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实验三酶联免疫吸附试验(ELISA.pptx

1、Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,试验五 1.酶联免疫吸附试验(ELISA)2.补体结合反应,实验三酶联免疫吸附试验(ELISA,第1页,1.酶联免疫吸附试验(ELISA),实验三酶联免疫吸附试验(ELISA,

2、第2页,免疫标识技术,定义:,将抗原-抗体反应与标识技术相结合,用,放射性同位素、酶或荧光素,标识已知抗体或抗原,经过检测标识物,间接测定未知抗原或抗体。,分类:,放射免疫测定法:,131,I,,32,P,免疫荧光技术:FITC,PE,免疫酶测定法:HRP,AP,实验三酶联免疫吸附试验(ELISA,第3页,免疫酶测定法,(,E,nzyme,I,mmuno,A,ssay,EIA),用酶标识抗原或抗体进行抗原抗体反应。,辣根过氧化物酶(HRP),碱性磷酸酶(AP),特点:,高度特异性:保持抗原抗体反应特异性,高灵敏度:酶催化底物显色高效性,pg水平微量检测,定性定量检测:反应液颜色深浅或光密度值,

3、分类:,酶联免疫吸附试验:可溶性抗原或抗体,酶免疫组化法:组织中或细胞表面抗原。,实验三酶联免疫吸附试验(ELISA,第4页,酶联免疫吸附试验,(,E,nzyme-,L,inked,I,mmuno,S,orbent,A,ssay,ELISA),用酶标识抗原或抗体检测液体(血液、细胞液)中未知抗体或抗原方法。,1.定义,2.分类,间接法(Indirect ELISA):,将已知抗原吸附于固相载体,酶标识二抗,检测液相中未知抗体,双抗体夹心法(Sandwich ELISA):,将已知抗体吸附于固相载体,酶标识一抗,检测液相中可溶性抗原,竞争法(Competitive ELISA):,将已知抗体或抗

4、原吸附于固相载体,酶标识抗原或抗体,检测液相中可溶性抗原或抗体,实验三酶联免疫吸附试验(ELISA,第5页,酶联免疫吸附试验,(,E,nzyme-,L,inked,I,mmuno,S,orbent,A,ssay,ELISA),3.原理,(以间接性ELISA为例),:,显色,实验三酶联免疫吸附试验(ELISA,第6页,试验内容:,间接法测定溶血素 定性检测,实验三酶联免疫吸附试验(ELISA,第7页,试验材料,脱纤维绵羊红细胞,抗原,兔抗绵羊红细胞抗体(溶血素),待测兔血清,HRP标识羊抗兔IgG,二抗,包被缓冲液:0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液,洗涤液:含0.05%Tween 200.01

5、M pH7.4 PBS,底物缓冲液:pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液,底物溶液:OPD 10mg,底物缓冲液25ml,30%H,2,O,2,40L,酶标板,酶标仪,实验三酶联免疫吸附试验(ELISA,第8页,试验方法,1.抗原处理:,脱纤维绵羊血,加3mL N.S,混匀,rpm,5min,加3mL N.S,混匀,rpm,5min,取2mL压积红细胞,加入2mL蒸馏水,震荡破碎红细胞,用包被缓冲液稀释成1:400备用,2.包被抗原:,取酶标板,加入100L/孔抗原稀释液,4,湿盒内,18h,实验三酶联免疫吸附试验(ELISA,第9页,取出包被好抗原酶标板(4孔/组),甩干孔内液体,以洗涤液(200L

6、/孔)洗涤3次,3min/次,3.加待测血清,标识各孔,加入对应液体100L/孔,1,2,3,4,阴性,空白,阳性,待测,4.加二抗:,37,湿盒内,30min,甩干孔内液体,以洗涤液(200L/孔)洗涤3次,3min/次,各孔加入酶标二抗100L/孔,37,湿盒内,30min,5.显色:,甩干孔内液体,以洗涤液(200L/孔)洗涤3次,3min/次,加入底物溶液100L/孔,避光显色,10min,6.观察结果,试验方法,实验三酶联免疫吸附试验(ELISA,第10页,预期结果,阳性:显色为黄色,阴性:无色,1 2 3 4,阴性,阴性,阳性,阳性,实验三酶联免疫吸附试验(ELISA,第11页,注

7、意事项,洗涤彻底,防止交叉污染。,按次序加样,孔底无气泡。,包被和温育在湿盒内进行。,实验三酶联免疫吸附试验(ELISA,第12页,2.补体结合反应,(Complement fixation Test,CFT),实验三酶联免疫吸附试验(ELISA,第13页,概念:,补体结合反应:,是指在,补体,参加下,以绵羊红细胞(SRBC)和溶血素(抗SRBC抗体)作为,指示系统,抗原抗体反应,。,实验三酶联免疫吸附试验(ELISA,第14页,补反中包含,两个系统,五种成份:,待检系统:已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及仅供一组Ag-Ab系统反应定量补体。,指示系统:绵羊红细胞和溶血素。,原理:,实验三酶联免

8、疫吸附试验(ELISA,第15页,待测系统,抗原+未知血清,1,2,补体,1,2,Step 1,抗原抗体复合物形成,Step 2,补体结合和耗竭,指示系统,SRBC+抗SRBC抗体,Step 3,SRBC裂解,1,2,1:No Ab;,2:Ab,实验三酶联免疫吸附试验(ELISA,第16页,Ag,Y,待测血清,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Ab,阳性,No Ab,阴性,Ag,Ag,Ag,实验三酶联免疫吸附试验(ELISA,第17页,抗原:伤寒菌裂解产物,待测血清:56,30min,补体:豚鼠血清,2%绵羊红细胞,溶血素,材料:,实验三酶联免疫吸附试验(ELISA,第18页,方法:,1,2,3

9、4,5,试验管,血清,对照管,抗原,对照管,补体,对照管,SRBC,对照管,待测血清,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.4mL,0.8mL,抗原,补体,N.S,摇匀,37,水浴15min,溶血素,SRBC,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,摇匀,37,水浴15min,(1份/2人),实验三酶联免疫吸附试验(ELISA,第19页,预期结果:,1管内液体混浊呈浅红色为不溶血,管内液体透明呈红色为溶血。,溶血,不溶血,2.,试验管,血清对照管,抗原对照管,补体对照管,SRBC对照管,?,溶血,溶血,溶血,不溶血,实验三酶联免疫吸附试验(ELISA,第20页,绵羊红细胞用前应轻晃混匀,不可猛烈震荡。,各种试剂吸管不可混用。,注意事项:,实验三酶联免疫吸附试验(ELISA,第21页,

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