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微生物工程实验指导

河北农业大学
生命科学学院制药工程系
10月

实验一 细菌生长曲线的测定
一、 实验目的
了解细菌生长曲线特点及测定原理;
学习用比浊法测定细菌的生长曲线。
二、 原理
将少量细菌接种到一定体积的、 适合的新鲜培养基中, 在适宜的条件下进行培养, 定时测定培养液中的菌量, 以菌量的对数作纵坐标, 生长时间作横坐标, 绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。依据其生长速率的不同, 一般可把生长曲线分为延缓期、 对数期、 稳定期和衰亡期。这四个时期的长短因菌种的遗传性、 接种量和培养条件的不同而有所改变。因此经过测定微生物的生长曲线, 可了解各菌的生长规律, 对于科研和生产都具有重要的指导意义。
测定微生物的数量有多种不同的方法, 可根据要求和实验室条件选用。本实验采用比浊法测定, 由于细菌悬液的浓度与光密度( OD值) 成正比, 因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度, 并将所测的OD值与其对应的培养时间作图, 即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线, 此法快捷、 简便。
三、 实验材料
1. 菌种
大肠杆菌( E.coli)
2. 培养基
肉膏蛋白胨培养基: 牛肉膏 3g, 蛋白胨 10g, NaCl 5g, 琼脂 15-20g, 水 1000mL, 调pH 7.0-7.2。
3. 仪器和器具
721分光光度计, 比色杯, 恒温摇床, 无菌吸管, 试管, 三角瓶。
四、 流程
种子液→标记→接种→培养→测定
五、 实验方法  
1. 种子液制备
取大肠杆菌斜面菌种1支, 以无菌操作挑取1环菌苔, 接入肉膏蛋白胨培养液中, 静止培养18h作种子培养液。
2. 标记编号
取盛有50mL( 5mL) 无菌肉膏蛋白胨培养液的250mL三角瓶( 18×180试管) 11个, 分别编号为0、 1.5、 3、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 20h。
3. 接种培养
用2mL( 1mL) 无菌吸管分别准确吸取2mL( 0.2mL) 种子液加入已编号的11个三角瓶( 试管) 中( 可早、 晚各接种一次, 则均在白天取样, 次日下午或晚上可测) , 于37℃下振荡培养。然后分别按对应时间将三角瓶( 试管) 取出, 立即放冰箱中贮存, 待培养结束时一同测定OD600值。
4. 生长量测定
将未接种的肉膏蛋白胨培养基倾倒入比色杯中, 选用600nm波长分光光度计上调节零点, 作为空白对照, 并对不同时间培养液从0h起依次进行测定, 对浓度大的菌悬液用未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基适当稀释后测定, 使其OD值在0.10-0.65以内, 经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数, 才是培养液实际的OD值。
六、  结果
1. 将测定的OD值填入下表:
时间(h)
对照
 0 
1.5
  3
4
6
8
10
12
14
16 
20
OD600
0

2. 以上述表格中的时间为横坐标, OD600 值为纵坐标, 绘制大肠杆菌的生长曲线。

实验二 从土壤中分离产酸细菌

一.实验目的要求:
掌握微生物分离纯化的方法, 学习筛选培养基制备原理和方法。
二.实验原理:
从混杂的微生物群体中获得某一种或某一株微生物的过程, 称微生物的分离与纯化, 本实验采用稀释涂布平板法分离产酸细菌, 以碳酸钙为底物, 经产酸菌酸化形成透明圈。
2H+ + CO32-→CO2↑+ H2O
三.主要设备、 器材:
1.实验器皿: 250 mL三角瓶2只; 试管7支( 带棉或硅胶塞) ; 9 cm培养皿6个; 1 mL移液管7根; 吸耳球1个; 涂布棒3个; 废报纸、 棉花、 棉绳、 玻璃珠若干。净工作台、 接种环、 酒精灯各一套
2.实验试剂: 琼脂, 蛋白胨, 牛肉膏, CaCO3, 0.5mol/L的HCl溶液, 0.5mol/L的NaOH溶液 玻璃棒, pH试纸

四 实验步骤:
1. 分离用器皿的准备
用报纸包扎6个培养皿, 7根1mL移液管, 3个涂布棒, 160 ℃干热灭菌60 min。( 亦可121℃湿热灭菌20 min)
2. 无菌水的制备
取1只250 mL三角瓶装入90 mL自来水和15-20粒玻璃珠。121℃湿热灭菌20 min。
取6支试管各加自来水9 mL (6只一捆)。 121℃湿热灭菌20 min。
3. 培养基的制备及分离平板制作
取1只250 mL三角瓶制作细菌固体培养基100 mL( 配方: 蛋白胨1.0%, 牛肉膏0.3%, CaCO3 1%, 琼脂1.8-2.0%, pH 7.0) , 121 ℃湿热灭菌20 min, 60℃恒温箱保温。
倒平板, 将培养基充分摇匀呈浑浊液, 立即在超静台上将6个培养皿倒入细菌培养基( 约15-16 mL) 。
4. 土壤中产酸细菌的分离操作
称取校园土10 g, 在超静台无菌操作倒入冷却至室温的无菌水中( 90 mL蒸馏水/250mL三角瓶带玻璃珠) , 摇匀5-10 min, 制成菌液, 用十倍稀释法稀释到10-6( 5支无菌水试管) 。
分别取10-4, 10-5, 10-6稀释度的稀释液, 每个稀释度涂布两个培养皿, 每个培养皿0.1 mL( 2-3滴) 。35℃培养箱培养2d, 观察单菌落周围有无透明圈出现如有透明圈说明该菌株可能产酸。
( 以下内容选作) 挑取具有透明圈的单菌落至牛肉膏蛋白胨斜面, 进一步利用划线分离法纯化, 做产酸能力实验。从复筛培养基上挑取透明圈较大的单菌落接种至三角瓶液体培养基中, 摇床培养2天后, 检测产酸能力( 用pH试纸或酸碱滴定法) 。

五 根据实验结果进行分析讨论

六 思考题:

1. 根据实验结果回答, 如何区分平板中非产酸菌?
2. 你觉得本实验设计的筛选培养基该如何改进?

实验二 喷雾干燥酶粉中分离筛选1398中性蛋白酶生产菌株
( 选做)
一、 实验目的要求
掌握微生物分离纯化的方法, 学习筛选培养基的制备, 灭菌等无菌操作技术。
二、 实验原理
中性蛋白酶是许多微生物分泌到胞外的能在pH值中性范围内水解蛋白质的酶类, 利用此机制以干酪素为底物, 根据水解透明圈与菌落比值的大小来进行菌株的筛选。比值大的其产酶活力明显增大。
三、 材料与方法
1、 试验材料
供试材料为喷雾干燥的中性蛋白酶样品。购自市场。
2、 培养基
( 1) 干酪素培养基: 干酪素2.0％( 用适量NaOH溶液加热溶解) , 琼脂1.5％, pH7.0( 或干酪素 4g, 硫酸镁 0.5g, 氯化钾 0.5g, 硫酸铁 0.01g, 蔗糖 30g, 琼脂20g, 1000mL) 。
( 2) 牛肉膏蛋白胨培养基: 牛肉膏0.4％, 蛋白胨0.6％, 酵母浸出粉0.2％, NaCl 0.5％, 琼脂2.0％, pH7.0
( 3) 发酵培养基Ⅰ: 麸皮4.0％, 蛋白胨0.1％, Na2HPO4·12H2O 0.4％, KH2PO4 0.03%, pH7.0。
发酵培养基Ⅱ: 可溶性淀粉1.0％, 蛋白胨0.5％, Na2HPO4·12H2O 0.4%, KH2PO4 0.03%, CaCl2 0.1%, pH7.0。
3、 仪器与设备
超净工作台, 恒温培养箱, 恒温振荡培养箱, 恒温水浴锅, 台式低速离心机, 721型分光光度计
4、 步骤
( 1) 初筛
利用样品经过常规稀释平板法: 即取10 g样品置于已加入90mL无菌水的三角瓶中, 220 r／min旋转摇床, 20 min后取出, 静置30 s。此三角瓶中液体的浓度为10-1, 再用7支分别装有9 mL无菌水的试管进行稀释, 稀释至10-8。
将干酪素培养基分别倒入已灭菌的6个平皿中, 每个平皿倒入10 mL左右, 然后吸取0.1 mL的10-6, 10-7, 10-8稀释液分别涂布于干酪素培养基表面, 每个稀释浓度涂布2个平皿。37 ℃培养24 h。肉眼选出产生透明圈的菌株。
将牛肉膏蛋白胨培养基分别倒入7个已灭菌的平皿( 每个平皿倒10mL左右, 置平板) 和7支试管( 每支试管6mL左右, 置斜面) 内。然后将选出来的若干株菌在平皿上划线, 每株划一个平皿。37 ℃培养24 h。取出, 然后从平皿中选出其单菌落划线至斜面试管( 每个平皿对应一支斜面试管) 进行活化培养, 37 ℃培养24 h。
( 2) 复筛
面试管中分别接一环对应于装有发酵培养基Ⅰ的三角瓶中进行发酵培养。30 ℃恒温振荡培养48 h, 3500r／min离心30 min, 取上清液测蛋白酶活力。然后从中挑选出酶活力较高的1-3株。用发酵培养基Ⅱ进行发酵培养, 30 ℃恒温振荡培养48 h, 3500 r／min离心30 min, 取上清液测蛋白酶活力。然后从中挑选出酶活力最高的1株。
5、 蛋白酶活力的测定
( 1) 原理
采用福林-酚试剂法。福林酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色( 钼蓝和钨蓝混合物) , 由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸( 如酪氨酸, 色氨酸等) , 可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。一般以酪蛋白为底物, 在一定pH值和温度条件下, 同酶液反应, 经一段时间后终止酶反应, 经离心或过滤除去酪蛋白等沉淀物后取上清液, 用Na2CO3碱化, 再加入福林-酚试剂显色, 蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比, 酪氨酸含量用分光光度计在660 nm处测定, 从而计算出蛋白酶活力。
( 2) 试剂
福林-酚试剂
在 mL磨口回流瓶中, 加入100g钨酸钠( Na2WO4·2H2O) , 25g钼酸钠( Na2MoO4·2H2O) 及700mL蒸馏水, 再加50mL85%磷酸, 100mL浓盐酸, 充分混合, 接上回流管, 以小火回流10小时, 回流结束时, 加入50g 硫 酸 锂( Li2SO4) , 50mL蒸馏水及数滴浓溴水( 99％) , 开口继续沸腾15分钟, 以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色( 如仍呈绿色, 须再重复滴加浓溴水的步骤) 。定容至1000mL, 过滤, 滤液置于棕色试剂瓶中保存。此溶液使用时加两倍蒸馏水稀释, 即成已稀释的福林试剂。
0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液
精确称取TCA65.4g , 加去离子水定容至1000 mL。
0.4mo1/L碳酸钠溶液
精确称取无水碳酸钠42.4 g, 加去离于水溶解后, 定容至1000 mL。
pH7.2磷酸盐缓冲液
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2 g, 定容至1000 mL, 即成0.2 mol/L溶液(A液)。称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63 g, 定容至1000 mL, 即成0.2 mol/L溶液(B液)。
取A 液28 mL 和B 液72 mL, 再用蒸馏水稀释1倍, 即成0.1 mol/L、 pH7.2的磷酸盐缓冲液。
2%酪蛋白溶液
准确称取干酪素2 g, 称准至0.002 g, 加入0.1 mol/L氢氧化钠10 mL, 在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸), 然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100 mL即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存, 否则极易繁殖细菌, 引起变质。
100 μg/mL酪氨酸溶液
精确称取在105 ℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000 g, 用1 mol／L盐酸溶液60 mL溶解后, 用蒸馏水定容至100 mL, 即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。
吸取1 mg／mL酪氨酸标准溶液10 mL, 用0.1 mol／L盐酸溶液定容至100 mL, 即得到100μg/mL的酪氨酸标准溶液。此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存, 以免繁殖细菌而变质。
( 3) 酪氨酸标准曲线的绘制
取18支试管分成6组(每组3支, 平行样), 编号, 按下表分别加入标准酪氨酸、 去离子水、 0.4 moL/L的碳酸钠和福林-酚试剂, 混匀后, 放入40℃水浴保温20min, 然后在721型分光光度计上进行比色测定(波长660 nm), 以浓度为0 μg/mL酪氨酸反位液做空白对照。
管号 
标准酪氨酸 
 (mL) 
去离子水
 (mL) 
Na2CO3 
(mL)    
福林一酚试剂   (mL)  
酪氨酸含量
(μg/mL)
1
0
1.0
5
1
0
2
0.2
0.8
5
1
20
3
0.4
0.6
5
1
40
4
0.6
0.4
5
1
60
5
0.8
0.2
5
1
80
6
1.0
0
5
1
100
( 4) 样品酶活力的测定
取4支试管编号(1号为空白对照), 分别加入酶液1mL, 1号管立即加入0.4mol/L TCA溶液2mL, 使酶失活, 另3支样品加入1 mL pH 7.2、 浓度为2%酪蛋白底物缓冲液(如测酸性蛋白酶活力加pH 3.6、 2%酪蛋白底物缓冲液), 迅速混匀, 并立即放入40 ℃恒温水浴准确计时, 保温10 min后, 立即加入0.4 moL/LTCA溶液2 mL, 终止反应, 同时向1号空白管中加入1 mL 2%酪蛋白底物缓冲液, 摇匀, 继续置于水浴中保温20 min, 取出离心或过滤除去剩余酪蛋白及酶蛋白沉淀物, 然后取各试管滤液1 mL, 分别移入另4支试管中, 再加入0.4 mol/L碳酸钠溶液5 mL和己稀释的福林-酚试剂1 mL, 摇匀, 保温显色20 min后, 进行比色测定(波长660 nm)。对照标准曲线, 计算酪氨酸含量。
( 5) 蛋白酶活力计算: 蛋白酶活力=A×4×N/10。
  式中: A表示对照标准曲线得出的酪氨酸释放量; 4表示反应液总体积; N表示酶液的稀释倍数; 10表示反应时间10 min; 蛋白酶活性定义:在一定pH值(pH 7.0)和40 ℃温度条件下, 每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸定义为一个蛋白酶活力单位。

思考题: 某菌株的透明圈的大小能够完全反映该菌株的蛋白酶活力大小吗? 说明理由。

实验三 黑曲霉三角瓶固态发酵实验
一、 概述
固体发酵法作为一个古老的生物工艺早在几千年前已在食品和调味品上得到应用。与液体发酵相比, 固态发酵操作简易、 工艺简单、 能耗低, 无废水废渣产生, 不造成对环境的二次污染。因此, 固态发酵法当前在生产有机酸、 发酵食品、 酶制剂以及动植物废弃物、 垃圾的处理和利用等方面有着广泛的应用。利用曲霉属菌种, 经过固体或液体发酵法生产酸性蛋白酶, 中国在七十年代末和八十年代初作过一些研究, 但此后有关这方面研究的报导极少见到。近年来, 随着酸性蛋白酶应用范围的扩大, 特别是作为一种新型的生物饲料添加剂, 在饲料工业中表现出来的潜在功能, 越来越引起人们对它的研究兴趣。
二、 实验目的与要求
经过三角瓶固态培养黑曲霉, 掌握固态培养微生物的原理和技术, 并掌握蛋白酶的分析方法。
三、 菌种和培养基
1、 菌种:
黑曲霉( 上海华东理工大学赠送)
2、 培养基:
( 1) 斜面培养基
土豆培养基或察氏培养基。( 土豆培养基: 取去皮马铃薯200克, 切成小块, 加水1000毫升煮沸30分钟, 滤去马铃薯块, 将滤液补足至1000毫升, 加葡萄糖20克, 琼脂15克, 溶化后分装, 15磅灭菌30分钟。)
( 2) 固态发酵培养基
麸皮 8g, 豆饼粉 2g, (NH4)2SO2 0.2g, 水11mL, 121℃灭菌45分钟。
四、 仪器与设备
三角瓶100个、 普通天平4个, 分析天平1台, 灭菌锅、 恒温培养箱、 超净工作台
接种铲8个, 100mL量筒8个, 10mL移液管8支, 塑料盆8个
五、 实验过程
原始斜面菌种→斜面接种培养( 28℃、 7天) →麸皮试管培养( 28℃、 7天) →三角瓶培养(28℃ 72h)→测定酸性蛋白酶酶活力, 观察孢子形态。
固态发酵培养基灭菌后将培养基拍散, 冷却至室温, 接入麸皮试管种子, 混匀, 于恒温培养箱中28-30℃静置培养72小时, 取样测定酶活力。
实验分四组:
①组: 装料量对酶活力的影响。取5×3( 2) 个250mL三角瓶, 按以上固态发酵培养基, 分别按下列装料量( 按干料计算) 装料: 5g/瓶; 10 g/瓶; 15 g/瓶; 20 g/瓶; 25 g/瓶。接种培养72小时后, 测定每一瓶的发酵酶活力, 计算三瓶平均数。
②组: 碳氮比对酶活力的影响。取5×3( 2) 个250mL三角瓶, 麸皮和豆饼粉的比例按下列配比: 6:4; 7:3; 8:2; 9:1; 10:0。接种培养72小时后, 测定每一瓶的发酵酶活力, 计算三瓶平均数。
③组: 料水比对酶活力的影响。取5×3( 2) 个250mL三角瓶, 麸皮和豆饼粉的比例按给出的固态发酵培养基, 但料水比按以下比例配制: 10:8; 10:9; 10:10; 10:11; 10:12, 接种培养72小时后, 测定每一瓶的发酵酶活力, 计算三瓶平均数。
④组: 酶活力的时间变化曲线。取5×3( 2) 个250mL三角瓶, 麸皮和豆饼粉的比例按给出的固态发酵培养基, 接种培养, 分别于接种后24、 36、 48、 60、 72小时取样, 测定每一瓶的发酵酶活力 计算三瓶平均数。

实验四 黑曲霉固态发酵曲的酸性蛋白酶活力测定( 承接试验三)
一、 实验目的与要求:
1.学习固态发酵胞外产物( 酶) 的提取方法
2.掌握福林-酚试剂法测定蛋白酶活力的步骤与方法
二、 蛋白酶活力的测定原理:
    采用福林-酚试剂法。福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物), 由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、 色氨酸等), 可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。一般以酪蛋白为底物, 在一定pH值和温度条件下, 同酶液反应, 经一段时间后终止酶促反应, 经离心或过滤除去酪蛋白等沉淀物后取上清液, 用Na2CO3碱化, 再加入福林-酚试剂显色, 蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比; 酪氨酸含量用分光光度计在680nm波长处测定, 从而计算出蛋白酶的活力。
三、 仪器、 设备、 物品:
分析天平, 电炉, 分光光度计, 恒温水浴锅, 恒温箱, 试管架
试管( 18×180) 200支, 小烧杯100个, 纱布1卷, 玻璃棒8, 记号笔8,
四、 试剂配制
1、 福林-酚试剂 ( 磷钨酸与磷钼酸的混合物)
    向 mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2WO4•2H2O)、 25g钼酸钠及700mL的去离子水, 再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸l00mL, 充分混合后, 接上回流冷凝管, 以文火回流10h, 结束后再加入50g的硫酸锂(LiSO4)、 50mL去离子水及数滴浓溴水( 99%) , 再继续沸腾15min, 以驱除过量的溴, 冷却后滤液呈黄绿色(如仍呈绿色, 需再重复滴加溴水的步骤), 加去离子水定容至1000mL, 过滤, 滤液置于棕色试剂瓶中, 贮于冰箱中可长期保存备用。此溶液使用时可按1:2比例用去离子水稀释( 一份福林试剂与两份水混合) 。
2、 0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液
精确称取TCA65.4g, 加去离子水定容至1000mL。
3、 0.4mo1/L碳酸钠溶液
精确称取无水碳酸钠42.4g, 加去离于水溶解后, 定容至1000mL。
4、 乳酸缓冲液( pH=3.0) 的制备
甲液 称取乳酸( 80～90%) 10.6g, 加水溶解并定容至1000mL。
乙液 称取乳酸钠( 70%) 16g, 加水溶解并定容至1000 mL。
使用溶液 取甲液8mL, 加乙液1mL, 混匀, 稀释一倍, 即成0.05mol/L乳酸缓冲液。
5、 2%酪素溶液
取酪素2.000g, 精确至0.001g, 用浓乳酸2-3滴润湿后, 加入适量的乳酸缓冲液约80mL, 在沸水浴中边加热边搅拌, 直至完全溶解, 冷却后, 转入100mL的容量瓶中, 用乳酸缓冲液稀释至刻度, 冰箱中贮存。有效期为三天。
6、 100μg/mL标准酪氨酸溶液
精确称取预先于105℃干燥2～3h的L-酪氨酸0.1g, 逐步加入6mL 1NHCl使之溶解, 用0.2NHCl定容至100mL, 即得1mg/mL的酪氨酸溶液, 取此溶液10mL, 用0.2NHCl定容至100mL即成100μg/mL标准酪氨酸溶液
五、 标准曲线绘制
为了确定酪氨酸浓度与OD值的对应关系, 须事先以不同浓度的标准酪氨酸与福林试剂反应显色, 测定OD值并绘制标准曲线。
1、 不同浓度的标准酪氨酸按下表配制:
试管号
100μg/mL标准酪氨酸溶液
( mL)
蒸馏水
( mL)
酪氨酸的浓度
( μg/mL)
对照
0
10
0
1
1
9
10
2
2
8
20
3
3
7
30
4
4
6
40
5
5
5
50
6
6
4
60
2、 标准曲线的绘制
将上表配制的各种浓度酪氨酸溶液各取1mL( 需做平行) 分别加入0.4mol/L
Na2CO3溶液5mL, 稀福林试剂1mL, 置40℃水浴中显色20min, 以721分光光度计在波长680nm测定OD值, 用0.2NHCl做对照, 以OD值为纵坐标, 酪氨酸的浓度为横坐标, 绘制标准曲线。此曲线应是经过零点的直线, 然后计算K值[标准曲线中OD为1时的酪氨酸浓度( μg/mL) ]。K值一般应在95～100范围内。
六、 黑曲霉曲中酸性蛋白酶活力的测定
1、 待测酶液的制备
精确称取曲块5g, 加水100mL, 在40℃水浴中充分搅拌30min, 充分溶出酶蛋白, 然后过滤, 滤液用缓冲液稀释待测( 稀释倍数应使水解底物后与福林试剂显色的OD值在0.2～0.4范围内) 。
酶曲稀释倍数可参考下表
酶活力u/g
总倍数
第一次稀释
第二次稀释

200
5g→50mL(10倍)
0.5mL→10mL(20倍)
3000
250
2g→50mL(25倍)
1mL→10mL(10倍)
4000
400
5g→50mL(10倍)
5mL→200mL(40倍)
5000
500
2g→50mL(25倍)
0.5mL→10mL(20倍)
10000
1000
2g→50mL(25倍)
5mL→200mL(40倍)
2、 样品酶活的测定
( 1) 先将酪素溶液放入40±0.5℃的恒温水浴中, 预热5min。
( 2) 按下列程序操作:

试管B( 空白)
加酶液1mL
40±0.5℃,2min
加酪素1.00mL( 摇匀)
40℃±0.5℃, 10min
加三氯醋酸2.00mL(摇匀)
取出静止10min, 过滤
取1.00mL滤液
加碳酸钠溶液5.0mL
加富林试剂使用液1.00mL
40±0.5℃显色20min
于680nm波长, 用10mm比色皿测吸光度
试管A( 酶试样, 需作平行)
加酶液1mL
加酪素1.00mL( 摇匀)
40℃±0.5℃, 10分钟
加三氯醋酸2.00mL(摇匀)
取出静止10min, 过滤
取1.00mL滤液
加富林试剂使用液1.00mL
40±0.5℃,2min
加碳酸钠溶液5.0mL
于680nm波长, 用10mm比色皿测吸光度
40±0.5℃显色20min

3、 蛋白酶活力的计算
蛋白酶活力X=(4/l0)×K×OD×N。
式中: 4——4mL反应液取出1mL;
10——反应时间10min;
K——标准曲线中OD为1时所相当的酪氨酸浓度( μg/mL)
N——酶曲的稀释倍数
蛋白酶活性定义:在一定pH值(pH3.0)和40℃温度条件下, 每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸定义为一个蛋白酶活力单位。
七、 数据处理
用表格来表示发酵过程中装料量、 碳氮比、 料水比对酶活力的影响。用表格或曲线来表示酶活力随时间的变化。
八、 思考题
影响固体发酵的因素还有哪些? 本次实验做的为单因子试验, 能否用多因子实验如正交试验法?

- 第一学期开设本实验课的班级及人数:
实验班级
生物技术05级
生物技术( 现科) 05级
生物技术及应用( 专) 06级
人数
35
44
4个班
课时数
16
16
16

- 第一学期开设本实验课的班级及人数:
实验班级
生物技术06级
生物技术( 现科) 06级
生物技术及应用( 专) 07级
人数
52
108
2个班
课时数
16
16
16

- 第一学期开设本实验课的班级及人数:
实验班级
生物技术07级
生物技术( 现科) 07级
人数
2个班30人
5个班119人
课时数
16
16

- 第一学期开设本实验课的班级及人数:
实验班级
生物技术08级
生物技术( 现科) 08级
人数
2个班57人
6个班158人
课时数
16
16

实验五 土霉素摇瓶发酵实验( 设计型实验)

一、 实验目的:
1、 熟悉放线菌的微生物学特性及培养方法
2、 了解和掌握种子制备和摇瓶发酵技术和方法
3、 了解抗生素发酵的一般规律和代谢调控理论
4、 熟悉和掌握常见的比色分析方法的操作技术
5、 掌握分光光度法测定发酵样品土霉素效价的方法
二、 实验原理
土霉素是四环类抗生素, 其在结构上含有四并苯的基本母核, 随环上取代基的不同或位置的不同而构成不同种类的四环素类抗生素。其结构和命名如图。

R1
R2
R3
R4
R5
土霉素
H
OH
CH3
OH
H
四环素
H
OH
CH3
H
H
金霉素
Cl
OH
CH3
H
H
去甲基金霉素
Cl
OH
H
H
H
多西环素
H
H
CH3
OH
H
米诺环素
N(CH3)2
H
H
H
H
美她环素
H
=CH2
-
OH
CH2(NH)CH(COOH)(CH2)4NH2

土霉素具有广谱抗菌性, 能抑制多种细菌、 较大的病毒及一部分原虫。土霉素能抑制细菌的生长, 在浓度高的时候也具有杀菌的作用。它的作用机制是干扰蛋白质的合成。由于它的毒副作用小, 因此其在医疗上用途广泛, 主要是应用于呼吸道和肠道感染。
土霉素是由龟裂链霉菌产生的, 属于放线菌中的链霉菌属, 它们具有发育良好的菌丝体, 菌丝体分支, 无隔膜, 直径约0.4～1.0米, 长短不一, 多核。菌丝体有营养菌丝、 气生菌丝和孢子丝之分, 孢子丝再形成分生孢子。而龟裂链丝菌的菌落灰白色, 后期生褶皱, 成龟裂状。菌丝成树枝分支, 白色, 孢子灰白色, 柱形。
土霉素是典型的次级代谢产物, 其发酵的特点之一就是分批过程分为菌体的生长期、 产物期和菌体期三个阶段。龟裂链丝菌的生长和土霉素的生物合成受到许多发酵条件的影响: 温度、 发酵pH值、 溶氧、 接种量、 泡沫等。同时还受到一些代谢调控机制的控制: 磷酸盐的调节作用、 ATP的调节和产生菌生长速率的调节等。
三、 仪器与材料
( 一) 培养基
1、 斜面高氏一号培养基(100mL灌装斜面若干支)
可溶性淀粉2% 氯化钠0.05%(配成1%溶液, 使用时5mL/100mL) 硝酸钾0.1% 三水磷酸氢二钾0.05%(配成1%溶液, 使用时5mL/100mL)
七水硫酸镁0.05%(配成1%溶液, 使用时5mL/100mL) 七水硫酸亚铁0.001%(配成1%溶液, 使用时0.1mL/100mL) 琼脂1.5%-2.0% pH: 7.4-7.6
2、 母瓶培养基
淀粉3%(1.5g/50mL) 黄豆饼粉0.3%(0.15g/50mL) 硫酸铵0.4%(0.2g/50mL) 碳酸钙0.5%(0.25g/50mL) 玉米浆0.4%(0.2mL/50mL) 氯化钠0.5%(0.2g/50mL) 磷酸二氢钾0.015%(配成1%溶液, 使用时0.75mL/50mL) pH: 7.0-7.2
3、 发酵培养基
淀粉15%( 7.5g/50mL) 黄豆饼粉2%(1g/50mL) 硫酸铵1.4%(0.7g/50mL) 碳酸钙1.4%(0.7g/50mL) 氯化钠0.4%(0.2g/50mL) 玉米浆0.4%(0.2mL/50mL) 磷酸二氢钾0.01% (配成1%溶液, 使用时0.5mL/50mL) 氯化钴10µg/mL(配成1mg/mL溶液, 使用时0.5mL/50mL) 消沫剂0.01% 淀粉酶0.1%-0.2%(0.1g/50mL) pH7.0-7.2
( 二) 实验菌种: 龟裂链霉菌, 本实验室保藏
( 三) 仪器: 玻璃试管( 18×180) 、 试管架8、 吸管( 1mL, 2mL, 10mL) 、 吸耳球、 离心管( 7 mL) 、 容量瓶、 烧杯、 三角瓶360个( 250 mL) 、 量筒( 250mL, 500mL, 1000mL) 、 玻璃棒、 试纸、 塑料漏斗、 电炉、 接种铲( 针) 、 恒温摇床、 恒温箱、 台秤等
四、 实验题目
1、 溶氧对土霉素发酵的影响: 取4×3个250mL的三角瓶, 培养基装量: 30mL/250mL; 40mL/250mL; 50mL/250mL; 60mL/250mL。接种后的发酵瓶于30℃恒温室摇床上摇6～7天, 转速为230转/分。测定发酵液的效价。
2、 培养基中磷量对土霉素发酵的影响: 取5×3个250mL的三角瓶, 培养基装量50mL/250mL, 培养基中磷酸二氢钾的含量分别为: 0.005 0.01%、 0.02%、 0.04%、 0.1%。培养后测定发酵液的效价。取三个平行样的平均数。
3、 接种量对土霉素发酵的影响。取5×3个250mL的三角瓶, 培养基装量50mL/250mL, 接种量分别设计为: 2%、 5%、 10%、 15%、 20%。培养后测定发酵液的效价。取三个平行样的平均数。
4、 碳源、 氮源浓度对土霉素发酵的影响: 取6×3个250mL的三角瓶, 培养基装量50mL/250mL。淀粉10%、 淀粉15%、 淀粉20% ; 黄豆饼粉1%、 黄豆饼粉2%、 黄豆饼粉3%。培养后测定发酵液的效价。取三个平行样的平均数。
五、 实验步骤
1．斜面孢子的制备
无菌条件下, 从冷藏的产生菌的斜面孢子中, 刮取适量孢子涂在高氏斜面上, 然后置36.5～37℃的恒温箱培养3天, 再置30℃的恒温室培养1天。
2． 种子的制备
( 1) 摇瓶种子培养基的配制
按母瓶培养基成分配比, 配制培养基, 并加淀粉酶液化后, 再加入CaCO3, 冷却后调pH值, 分装, 包装灭菌。
( 2) 接种
在超净工作台上, 将长好的斜面孢子用无菌接种铲挖块约2cm2, 接种于灭过菌的摇瓶种子培养基中。
( 3) 培养
将接种好的种子摇瓶于30℃恒温室摇床上, 转速为230转/分, 培养28小时左右。
3． 发酵
( 1) 发酵瓶培养基的配制
培养基配方以发酵培养基配方为基础, 依据实验题目不同而设计。摇瓶装量依据实验题目而设计。制备方法同种子瓶。
( 2) 接种
在超净工作台上, 将培养28小时的摇瓶种子接种于发酵瓶中, 接种量一般为10%或依据实验题目而设计。
( 3) 培养
将接种后的发酵瓶于30℃恒温室摇床上摇6～7天, 转速为230转/分。
六、 实验报告
写出实验方案、 具体实验方法和实验过程。
七、 思考题
1.为什么种子摇瓶培养28小时左右?
2.分析发酵培养基成分, 龟裂链霉菌发酵土霉素的碳源和氮源有哪些?
3.培养基加淀粉酶的目的是什么? 消沫剂的作用是什么? 为什么摇瓶发酵培养基能够不加消沫剂?

关于淀粉液化:
1.酶法液化原理:
淀粉的酶法液化是以α-淀粉酶为催化剂, 该酶作用于淀粉的α-1,4糖苷键, 从内部随机地水解淀粉, 从而迅速将淀粉水解为糊精及少量麦芽糖, 因此也称内切淀粉酶。淀粉受到α-淀粉酶的作用后, 其碘色反应发生如下变化: 蓝→紫→红→浅红→不显色(即碘原色)。
2.淀粉液化方法:
配制15-30％的淀粉乳, 调节pH值至6.5, 加入氯化钙(对固形物0.2％), 加入液化酶(12-20U/g淀粉), 在剧烈搅拌下, 先加热至72℃, 保温15min, 再加热至80-90℃, 并维持30-60min, 以达到所需的液化程度。

实验六 土霉素摇瓶发酵的效价测定( 设计型实验)
一、 实验原理
关于四环素族类抗生素的测定, 当前多用微生物测定法及高效液相色谱法。 可用的物理化学方法有: FeCl3 比色法、 盐酸比色法、 紫外分光光度法、 荧光法及近年内文献所报道的用流动注射分析法( FIA ) 。
土霉素化验采用可见光分光光度法测定。土霉素在酸性条件下, 能与FeCl3作用生成橙褐色的物质, 根据有色物质对光的吸收定律, 在480 nm处测定样品的吸光度, 然后对照标准浓度---吸光度曲线, 以计算土霉素的浓度。
土霉素与金属离子生成有色配位化合物
Fe2+

褐色
橙褐色
深褐色
红棕色
盐酸多西环素
盐酸土霉素
盐酸金霉素
盐酸四环素
FeCl3

二、 实验步骤
( 一) 发酵液状态观察:
粘度、 颜色、 气味、 菌丝形态
( 二) 发酵样品预处理:
发酵瓶摇匀, 将少量倒入小烧杯, 测pH。用9mol/L的盐酸溶液酸化pH至1.7-2.0搅拌10分钟。取5mL酸化液至7mL离心管, 6000转离心4分钟, 取上清液, 备测。
( 三) 发酵样品土霉素效价的测定:
采用分光光度法测定其效价。
1.土霉素标准曲线的绘制:
将土霉素标准样用0.01mol/L的盐酸配成1000u/mL的标准液。
用2mL移液管分别取标准液0.4mL、 0.8mL、 1.0mL、 1.2mL、 1.4mL、 1.6mL、 1.8mL于七支试管中, 加0.01mol/L的盐酸使全量均为10mL。再向每支试管中加0.05%( g/mL) 的三氯化铁溶液10mL, 摇匀, 静置20分钟。另取样同上, 加0.01mol/L的盐酸使全量为20mL, 摇匀, 作为空白, 在480nm的波长下测定吸光度值。以土霉素效价为纵坐标, 以吸光度值为横坐标绘制作标准曲线。
2.发酵液效价的测定:
用移液管吸取适宜稀释倍数( 使稀释后效价在标准曲线范围内) 的滤液1mL稀释液于试管中, 准确加入0.0