间出现有大量基因转移。,微生物基因组学专家讲座,第58页,11,在细菌基因中发觉大量未知基因，在已测序细菌中，发觉约有四分之一基因为未知基因，有待于确定。,12,适应性基因缺失,（,13,）细菌,DNA,中,CpG,结构,(,许多基因，尤其是管家基因开启子区，基因末端通常存在一些富含双核苷酸“,CG”,区域，称为“,CpG,岛”（,CpG island,）。,),CpG,结构是细菌,DNA,中胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸结构。是,DNA,刺激机体产生较强免疫应答结构，是抗核酸免疫主要抗原。,14,）一批新功效基因被揭晓,微生物基因组学专家讲座,第59页,