呋喃唑酮快速检测试剂盒说明书样本.doc

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呋喃唑酮代谢物( AOZ) 快速检测试剂盒说明书

一、 原理
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测水产和鸡肉等组织样本中的AOZ, 在微孔条上预包被上偶联抗原, 利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的原理来进行的, 样本中的AOZ和微孔条上预包被偶联抗原竞争抗呋喃唑酮代谢物的衍生物抗体, 加入酶标记物后, 用TMB底物显色, 样品中的AOZ含量与样品的吸光度值呈反比, 与标准曲线比较即可得出呋喃唑酮代谢物含量。
二、 试剂盒技术指标:
试剂盒灵敏度: 0.05ppb
样本检测下限
组织( 鸡/鸭/猪/牛/羊/鱼/虾肉) —---——0.1ppb
肝脏( 鸡/鸭/猪/牛/羊肝脏) --------———0.1ppb
蜂蜜、 牛奶、 肠衣--------------------------—0.1ppb
鱼/虾等水产品组织因存在一定的干扰,
检测下限为0.2ppb
交叉反应率:
呋喃唑酮代谢物————————————100%
呋喃它酮代谢物———————————﹤0.1%
呋喃妥因代谢物———————————﹤0.1%
呋喃西林代谢物———————————﹤0.1%
回收率:
组织、 肝脏……………………………90%±10%
蜂蜜、 牛奶、 肠衣……………………75%±15%
三、 试剂盒组成
1、 微量测试孔: 每条8孔, 一板12条
2、 标准液X6瓶: ( 1ml/瓶) 0ppb、 0.05ppb、 0.15ppb、 0.45ppb、 1.35ppb、 4.05ppb
3、 酶标记物 12ml………………………红色帽
4、 抗体工作液 7ml………………………蓝色帽
5、 底物A液 7 ml………………………白色帽
6、 底物B液 7 ml………………………黑色帽
7、 终止液 7 ml………………………黄色帽
8、 20X浓缩洗涤液40 ml…………………白色帽
9、 2X浓缩复溶液 50 ml…………………透明帽
10、 衍生化试剂 10ml …………………白色帽
四、 所用仪器、 试剂
具备的仪器: 微孔酶标仪、 打印机、 均质器 、 氮气吹干装置、 振荡器、 离心机、 刻度移液管、 天平( 感量0.01g)
微量移液器: 单道20µl-200µl, 100µl-1000µl、 多道250µl
试 剂:
氢氧化钠、 乙酸乙酯、 正己烷、 浓HCl、 磷酸氢二钾( 所有样本使用)
亚硝基铁氰化钾( K2Fe( CN) 5·NO·3H2O) 、
ZnSO4·7H2O( 奶样专用)
五、 样本前处理步骤
样本处理前须知
处理任何样本时, 都必须注意:
( a) 本试剂盒所检测的组织样本包括: 动物组织、
禽类和水产组织。eg:鸡、 鸭、 牛、 兔、 鱼、 虾等。
( b) 实验中必须使用一次性吸头, 在吸取不同的试剂时要更换吸头。
( c) 实验之前须检查各种实验器具是否干净, 必要时可对实验器具进行清洁, 以避免污染干扰实验结果。
样本前处理需配制:
配液1: 用去离子水将2×浓缩复溶液按1: 1 稀释, 用于提取后的样本复溶
配液2: C液: ( 供奶样用) 称12.5g亚硝基铁氰化钾用去离子水定溶至100ml。
D液: ( 供奶样用) 称29.8g 硫酸锌用去离子水溶解定溶至100ml。
配液3: 0.1MK2HPO4 称22.8g K2HPO4·3H2O
加去离子水溶解定溶至1L
配液4: 1M HCl取8.6ml浓HCl加水定溶至100ml。
配液5: 1M NaOH称取4g NaOH加水定溶至100ml。
样本的处理方法:
(a) 奶样
1、 取出5ml的奶样本到玻璃离心管中,分别加入C液和D液各250µl。
2、 用振荡器充分混合样本,用恒温离心机4000r/min以上离心10min(4-12℃).若没有恒温离心机,则先将样本降温至大约8℃,然后离心。
3、 接(b)的描述方法

(b) 组织、 蜂蜜、 肠衣、 肝脏
1、 取1±0.05g的均质样本(组织、 蜂蜜、 肠衣、
肝脏), 牛奶的离心上清液1.1ml( 相当1ml
奶样) , 分别加入4ml的去离子水, 0.5ml1M
HCl和100µl衍生化试剂, 充分振荡。
2、 置于37℃过夜孵育( 大约16h) 或56℃水浴中孵育(2h);
3、 分别加入5ml 0.1M K2HPO4, 0.4 ml 1M
NaOH和5ml乙酸乙酯, 充分振荡5min;
4、 在室温下( 20-25℃) 4000r/min以上离心
10min。
5、 取出2.5ml的乙酸乙酯到另一洁净容器中
于50℃氮气/空气吹干。
6、 用1ml正己烷溶解干燥物, 用1ml已稀释
好的复溶液充分混合30s; 在室温下( 20-25℃)
4000r/min以上离心10min。
7、 取50µl下层相用于分析。
样本稀释倍数: 2
六、 酶标免疫分析程序
1、 从4℃冷藏环境中取出所需试剂, 置室温( 20-25℃) 平衡30min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、 取出需要数量的微孔及框架, 将不用的微孔放入自封袋, 保存于2-8℃。
3、 配液: 将40ml浓缩洗涤液( 20倍浓缩) 用去离子水按照1: 19稀释( 1份浓缩洗涤液+19份去离子水) , 或按所需用量配制洗涤液。
4、 编号: 将样本和标准品对应微孔按序编号, 每个样本和标准品做2孔平行, 并记录标准孔和样本孔所在的位置。
5、 加标准品/样本 50µl/孔到各自的微孔中, 然后加抗体50µl/孔, 用盖板膜封板, 轻轻震荡混匀。25℃环境中反应1h。
6、 取出将孔内液体甩干, 用洗液250µl/孔洗板4-5次, 每次间隔15-30秒, 用吸水纸拍干( 拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破) 。
7、 每孔加入酶标记物100µl, 盖板膜盖板后置25℃环境中反应30min。将孔内液体甩干, 用洗涤液充分洗, 4-5遍( 同上) , 用吸水纸拍干( 拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破) 。
8 显色: 每孔加入底物A液50µl, 再加底物B液50µl, 轻轻振荡混匀, 25℃环境中避光显色30min。
9、 测定: 每孔加入终止液50µl, 轻轻振荡混匀, 设定酶标仪于450nm处( 建议用双波长450/630nm检测, 在5min内读完数据) , 测定每孔OD值。
七、 结果判定
结果判定有两种方法, 粗略判定可用第1种方法, 定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与AOZ的含量成负相关。
1、 粗略判定:
用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含AOZ浓度范围( ng/ml) 。假设样品1的吸光度值为0.268, 样品2的吸光度值为1.230, 标准液吸光度值分别是: 0ppb为1.671; 0.05ppb为1.425; 0.15ppb为1.103; 0.45ppb为0.567; 1.35ppb为0.205; 4.05ppb为0.104。则样品1的浓度范围是0.45ppb-1.35ppb; 样品2的浓度范围是0.05ppb-0.15ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中AOZ实际浓度。
2、 定量判定:
所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值( B) 除以第一个标准( 0标准) 的吸光度值( B0) 再乘以100%, 即百分吸光度值。
百分吸光度值( %) ＝
B
×100%
B0
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值
以标准品百分吸光率为纵坐标, 以AOZ标准品浓度( ng/ml) 的半对数为横坐标, 绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中, 从标准曲线上读出样本所对应的浓度, 乘以其对应的稀释倍数即为样本中AOZ实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算, 更便于大量样品的准确、 快速分析。
八、 注意事项
1、 用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。
2、 用之后立即将所有试剂放回2-8℃冰箱。
3、 在ELISA分析中的再现性, 很大程度上取决于洗板的一致性, 仔细按照推荐的洗板顺序操作是ELISA测定程序中的要点。
4、 所有恒温孵育过程中, 避免光线照射, 用盖板膜封住微孔板。
5、 室温低于20℃或试剂及标本没有回到室温( 20-25℃) 会导致所有标准的OD值偏低。
6、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况, 则会伴随着出现标准曲线不成线性, 重复性不好的现象。因此洗板拍干后应立即进行下一步操作。
7、 混合要均匀, 否则会出现重复性不好的现象。
8、 反应终止液为2M硫酸, 避免接触皮肤。
9、 不要使用过了有效日期的试剂盒, 稀释或搀杂使用会引起灵敏度、 OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。
10、 不用的微孔板放进自封袋密封; 标准物质和无色的发色剂对光敏感, 因此要避免直接暴露在光线下。
11、 显色液若有任何颜色表明变质, 应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5时, 表示试剂可能变质。
12、 该试剂盒最佳反应温度为25℃, 温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
九、 储藏条件和保质期
储藏条件: 试剂盒于2-8℃保存, 不要冷冻。
保 质 期: 该产品有效期为1年, 生产日期见包装盒。

提示: 酶标板真空包装袋若有漏气, 酶标板依然正常有效, 不影响实验结果, 请放心使用。