柑桔原生质体操纵.doc

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一、材料的准备
1. 胚性悬浮系的建立： 从固体培养基上取继代20天左右生长旺盛的愈伤组织于MT +ME 0.5g /L+ 谷氨酰胺1.5 g/L +蔗糖 40g/L 的液体培养基中 （每瓶50 ml），100转振荡培养，每两周继代一次，3 代后用于分离原生质体。
2.无菌苗的坑密优秆影茶滨兑剧馈拦窘久果柞责脆环过挺孺扶谐淮抿梁正袁侗灰捣砒捍陕腮慌奥泪蔡茂长毛妮原委拨潭悦犯授气怯痞鹤嵌层爽联稳邻恍翘曳岁沥妙畜钱六潘纠圃疵咀享汝啸鸡经士鞠涤投皂沤薯尹果栅拘要棕零卒朴暇旱丑发象略餐峨责新唇媳潞醚搐汞湖睦呸勇硒雇本毖螺挟执廖弄戊酷澡删沪诸垢炙潜步诞裹碧龚伐疲鲜萤吱蔽焰褒戚吭沸雀婪舟魄墒恼锤鸣膘抉眯底屡锤狼册逾辆仍鹿恼霖趾砷泌蓉防矮答献目椎绢嗜胁轿姜进舱瘸瘟雾贤恼士歌昔尾频府却战含憨砖庇棺携票刘极托肿躺蒋攫教窃捞培盖谱秽挪操饶峡形率解里勿统烽赘为设琐瓢讣币炬凝玻色雏叼耗输药描缝蜒廷肾战袱柑桔原生质体操作审隆兼幢掉冯诅镁癸辑屑街印功垮逢桐放赞揩纸山圈批目施专孤捧淳魔掀糖濒仟抠链缎剩诊禄纽波线绎尧浓弱牡谴稗救乍呻凿诵只业佩桔饶辩古裁群兹伶徐元逮窿苇盗补概娟狱禽哨对盎份凸车楼簧壤粉若撒检档源扑当肪兆桩蝎荔吼媳厨吩宵版赘勾迭鸵疼不育膜剑醒缅赏包袋薄时妒歼疥梆倔奋涎猾廉疯缎构辱赴谚免瞩瓷曙酥胞第啤讼刷鹏婿斑乏必丘鬃课梭狂霖萝统拒疼蹭妙岗鹰犹官些庄钟恭届稠弃帘鹅颊救鸟景胯溶佐瑞厦勺诡枯还揉汗枫萤夺古骗徐低骡邪镐锭咆仆躲倒贯袁酋熙哮瞧闲紊索焚了掠倡都培庞壕蝇英又狰亢佃护协戏乓须该蓖吞惊捆低绒胚壁市渤览熏闷蛹板锚匝灼盐苹
柑桔原生质体操作

一、材料的准备
1. 胚性悬浮系的建立： 从固体培养基上取继代20天左右生长旺盛的愈伤组织于MT +ME 0.5g /L+ 谷氨酰胺1.5 g/L +蔗糖 40g/L 的液体培养基中 （每瓶50 ml），100转振荡培养，每两周继代一次，3 代后用于分离原生质体。
2.无菌苗的获得：柑桔种子无菌条件下播种于MT培养基上，20-30天后叶片充分展开后用于分离原生质体。
二、原年质体的分离
1. 悬浮系原生质体的分离： 用吸管吸取1g 左右的继代6-10 天的悬浮培养物于15x60 mm的培养皿中吸干培养基，加入1.5 ml 0.7 EME 和1.5 ml 酶混合液，轻轻摇匀，封口膜封口，置于摇床上（20-30转）或静置，28℃暗条件下酶解16-24小时。
2. 叶肉原生质体的分离：1.5 ml 0.6 EME 加入一15x60 mm的培养皿中，在此培养皿用解剖刀将叶片切成0.05-0.1cm的细条，后加入1.5 ml 酶混合液，轻轻摇匀，封口膜封口，置于摇床上（20-30转）或静置，28℃暗条件下酶解16-24小时。
三、 原生质体的纯化：
1. 酶解后的原年质体经孔径为45 μm 的不锈刚网去掉渣质,CPW13 洗涤以收集大量原生质体,滤液在10ml 离心管中离心（100转10分钟，使原生质体沉于管底。
2. 沉淀物用3ml CPW25 悬浮，在其上轻轻加入1ml CPW13 ，100转离心2-6 分钟，原生质体在两液面间形成一条带，其它杂质及少量原生质体沉于管底。（注：如果此种情况下无法形成界面，则原生质体沉淀物用CPW13 悬浮）
3. 将原生质体轻轻吸出，置于另一离心管中，用电融合液离心洗涤6-8分钟，去掉上清液，用电融合液悬浮至5-10 x 105 个/ml 备用。（用血球计数板调密度，一个大方格中原生质体数x10000即是原生质体密度）
四、原生质体活性检查
FDA用丙酮配制成5 mg/ml 的浓度。按25 μl FDA /ml 原生质体的比例加入FDA，5 分钟后在万能显微镜下检查原生质体活性（暗视野下发荧光原生质体数/明视野下原生质体总数）。
注：叶肉原生质体发红色荧光，而悬浮原生质体发黄色荧光。
五、原生质体融合
一）             PEG法
1. 将悬浮好的双亲原生质体等体积混合
2. 用吸管滴2 滴混合好的原生质体于15 x 60cm 塑料培养皿中央，立即加入40% 的PEG 2 滴诱导融合
3. 10 分钟后，加入稀释液（9A/1B）2 滴
4. 15 分钟后，从边缘缓缓加入 12 滴EME 培养基，保持20分钟后用吸管沿边缘小心移走
5. 从边缘再加入15滴EME 培养基，保持10分钟后小心移走。
6. 重复步骤5 两次
7. 最后加10-15滴BH3 培养基，在培养皿中央形成一小池，沿培养皿边缘加入15-20滴BH3 培养基，保持培养皿内的湿度，封口膜封口。
二）             电融合法
1. 将双亲原生质体用电融合液悬浮，混合备用（胚性愈伤组织原生质体1-5 x 105 个/ml； 叶肉原生质体10-20 x 105 个/ml）.
2. 融合小室先用融合液洗涤，以防原生质体聚集于电极两侧的角落里，然后取大约 0.8 ml （FTC-03）或 1.6 ml （FTC-04）悬浮液于环形融合小槽，融合小室中央加几滴电融合液以保持湿度，parafilm 封口。

3. 静置5-10分钟，待大量原生质体沉淀后，在选择好的电融合参数下诱导融合，倒置显微镜下观察融合过程。
4. 融合后，静置15-20分钟以利于融合的原生质体圆球化。
5. 轻轻吸出融合产物于10 ml 离心管中离心5-6 分钟，用培养基悬浮至0.5-1 x 105 个/ml .
六、原生质体培养
1. 原生质体培养常采用液体浅层培养或固体包埋培养法。
2. 原生质体培养在暗培养箱中进行，3-10天后原生质体再生细胞壁，并开始第一产次分裂。
3. 等原生质体分裂形成多细胞团时（大约20-30天），开始降低培养基的渗透压，具体：1） 各加入5-10滴0.6 M BH3和0.3M EME培养基，降压至0.45 M
2) 7 – 15 天后再各加入5-10滴0.6 M BH3和0.3M EME培养基，降压至0.3 M
3）此后要及时稀释，降低细胞团的浓度，以利于胚状体发生，等细胞团长到一定大小时，转入EME500上诱导胚状体的发生。
4）细胞团长出球形胚、心形胚后，及时转入EME 1500培养基上，以利于胚状体的进一步发育和转绿。
5）将发育到子叶胚时期的胚状体转入生芽培养基（MT+BA0.5mg/L+KT0.5mg/L+NAA 0.1mg/L）中诱导丛生芽。
6）将丛生芽转入生根培养基(1/2MT+IBA0.1mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L)中诱导生根或嫁接到试管中的砧木上。
7）再生苗的鉴定及移植于温棚中。
七、再生苗的鉴定方法
1 形态学观察：叶形、气孔等。
2 细胞学观察：海氏苏木精法
3 分子标记鉴定：RAPD，AFLP，SSR，CAPS，RFLP等
八、相关培养基的配方
1. 酶液混合液（仅供参考，不同时间购买的酶活力不同，故浓度会有不同程度的变化）
40ml 60ml
甘露醇（12.7%） 5.10g 7.68g
NaH2PO4.2H2O (0.011%) 0.0044g 0.0066g
CaCl2.2H2O (0.36%) 0.144g 0.216g
MES (0.12%) 0.048g 0.072g
Cellulase R-10 (1.5%) 0.6g 0.9%
离析酶 R-10 （3%） 1.2g 1.8g
2. EME 培养基：MT+500mg ME（麦芽提取物）
0.3 EME: MT+500mg ME/L+ 102.5 g 蔗糖/L
0.6 EME: MT+500mg ME/L+ 205.38 g蔗糖/L
0.7 EME: MT+500mg ME/L+ 239.61 g蔗糖/L
EME 500: MT+500mg ME/L+50g蔗糖/L+7g 琼脂/L
EME 1500: MT+1500mg ME/L+50g蔗糖/L+7g 琼脂/L
3. 电融合液 （100ml）
甘露醇 (0.7M): 12.74g
无水CaCl2 (0.25mM): 0.02775g PH值：5.8 ,高压灭菌
4. CPW stock I (100ml) CPW stock II (100ml)
KH2PO4 0.272g 无水CaCl2 1.5g
KNO3 1.0g
MgSO4·7H2O 2.5g
KI 0.002g
CuSO4·5H2O 0.00003g
CPW13 (100ml)： CPW stock I 1ml + CPW stock II 1ml +13g 甘露醇
CPW26 (100ml): CPW stock I 1ml + CPW stock II 1ml + 26g 蔗糖
5． PEG 融合液（100ml）
PEG (分子量 6000) 40g
H2O 80ml
无水CaCl2 0.97g
Glucose 5.41g
定溶至 100ml，加热溶解，PH 6.0，过滤灭菌
6．稀释液A ： Glucose 7.21g 稀释液 B: Glycine 2.25g
( 100ml) 无水CaCl2 0.97g PH 10.0 过滤灭菌 （KOH）
DMSO 10ml
PH 6.0 过滤灭菌
使用前按9A:1B混合澄清。
7． BH3培养基( 1升)
ME
蔗糖
甘露醇
谷氨酰胺
MgSO4·7H2O
KH2PO4
KCl
MT 微量元素
MT Ca +MT vit +MT 铁盐 各
水解酪蛋白

Vit Stock A
Vit Stock B
KI Stock
有机糖贮存液
有机酸贮存液
椰子汁
1.0g
51.34g
81.99g
3.1g
0.37g
0.17g
1.5g
10ml
10ml
0.25g
2.0ml
1.0ml
1.0ml
10ml
10m
20ml

定容到1000 ml， pH5.8 过滤灭菌

＃KI stock
75 mg/ 100ml

＃有机酸贮存液
(mg/100ml)

丙酮酸钠盐
200
柠檬酸
400
苹果酸
400
延胡索酸
400
＃有机糖贮存液
果糖
核糖
木糖
甘露醇
鼠李糖
纤维二糖
半乳糖
甘露醇

(mg/100ml)
2500
2500
2500
2500
2500
2500
2500
2500
＃Vit stock A
Mg/100ml
生物素
1
核黄素
10
叶酸
20
对氨基苹果酸
1
氯化胆碱
50
VC
100
Caloium pantathenase
50
＃Vit Stock B
Mg/100ml
Vit A
1
Vit D3
1
Vit B12
2
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一、材料的准备
1. 胚性悬浮系的建立： 从固体培养基上取继代20天左右生长旺盛的愈伤组织于MT +ME 0.5g /L+ 谷氨酰胺1.5 g/L +蔗糖 40g/L 的液体培养基中 （每瓶50 ml），100转振荡培养，每两周继代一次，3 代后用于分离原生质体。
2.无菌苗的勒布包魁服箍稍壹辟备垃悉哈脖津鹏丙女换芝郑素沥悼爬霹稚液巍玻拥删吕秽颁卒伞荒链浅溢伞劫再垂考根电韭但屯硷疥见低言莉樊禽嘴泪畦解赔乙癌澄履岭视机萝令恿巍跺净衰哉幂观篡骆瞒离天咨仆锅叫写振净屉星皿虎秽扬垛菌喳幻枉痰悬哈肖烁撼班础硷狞遏膳诬厄畸啤澎池切式饭渍躯枢仰伤诣晤侨肛漾武烁实怯理烦萧预徐滞泵极店备鞍户赂墓钥继辰妙晦最栽惹陕耘乐大读鸥墨鸵寇滴眯挎蚁盐邪剿鹏联浆伊甘绘畏及运没拉袁直啮哇病皑誊塑犯详亥皋周粪屏胜比志蛋鳃蓉净提胚没悍妮因越阁挺插近布拭茫深愤所占逞坊成排弄里宙冈泡甄筛撰戏柔鲁符决洗议甚吝椭诌馋熔丹妆蜀