变性梯度凝胶电泳.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,变性梯度凝胶电泳,变性梯度凝胶电泳,第1页,变性梯度凝胶电泳,(denatured gradient gel electrophoresis,，,DGGE),最初是,Lerman,等人于,20,世纪,80,年代早期创造，起初主要用来检测,DNA,片段中点突变。,Muyzer,等人在,1993,年首次将其应用于微生物群落结构研究。以后又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（,temperature gradient gel electrophoresis,，,TGGE,）。,今后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究各个领域，当前已经发展成为研究微生物群落结构主要分子生物学方法之一。,变性梯度凝胶电泳,(DGGE),变性梯度凝胶电泳,第2页,变性梯度凝胶电泳（,DGGE,）,:,一个分离相同大小,DNA,片段电泳方法。即双链,DNA,在变性剂,(,如尿素或甲酰胺,),浓度或温度梯度增高凝胶中电泳，随变性剂浓度升高，因为,Tm,值不一样，,DNA,一些区域解链，降低其电泳泳动性，造成迁移率下降，从而到达分离不一样片段目标。,因为各类微生物（如细菌和古细菌）,16sRNA,基因序列中可变区碱基次序有很大差异，其中不一样土壤微生物,16sRNA,基因,V3,区扩增,DNA,片断在,DGGE,中应用最为广泛，依据电泳条带多寡和条带位置能够初步区分出样品中微生物种类多少，粗略分析土壤样品中微生物多样性。,变性梯度凝胶电泳,(DGGE),变性梯度凝胶电泳,第3页,环境样品基因组,DNA,提取,目标片段,PCR,扩增,DGGE,图谱分析,图像采集和条带回收,DGGE,分析,电泳前准备工作,电泳分析,剥胶、染色,DGGE,条带测序,DGGE,分析微生物群落主要步骤,变性梯度凝胶电泳,第4页,总,DNA,提取是,DGGE,研究微生物群落基础。适合,DNA,提取方法对环境样品微生物群落结构分析非常主要。,适合,DNA,提取方法考量：,DNA,得率。能否进行,PCR,扩增以及扩增重复性制备,DNA,花费时间长短。,关于,DNA,提取提议：,优先考虑基于原位裂解方法，依据实际情况采取酶解,/,酚氯仿抽提法，或者,DNA,提取试剂盒（提议购置,Qiagen,企业相关产品）。,环境样品基因组,DNA,提取,变性梯度凝胶电泳,第5页,选择适合目标片段，设计适当引物，注意有,GC,夹子情况下引物二聚体行程。,环境样品目标片段扩增最好采取槽式,PCT,其次选,Touch down PCR,。,注意,PCR,环境，,V3,区产物扩增极易污染。,目标片段,PCR,扩增,变性梯度凝胶电泳,第6页,细节决定成败！,DGGE,分析,变性梯度凝胶电泳,第7页,从这一步开始，带上手套。,配置试剂时一定要用去离子水，能够配置不一样梯度变性溶液备用，注意变形溶液中大颗粒过滤及脱气。,制胶洗膜时用各个容器要用去离子水洗涤洁净，以预防氯离子污染。,灌胶前准备好全部需要东西，试剂、枪头，甚至物品摆放位置。,制胶是试验关键，在往玻璃板中灌胶时要匀速地转动滑轮，将凝胶液匀速地灌入玻璃板。,灌胶后立刻清洗注射器，以防丙烯酰胺凝固，堵塞管子。,DGGE,前准备工作,变性梯度凝胶电泳,第8页,DGGE,制胶主体部件：,变性梯度凝胶电泳,第9页,变性梯度凝胶电泳,第10页,上样胶孔要用去离子水冲洗洁净并吸干。,PAGE,胶装入电泳支架时注意用去离子水润滑橡胶垫。装入后在胶孔中加入缓冲液。,上样时上样器要深入胶孔底部。,尽可能在同一个胶上比较全部样品，将胶放入电泳槽中时注意正负极。,提议低电压电泳一段时间，在样品完全进入胶中之后再升电压。,电 泳,变性梯度凝胶电泳,第11页,停顿电泳后注意把电泳仪调零之后在关闭电源,剥胶需要细致，用好去离子水和保鲜膜。,染色前做好胶样品次序标识。,银染、,EB,染色和,SYBRGreen,染色。,剥胶与染色,变性梯度凝胶电泳,第12页,垂直电泳,凝胶变性梯度确实定,变性梯度凝胶电泳,第13页,取得高质量,DGGE,图谱。,DGGE,条带回收,注意紫外条件下操作安全。,尽可能降低,DNA,在紫外下照射时间。,不一样长度目标片段从切胶条带中回收。,测序注意关键点,回收条带,DNA,在,PCR,扩增后，一定要克隆,确认克隆与母条带能够跑到同一个位置后，再送去测序,每个条带最少测,3,个克隆,图像采集和条带回收,变性梯度凝胶电泳,第14页,DGGE,图谱聚类分析、相同性分析,DGGE,图谱分析,变性梯度凝胶电泳,第15页,DGGE,图谱主成份分析,变性梯度凝胶电泳,第16页,DGGE,图谱数字化,Quantity one,变性梯度凝胶电泳,第17页,用,Quantity One,（,Bio-Rad,，,USA,）软件对,DGGE,图谱进行数字化处理。按照以下公式计算多样性指数（,Shannon-Wiener index,）,其中，,s,代表每泳道中条带数量；,Pi,为泳道中第,i,条带灰度（,height of the peak,）占该泳道总灰度百分比。,菌群均匀度（,evenness,，,E,）：,E=H/Hmax,，,Hmax=ln S,多样性指数计算,变性梯度凝胶电泳,第18页,