双水相体系萃取纤维素酶的研究.doc

FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
食 品 科 技
2010年 第 35卷 第 12
期

纤维素酶是具有纤维素降解能力酶的总称, 其应用非常广泛,如蔬菜加工,果汁及粮食加工 、 天然有效成分的提取 、 饲料 、 造纸 、 纺织工业 、 采油工程 、 废水处理以及能源制造等方面 [1-3]。 目前 纤维素酶的分离纯化多采用盐析 、 凝胶色谱等方法 。
双水相体系萃取具有条件温和,产品活性损 失少,处理量大,设备投资小,操作简单,易于 放大及连续操作等优点,广泛应用于蛋白质 、 酶 、 核酸及多糖等生物大分子的分离纯化 [4]。 本课题以商 业粗酶制剂为酶源,研究 PEG 浓度 、 硫酸铵浓度
及 pH 对 PEG4000/(NH4 2SO 4双水相体系萃取纤维 素酶的影响,以确定合适的萃取条件 。 1材料和方法 1.1
材料
纤维素酶:杭州绿柔生物科技有限公司;羧 甲基纤维素钠:上海精析化工科技有限公司;聚 乙二醇 4000:天津科密欧化学试剂开发中心 。 1.2方法 1.2.1
纤维素酶活力测定
以柠檬酸 -硫酸氢二钠
Extraction of cellulase by aqueous two-phase system
SHU Guo-wei, WANG Chang-feng, CHEN He, YANG Zhi-wei
(Collegeof Life Science and Engineering, Shaanxi University of Science and
Technology, Xi'an 710021
Abstract:The effects of concentration of polyethylene glycol, ammonium sulfate and pH on extraction of
cellulase from industrial cellulase in aqueous two-phase system of PEG -4000and ammonium sulfate were studied. The results show that:The conditions of aqueous two -phase systems extraction are as folows:concentration of (NH4 2SO 4is 8%, concentration of PEG400026%, pH4.8, The partition coefficient K and the recovery rate were 5.21and 79.4%respectively.
Key words:cellulase; aqueous two-phase systems; partition coefficient
舒国伟 , 王长凤 , 陈
合 , 杨志伟
(陕西科技大学生命科学和工程学院,西安 710021
摘要 :研究了聚乙二醇 4000-硫酸铵 (PEG4000/(NH4 2SO 4 双水相体系中, PEG 浓度 、 硫酸铵浓度
及 pH 对从商品纤维素酶样品中萃取纤维素酶的影响 。 结果表明:双水相体系的质量组成为 (NH4 2SO 48%, PEG400026%, pH4.8时,分配系数 K 为 5.21,萃取率为 79.4%。
关键词 :纤维素酶;双水相;分配系数 中图分类号 :O 658.2
文献标志码 :A
文章编号 :1005-9989(201012-0191-03
双水相体系萃取纤维素酶的
研究
收稿日期 :2010-04-15
基金项目 :陕西省科技攻关项目 (2007JK01-13-2;咸阳市科技攻关项目资助 (K0311-2。 作者简介 :舒国伟 (1977— ,男,四川内江人,硕士,讲师,研究方向为功能性食品及酶工程 。
提取物和应用
·191
·
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2010年 第 35卷 第 12
期

(0.2mol/L, pH4.4 缓冲液配制 0.625%CMC-Na 底 物溶液 。 取 0.5mL 酶液和 2.5mL 底物溶液 50℃ 水浴保温 30min ,测定反应后还原糖含量,同时 做空白对照 。 酶活定义为在上述条件下, 1h 产生 1mg 葡萄糖的酶量为 1个酶活力单位 (U[5]。 1.2.2双水相萃取 参考文献 [6]。 1.2.3萃取率的计算 [7]
y=RK/(1+RK
式中:y 为萃取率;
R 为相比, R=Vt /Vb , V t 和 V b 分别是上 相和下相的体积;
K 为纤维素酶的分配系数, K=Ct /Cb , C t 和 C b 表示上下相的酶活 。
2
结果和分析
分别取不同体积的标准葡萄糖液于 25mL 比 色管中,加水至 1.0mL ,再加入 3mL DNS 溶液 。 在沸水浴中蒸煮 5min ,立即冷却,定容后摇匀, 以不加葡萄糖的溶液作对照,在 500nm 测定其 测吸光度,以葡萄糖浓度对吸光度作图,结果见 图 1。
由图 1可知,标准曲线方程为:y=0.2447x-0.1367,相关系数 R 2=0.9972,即在 1~3.5mg/mL
范围内葡萄糖浓度和吸光度有着良好的线性关系 。 2.1盐浓度对相比 R(Vt /Vb 影响
在 聚 乙 二 醇 PEG4000/(NH4 2SO 4双 水 相 体 系 中,当 PEG 浓度为 18%, pH4.8, T=20℃ 条件下 进行,不同浓度 (NH4 2SO 4下相比 R 变化见图 2。
由图 2可知,在聚乙二醇 PEG4000/(NH4 2SO 4
双水相体系中 。 当聚乙二醇 PEG 浓度保持一定条 件下,相比 R(上相体积 /下相体积 随硫酸铵盐用量 增加而减小 。
2.2PEG 浓度对相比 R 的影响
在 聚 乙 二 醇 PEG4000/(NH4 2SO 4双 水 相 体 系 中, 当 (NH4 2SO 4浓度为 16%, pH4.8, T=20℃ 条件 下进行,不同浓度 PEG 下相比 R 变化见图 3。
由图 3可知,在聚乙二醇 PEG2000/(NH4 2SO 4
双水相体系中 。 当 (NH4 2SO 4浓度保持一定条件下, 相比 R上相体积 /下相体积 随聚乙二醇用量增加 而增大 。 由萃取率 y=RK/(1+RK可知,为了提高萃 取率,需要同时考虑分配系数 K 和相比 R 这 2个 参数 。
2.3(NH4 2SO 4浓度对萃取的影响
在 聚 乙 二 醇 PEG4000/(NH4 2SO 4双 水 相 体 系 中,当聚乙二醇 PEG 浓度为 18%, pH4.8, T=20℃ 条件下进行, (NH4 2SO 4浓度分配系数 K 和萃取率 y 的影响见图 4。
由图 4可知,在 8%~12%(NH4 2SO 4浓度范围 内,分配系数 K 和萃取率 y 随 (NH4 2SO 4浓度升高 而减小 。 (NH4 2SO 4浓度在 12%~20%范围内,分配 系数 K 和萃取率 y 随 (NH4 2SO 4浓度升高而升高, 所以在 (NH4 2SO 4浓度为 12%时,分配系数 K 和萃 取率 y 最小 。 由于 (NH4 2SO 4的加入,双水相体系 中离子浓度也增大,离子在两相分配情况发生变 化,当双水相达到平衡时,双水相必须保持电中 性,因此在两相间会形成电位差,而电位差的大
0.80.60.40.201
1.5
22.53
3.5
y=0.244x-0.1367R 2=0.9972
葡萄糖浓度 /(mg/mL
A 540n m
图 1葡萄糖标准曲线
2.521.510.50
8
121620
(NH4 2SO 4/(%,w/w
相 比 R 图 2盐浓度对相比 R 的影响
3.5
32.521.510.50
1216
1822
26
相 比 R
PEG4000浓度 /%
图 3EG4000浓度对相比 R 的影响
4.5
43.532.521.51分 配 系 数 K
8
121620
(NH4 2SO 4浓度 /%
0.770.760.750.740.730.720.710.7
萃 取 率 y
分配系数 K 萃取率 y
图 4(NH4 2SO 4浓度对萃取的影响
提取物和应用
·192
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小直接影响到分配系数 K 和萃取率 y 。 但盐浓度不 能过高,否则,会破坏纤维素酶表面的水化层, 纤维素酶在下相发生盐析,使分配系数 K 和萃取 率 y 下降 。 2.4
PEG4000浓度对萃取的影响
在 聚 乙 二 醇 PEG4000/(NH4 2SO 4双 水 相 体 系
中,当 (NH4 2SO 4浓度为 16%, pH4.8, T=20℃ 条件 下进行,不同浓度 PEG 对分配系数 K 和萃取率 y 的影响见图 5。
由图 5可知,当在 PEG 浓度为 26%时,分配 系数 K 和萃取率 y 为最大 。 出现这种原因主要是 因为在 (NH4 2SO 4浓度一定下, W PEG 较低时,接近 临界点,不易形成双水相,所以分配系数 K 和萃 取率 y 比较小 。 随着 PEG 浓度的增大,系统远离 临界点,两相差别较大,易于形成两相 , 分配系数 K 和萃取率 y 增大 。 2.5
pH 对萃取的影响
双水相体系萃取纤维素酶在 PEG 质量分数为
22%, (NH4 2SO 418%, pH4.8, T=20℃ 条件下进行, pH 对分配系数和萃取率的影响见图 6。
从图 6可知,在 pH4.5~6.5范围内, pH 对分 配平衡系数 K 和萃取率 y 的影响均显著,说明此 双水相系统萃取纤维素酶可在较宽的 pH 范围内 进行 。 3
结论
双水相体系萃取纤维素酶的条件为:(NH4 2SO 4
浓度为 8%, PEG4000为 26%, pH4.8,在此条件 下,分配系数 K 为 5.21,萃取率为 79.4%。
参考文献 :
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制剂 [S][6]
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分配系数 K 萃取率 y
12

5.554.543.532.521.5
分 配 系 数 K
0.85
0.80.750.70.65
0.6
萃 取 率 y
PEG4000浓度 /%
图 5PEG4000浓度对萃取的影响
分配系数 K 萃取率 y
5.554.543.532.521.51
4.5
5.0
5.56.0
6.5
0.7750.770.765
0.760.7550.75
分 配 系 数 K
萃 取 率 y
pH
图 6pH 对萃取的影响
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