实验室消毒灭菌原则与方法.docx

清洁、消毒、灭菌是预防和控制实验室污染的一个重要环节。包括实验室内外环境的清洁、消毒；检测用具、培养基等的消毒、灭菌，今天让我们一起来学习一下！

一概念

（一）消毒
是指杀灭或清除传播媒介上的病原微生物，使之达到无害化的处理。根据有无已知的传染源可分预防性消毒和疫源性消毒；根据消毒的时间可分为随时消毒和终末消毒。
（二）灭菌
是指杀灭或清除传播媒介上的所有微生物（包括芽胞），使之达到无菌程度。经过灭菌的物品称“无菌物品”。
消毒与灭菌是两个不同的要领。灭菌可包括消毒，而消毒却不能代替灭菌。消毒通常用于实验室检测环境、人员手部等，灭菌通常用于检测用具、检测试剂等。

二消毒、灭菌的原则

（一）明确消毒的主要对象
应具体分析引起污染的途径、涉及的媒介物及病原微生物的种类，有针对性地使用消毒剂。
（二）采取适当的消毒方法
根据消毒对象选择简便、有效、不损坏物品、来源丰富、价格适中的消毒方法。
（三）控制影响消毒效果的因素
许多因素会影响消毒剂的作用，而且各种消毒剂对这些因素的敏感性差异很大。
1．微生物的种类
不同类型的病原微生物对消毒剂抵抗力不同，因此，进行消毒时必须区别对待。
（1）细菌繁殖体。易被消毒剂消灭，一般革蓝氏阳性细菌对消毒剂较敏感，革蓝氏阴性杆菌则常有较强的抵抗力。繁殖体对热敏感，消毒方法以热力消毒为主。
（2）细菌芽胞。芽胞对消毒因子耐力最强，杀灭细菌芽胞最可靠的方法是热力灭菌，电离辐射和环氧乙烷熏蒸法。在化学消毒剂中，戊二醛、过氧乙酸能杀灭芽胞，但可靠性不如热力灭菌法。
（3）病毒。对消毒因子的耐力因种类不同而有很大差异，亲水病毒的耐力较亲脂病毒强。
（4）真菌。对干燥、日光、紫外线以及多数化学药物耐力较强，但不耐热（60℃ 1小时杀灭）。
2．微生物的数量 
污染的微生物数量越多需要消毒的时间就越长，剂量越大。
3．有机物的存在
（1）有机物在微生物的表面形成保护层妨碍消毒剂与微生物的接触或延迟消毒剂的作用，以致微生物逐渐产生对药物的适应性。
（2）有机物和消毒剂作用，形成溶解度比原来更低或杀菌作用比原来更弱的化合物。
（3）一部分消毒剂与有机物发生了作用，则对微生物的作用浓度降低。
（4）有机物可中和一部分消毒剂。消毒剂中重金属类、表面活化剂等受有机物影响较大，对戊二醛影响较小。
4．温度 
随着温度的升高，杀菌作用增强，但温度的变化对各种消毒剂影响不同。如甲醛、戊二醛、环氧乙烷的湿度升高1倍时，杀菌效果可增加10倍。而酚类和酒精受温度影响小。
5．pH值 
从两方面影响杀菌作用。一是对消毒剂的作用：改变其溶解度和分子结构。二是pH过高或过低对微生物的生长均有影响。在酸性条件下，细菌表面负电荷减少，阴离子型消毒剂杀菌效果好。在碱性条件下，细菌表面负电荷增多，有利于阳离子型消毒剂发挥作用。
6．处理剂量与监测
 保证消毒、灭菌处理的剂量，加强效果监测，防止再污染。

三消毒、灭菌的方法

（一）物理消毒灭菌法
利用物理因子杀灭微生物的方法。包括热力消毒灭菌、辐射消毒、空气净化、超声波消毒和微波消毒等。
1．热力消毒灭菌
高温能使微生物的蛋白质和酶变性或凝固（结构改变导致功能丧失），新陈代谢受到障碍而死亡，从而达到消毒与灭菌的目的。在消毒中，热可分为湿热与干热两大类。
2．干热消毒灭菌
干热是指相对湿度在20％以下的高热。干热消毒灭菌是由空气导热，传热效果较慢。一般繁殖体在干热80-100℃中经1小时可以杀死，芽胞需160-170℃经2小时方可杀死。
（1）燃烧法
是一种简单、迅速、彻底的灭菌方法，因对物品的破坏性大，故应用范围有限。
烧灼法：一些耐高温的器械（金属、搪瓷类），在急用或无条件用其他方法消毒时可采用此法。将器械放在火焰上烧灼1-2分钟。若为搪瓷容器，可倒少量95％乙醇，慢慢转动容器，使乙醇分布均匀，点火燃烧至熄灭约1-2分钟。采集作细菌培养的标本时，在留取标本前后（即启盖后，闭盖前）都应将试管（瓶）口和盖子置于火焰上烧灼，来回旋转2-3次。
燃烧时要注意安全，须远离易燃易爆物品，如氧气、汽油、乙醚等。燃烧过程不得添加乙醇，以免引起火焰上窜而致灼伤或火灾。锐利刀剪为保护刀锋，不宜用燃烧灭菌法。
焚烧：某些特殊感染，如破伤风、气性坏疽、绿脓杆菌感染的敷料，以及其它已污染且无保留价值的物品，如污纸、垃圾等，应放入焚烧炉内焚烧，使之炭化。
（2）干烤法
电热培养箱：利用培养箱的热空气消毒灭菌。培养箱通电加热后的空气在一定空间不断对流，产生均一效应的热空气直接穿透物体。一般繁殖体在干热80-100℃中经1小时可以杀死，芽胞、病毒需160-170℃经2小时方可杀死。热空气消毒灭菌法适用于玻璃器皿、瓷器以及明胶海棉、液体石腊、各种粉剂等。灭菌后待箱内温度降至50-40℃以下才能开启柜门，以防炸裂。
微波消毒：微波是一种高频电磁波，其杀菌的作用原理，一为热效应，所及之处产生分子内部剧烈运动，使物体里外湿度迅速升高；一为综合效应，诸如化学效应、电磁共振效应和场致力效应。目前已广泛应用于食品、药品的消毒，用微波灭菌手术器械包、微生物实验室用品等亦有报告。若物品先经1％过氧乙酸或0.5％新洁尔灭湿化处理后，可起协同杀菌作用，照射2分钟，可使杀芽胞率由98.81％增加到99.98％-99.99％。  
微波对人体有一定危害性，其热效应可损伤睾丸、眼睛晶状体等，长时间照射还可致神经功能紊乱。使用时可设置不透微波的金属屏障或戴特制防护眼镜等。
3．湿热消毒灭菌
湿热消毒灭菌是由空气和水蒸气导热，传热快，穿透力强，湿热灭菌法比干热灭菌法所需温度低、时间短。
（1）煮沸法。将水煮沸至100℃，保持5-10分钟可杀灭繁殖体，保持1-3小时可杀灭芽胞。在水中加入碳酸氢钠至1％-2％浓度时，沸点可达105℃，能增强杀菌作用，还可去污防锈。在高原地区气压低、沸点低的情况下，要延长消毒时间（海拔每增高300m，需延长消毒时间2分钟）。此法适用于不怕潮湿耐高温的搪瓷、金属、玻璃、橡胶类物品。
煮沸前物品涮洗干净，打开轴节或盖子，将其全部浸入水中。大小相同的碗、盆等均不能重叠，以确保物品各面与水接触。锐利、细小、易损物品用纱布包裹，以免撞击或散落。玻璃、搪瓷类放入冷水或温水中煮；金属、橡胶类则待水沸后放入。消毒时间均从水沸后开始计时。若中途再加入物品，则重新计时，消毒后及时取出物品，保持其无菌状态。
（2）高压蒸汽灭菌法。高压蒸汽灭菌器装置严密，输入蒸汽不外逸，温度随蒸汽压力增高而升高，当压力增至103-206kPa时，湿度可达121.3-132℃。高压蒸汽灭菌法就是利用高压和高热释放的潜热进行灭菌，为目前可靠而有效的灭菌方法。适用于耐高温、高压，不怕潮湿的物品，如敷料、手术器械、药品、细菌培养基等。潜热是指当lg100℃的水蒸汽变成lg100℃水时，释放出2255.2J的热量。
高压蒸汽灭菌的关键问题是为热的传导提供良好条件，而其中最重要的是使冷空气从灭菌器中顺利排出。因为冷空气导热性差，阻碍蒸汽接触欲灭菌物品，并且还可减低蒸汽分压使之不能达到应有的温度。
手提式高压蒸汽灭菌器：为金属圆筒，分为二层，隔层内盛水，有盖，可以旋紧，加热后产生蒸汽。锅外有压力表，当蒸汽压力升高时，温度也随之相应升高。该灭菌器体积小，可自发蒸汽，便于携带。
操作方法如下：在灭菌器中盛水3000ml；将拟灭菌的物品随同盛装的桶放入灭菌器内；将盖子上的排气软管插于铝桶内壁的方管中；盖好盖子，拧紧元宝螺丝，勿使漏气；锅下加热，打开排气活门，放出冷空气（一般在水沸后排气10-15分钟左右），关闭放气活门，使压力逐渐上升至103kPa，温度达121.3℃，维持20分钟后，排气至“0”时，慢慢打开盖子。如果突然开盖，冷空气大量进入，蒸汽凝成水滴，使物品潮湿，且玻璃类易发生爆裂。后再关闭放气开关，待夹层压力表达到灭菌所需压力时（约10分钟后），将蒸汽控制阀移至“消毒”位置，使蒸汽进入柜室 ，柜室内的冷空气及冷凝水可由柜室阻气器排出，待柜室的压力升到103-137kPa，温度达121.3-126.2℃时，转动压力调节阀，使压力与温度保持恒定。维持30分钟后，将蒸汽控制阀移至“排气”位置，排气毕，将蒸汽控制阀移至“干燥”位置；物品干燥后，将蒸气控制阀移至“关闭”位置，待压力指针到“0”位置和热空气排尽后，才能打开柜门，取出物品；关紧进气阀。  
卧式高压蒸汽灭菌器：其结构原理同手提式高压蒸汽灭菌器，因其体积大，一次可灭菌大量物品。操作人员须经专业培训，合格后方能上岗。
预真空式高压蒸汽灭菌器：在通入蒸汽前有一预处理阶段，即柜室内抽负压至2.6kPa（空气排除约98％），所以，预真空高压蒸汽灭菌器除有下排气式所具备的灭菌系统、蒸汽输送系统、控制系统、安全系统和仪表监测指示系统外，增加抽负压系统和空气过滤系统。机器运转由电脑控制。
4．紫外线消毒
在室温20℃~25℃时，220V、30W紫外灯下方垂直位置1.0m处的253.7nm紫外线辐射强度应70W/cm²，低于此值时应更换，适当数量的紫外灯，确保平均每立方米应不少于1.5W。紫外线消毒时，无菌室内应保持清洁干燥。在无人条件下，可采取紫外线消毒，作用时间应30min，室内湿度20%或40%、相对湿度大于60%时，应适当延长照射时间。用紫外线消毒物品表面时，应使照射表面受到紫外线的直接照射，且应达到足够的照射剂量。人员在关闭紫外灯至少30min后方可入内作业。
5．臭氧消毒
封闭无菌室内，无人条件下，采用20mg/m³浓度的臭氧，作用时间应30min。消毒后室内臭氧浓度0.2mg/m³时方可入内作业。
（二）化学试剂消毒
（1）甲醛消毒：按照甲醛（40%）10毫升／立方米、高锰酸钾5克／立方米计算用量。不同情况下，用量有所不同，但比例为2：1。盛药容器要大、耐热、耐腐蚀：一般用陶瓷或玻璃容器，因为高锰酸钾和甲醛都具有腐蚀性，且混合后反应剧烈，释放热量。房间要密闭：这样熏蒸效果才会好。容器应尽量靠近门，以便操作人员迅速撤离；先将温水倒入容器内，后加入高锰酸钾，搅拌均匀；再加入甲醛；加入甲醛后人立即离开，密闭房间。注意顺序：是将甲醛倒入高锰酸钾溶液内。消毒时间一般为20-30分钟。消毒后要打开门窗通风换气。
这里说的甲醛就是40%的甲醛溶液，也就是福尔马林，一般包装上写的是37%。缺点：甲醛对人体危害太大了，一般不推荐这种方法。可以考虑用40%乳酸熏蒸，效果很不错的。
（2）乳酸重蒸法消毒：室内温度22℃，湿度75%~90%，按0.6g/m³乳酸量共用9.6g进行室内熏蒸，使蒸汽弥散全室，密闭门窗1 h。