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低温诱导植物细胞染色体数目加倍
一、 实验目的
1． 了解人工诱导植物多倍体的原理、方法及其在植物育种中的作用。
2． 应用植物染色体制片技术，鉴别诱导后染色体数目变化。
3． 学会探究性实验的设计方法。
二、 实验原理
通过低温阻碍细胞内酶促反映的进行，从而导致细胞分裂时形成纺锤体所需ATP的供应途径受阻，使细胞分裂过程中完成染色体加倍而细胞不能分裂，达到染色体数目加倍。
从理论上讲，观察染色体数目的最佳时期是分列中期，可当纺锤体的行成受到抑制时，细胞分裂就停止在了前期，不再出现中期、后期，只有当细胞分裂进入到第二周期的中期时，才能确保低温诱导染色体数目变化的成功。因此，低温处理的时间至少要有一个半周期的时间。低温抑制了纺锤体的形成，同时也降低了酶的活性，细胞分裂的速度减慢，细胞周期会延长。
三、 实验仪器与试剂
1. 材料：蚕豆 2.试剂：秋水仙素 3.仪器：超低温冰箱
四、 实验步骤与方法
（1） 培养根尖 蚕豆种子于 30℃ ～ 40℃水浴中浸种 3 ～ 4h 后，取出放入带有湿润纱布的培养皿中于10℃ 培养，每 2d 换一次水。注意水要浸过蚕豆种子体积的 1/3。
(2)低温诱导处理 待实验材料长出约 1cm 左右根时，将实验材料平均分两组: 实验组于 2℃的冰箱中进行低温诱导培养 36h 后( 换水时注意用 2℃的水，减小实验的误差) ，于 15℃ ～20℃恢复常温培养 10 ～12h( 即小于实验材料一个细胞周期的时间) 。对照组于15℃ ～ 20℃ 常温进行培养，注意经常换水。
(3)取材、固定、解离、漂洗与染色 常规“植物细胞有丝分裂”制片方法［1］。
(4)显微观察与数据统计分析 随机观察并统计10 个视野中分裂期与非分裂期细胞，计算分裂指数( mitotic index，MI) 。细胞分裂指数 = 分裂期细胞数/全部细胞数 ×100%。统计数据进行卡方检验。
五、 实验记录
( 1) 培养根尖 蚕豆种子于 30℃ ～ 40℃水浴中浸种 3 ～ 4h 后，取出放入带有湿润纱布的培养皿中于10℃ 培养，每 2d 换一次水。注意水要浸过蚕豆种子体积的 1/3。
(2)低温诱导处理 待实验材料长出约 1cm 左右根时，将实验材料平均分两组: 实验组于 2℃的冰箱中进行低温诱导培养 36h 后( 换水时注意用 2℃的水，减小实验的误差) ，于 15℃ ～20℃恢复常温培养 10 ～12h( 即小于实验材料一个细胞周期的时间) 。对照组于15℃ ～ 20℃ 常温进行培养，注意经常换水。
3.取材：待蚕豆根尖长至2cm时取其根尖顶端（0.5-1cm）
4.预处理:将取下的根尖置于盛有对二氯笨饱与水溶液的青霉素瓶中，浸泡处理3-4 h。
5.固定：经过预处理的根尖，用水清洗，用甲醛-冰醋酸3：1）固定溶液固定6-24h,固定材料可转入70%酒精中，于4℃冰箱中保存备用。
6.解离：倒去固定液，用蒸馏水漂洗2-3次。
7.染色：将根尖放在载玻片上，切下顶端1-2mm,滴加石炭酸品红溶液进行染色，5min左右即可。
8.压片：盖上盖玻片，用镊子柄轻轻敲打盖玻片，分生组织细胞即铺成薄薄一层；然后用滤纸吸取多余染液，用铅笔的橡皮头敲打，使细胞与染色体分散。
9.镜检观察：在显微镜下仔细观察，寻找染色体轮廓清晰、适中、分散而不重叠的分裂中期相。
10.封片：拔压好的染色体标本放在冰箱冷冻室，然后用刀片将盖玻片快速掀开，盖玻片与载玻片同时于37℃左右的烘箱中烘干。载玻片、盖玻片经二甲苯透明，滴中性树胶，即制成永久制片。载玻片、盖玻片分别用新的盖玻片、载玻片封片。
六、实验结果与讨论
1.本实验根据低温诱导染色体加倍与细胞同步化原理进行改进，即在常规低温诱导后，恢复常温培养，时间小于实验材料一个细胞周期，再进行后续有丝分裂临时装片制作。镜检结果显示，实验组有丝分裂指数明显高于对照组( 图 1、表 1) 。结果提示低温处理抑制纺锤体形成，细胞分裂就停止在了分裂前期，相当于细胞同步化过程。恢复常温培养一个细胞周期内，原本阻滞在分裂前期的细胞继续进行分裂，便出现一个明显的细胞分裂高峰，可见数量较多的分裂期细胞。

图 1 蚕豆根尖实验组有丝分裂图及分裂期细胞
表 1 蚕豆根尖常温培养与低温诱导细胞的分裂指数

注: 经卡方数据检验得: P ＜ 0． 05，蚕豆根尖实验组与对照组细胞分裂差异显著。
2. 讨论
（1）恢复常温培养步骤的改进 根据上述低温诱导染色体加倍与细胞同步化原理［1 ～4］，对本实验现有方案改进后，通过比较实验组与对照组的细胞分裂指数，使实验结果直观化、数据化，结果检验更加合理可信。在中学教学中，学生通过该实验方案的操作，加深对低温诱导染色体数目变化本质的理解，并进一步延伸其在生产实践例如细胞同步化中的应用，从而在真正意义上达成知识与技能、过程与方法、情感态度与价值观三维目标。
（2） 关于实验的细节问题 具体讨论如下: ①选材 前期工作通过比较多种实验材料，发现洋葱、蚕豆为本实验的理想材料。首先两种常见植物为学生所熟知的，选取其作为实验材料，符合课程标准关于“注重与现实生活的联系”的课程理念; 其次蚕豆、洋葱的染色体数目较少，染色体形态明显，易在显微镜下观察。再者两者的根尖易培养，培养条件简单。以蚕豆为实验材料的须注意:[5] ①注意购买渠道。建议从正规的种子公司购买当年的蚕豆种子，以保证种子的萌发率。根据农作经验，蚕豆一般在暮春收种，当年入冬之后再次播种。因此，在播种当年的秋天才可能购买到当年收获的新种。教师应根据实验开展的时间，提前准备好蚕豆种子; ②注意培养温度。蚕豆在初冬播种，因此其种子萌发的适宜温度大约是 10℃。而根据多数中学的教学进度，一般在入夏时开展本实验。因此蚕豆培养需要在冷柜中保持 10℃左右进行;③蚕豆在培养之前需要放在 30℃ ～ 40℃ 的水浴锅中进行浸种，有利于蚕豆种子快速萌发。待胚根萌发至1cm 左右，即根尖细胞分裂旺盛时，进行低温处理。
( 2) 低温诱导温度与时间及常温的恢复培养 以洋葱与蚕豆为实验材料，低温处理的的最佳温度应控制在 2℃ ～4℃。关于低温诱导时间，应视具体实验材料而定。现有资料对同一种材料说法也不一。就本实验方案选用的蚕豆而言，低温诱导 36h，细胞同步化效果最佳。本实验方案关键步骤是低温诱导后恢复常温培养。恢复培养的时间应严格控制在实验材料一个细胞周期以内。这样，经前期低温处理同步化的细胞，在恢复常温培养后，才会出现一个明显的细胞分裂高峰。
如果恢复培养时间超过一个细胞周期，样品的细胞分裂指数将恢复为 3% ～ 4%。就本实验方案，由于蚕豆根尖分生区细胞细胞周期为 17． 3h[6]，因此建议常温恢复培养时间为 10 ～12h。
( 3) 取材、固定、解离与染色 建议取材后将根尖固定。固定液能迅速穿透细胞，将细胞的形态固定并维持染色体结构的完整性，达到优良的染色效果[1]。用固定液固定之后的材料要用 95%的酒精进行充分冲洗，否则会影响实验材料的解离。解离充分但不能过度。具体时间根据不同的实验材料区别对待。例如，蚕豆的根尖由于细胞壁比较厚，解离的时间要 25 ～ 30min，也可以在 30℃左右的水浴锅中进行解离。洋葱根尖细胞常温解离的时间为20min。染色之前要用蒸馏水将解离液冲洗干净，必要时可用 0．5mol/L 氢氧化钠略洗以中与解离液，再用蒸馏水充分冲洗，以确保染色的效果。建议使用改良苯酚品红染液，能够特异对细胞核染色，而细胞质几乎无色透明，易于观察。染色时间一般为 5min。
七、参考文献
［1］徐作英，王重力． 2009． 中学生物学实验教学论． 北京: 北京师范大学出版社，321 ～322
［2］冯立新，肖桂芝，岳雪玲．2005． 低温对人外周血淋巴细胞的同步化作用． 承德医学院学报，22( 2) : 96 ～98
［3］毛春娜，张爱民，薛建平．2011． 低温处理对半夏悬浮培养细胞同步化的影响． 中国中药杂志，36( 8) : 959 ～963
［4］周爱文，柯 铁，梅兴国．2001． 低温诱导红豆杉细胞同步化的研究． 武汉化工学院学报，23( 1) : 12 ～14
［5］张铭清，林 荔，肖义军． 2011． 对“低温诱导植物染色体数目变化”实验细节上的补充． 生物学通报，46( 9) : 56 ～57
［6］顾文波．2011． 细胞周期与细胞同步化． 生物学教学，36( 6) : 54 ～56.
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