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低温诱导植物细胞染色体数目加倍.doc

1、低温诱导植物细胞染色体数目加倍一、 实验目的1 了解人工诱导植物多倍体的原理、方法及其在植物育种中的作用。2 应用植物染色体制片技术,鉴别诱导后染色体数目变化。3 学会探究性实验的设计方法。二、 实验原理通过低温阻碍细胞内酶促反映的进行,从而导致细胞分裂时形成纺锤体所需ATP的供应途径受阻,使细胞分裂过程中完成染色体加倍而细胞不能分裂,达到染色体数目加倍。从理论上讲,观察染色体数目的最佳时期是分列中期,可当纺锤体的行成受到抑制时,细胞分裂就停止在了前期,不再出现中期、后期,只有当细胞分裂进入到第二周期的中期时,才能确保低温诱导染色体数目变化的成功。因此,低温处理的时间至少要有一个半周期的时间。

2、低温抑制了纺锤体的形成,同时也降低了酶的活性,细胞分裂的速度减慢,细胞周期会延长。三、 实验仪器与试剂1. 材料:蚕豆 2.试剂:秋水仙素 3.仪器:超低温冰箱四、 实验步骤与方法 (1) 培养根尖 蚕豆种子于 30 40水浴中浸种 3 4h 后,取出放入带有湿润纱布的培养皿中于10 培养,每 2d 换一次水。注意水要浸过蚕豆种子体积的 1/3。(2)低温诱导处理 待实验材料长出约 1cm 左右根时,将实验材料平均分两组: 实验组于 2的冰箱中进行低温诱导培养 36h 后( 换水时注意用 2的水,减小实验的误差) ,于 15 20恢复常温培养 10 12h( 即小于实验材料一个细胞周期的时间)

3、 。对照组于15 20 常温进行培养,注意经常换水。(3)取材、固定、解离、漂洗与染色 常规“植物细胞有丝分裂”制片方法1。(4)显微观察与数据统计分析 随机观察并统计10 个视野中分裂期与非分裂期细胞,计算分裂指数( mitotic index,MI) 。细胞分裂指数 = 分裂期细胞数/全部细胞数 100%。统计数据进行卡方检验。五、 实验记录 ( 1) 培养根尖 蚕豆种子于 30 40水浴中浸种 3 4h 后,取出放入带有湿润纱布的培养皿中于10 培养,每 2d 换一次水。注意水要浸过蚕豆种子体积的 1/3。(2)低温诱导处理 待实验材料长出约 1cm 左右根时,将实验材料平均分两组: 实

4、验组于 2的冰箱中进行低温诱导培养 36h 后( 换水时注意用 2的水,减小实验的误差) ,于 15 20恢复常温培养 10 12h( 即小于实验材料一个细胞周期的时间) 。对照组于15 20 常温进行培养,注意经常换水。3.取材:待蚕豆根尖长至2cm时取其根尖顶端(0.5-1cm)4.预处理:将取下的根尖置于盛有对二氯笨饱与水溶液的青霉素瓶中,浸泡处理3-4 h。5.固定:经过预处理的根尖,用水清洗,用甲醛-冰醋酸(3:1)固定溶液固定6-24h,固定材料可转入70%酒精中,于4冰箱中保存备用。6.解离:倒去固定液,用蒸馏水漂洗2-3次。7.染色:将根尖放在载玻片上,切下顶端1-2mm,滴加

5、石炭酸品红溶液进行染色,5min左右即可。8.压片:盖上盖玻片,用镊子柄轻轻敲打盖玻片,分生组织细胞即铺成薄薄一层;然后用滤纸吸取多余染液,用铅笔的橡皮头敲打,使细胞与染色体分散。9.镜检观察:在显微镜下仔细观察,寻找染色体轮廓清晰、适中、分散而不重叠的分裂中期相。10.封片:拔压好的染色体标本放在冰箱冷冻室,然后用刀片将盖玻片快速掀开,盖玻片与载玻片同时于37左右的烘箱中烘干。载玻片、盖玻片经二甲苯透明,滴中性树胶,即制成永久制片。载玻片、盖玻片分别用新的盖玻片、载玻片封片。六、实验结果与讨论1.本实验根据低温诱导染色体加倍与细胞同步化原理进行改进,即在常规低温诱导后,恢复常温培养,时间小于

6、实验材料一个细胞周期,再进行后续有丝分裂临时装片制作。镜检结果显示,实验组有丝分裂指数明显高于对照组( 图 1、表 1) 。结果提示低温处理抑制纺锤体形成,细胞分裂就停止在了分裂前期,相当于细胞同步化过程。恢复常温培养一个细胞周期内,原本阻滞在分裂前期的细胞继续进行分裂,便出现一个明显的细胞分裂高峰,可见数量较多的分裂期细胞。图 1 蚕豆根尖实验组有丝分裂图及分裂期细胞表 1 蚕豆根尖常温培养与低温诱导细胞的分裂指数注: 经卡方数据检验得: P 0 05,蚕豆根尖实验组与对照组细胞分裂差异显著。2. 讨论(1)恢复常温培养步骤的改进 根据上述低温诱导染色体加倍与细胞同步化原理1 4,对本实验现

7、有方案改进后,通过比较实验组与对照组的细胞分裂指数,使实验结果直观化、数据化,结果检验更加合理可信。在中学教学中,学生通过该实验方案的操作,加深对低温诱导染色体数目变化本质的理解,并进一步延伸其在生产实践例如细胞同步化中的应用,从而在真正意义上达成知识与技能、过程与方法、情感态度与价值观三维目标。(2) 关于实验的细节问题 具体讨论如下: 选材 前期工作通过比较多种实验材料,发现洋葱、蚕豆为本实验的理想材料。首先两种常见植物为学生所熟知的,选取其作为实验材料,符合课程标准关于“注重与现实生活的联系”的课程理念; 其次蚕豆、洋葱的染色体数目较少,染色体形态明显,易在显微镜下观察。再者两者的根尖易

8、培养,培养条件简单。以蚕豆为实验材料的须注意:5 注意购买渠道。建议从正规的种子公司购买当年的蚕豆种子,以保证种子的萌发率。根据农作经验,蚕豆一般在暮春收种,当年入冬之后再次播种。因此,在播种当年的秋天才可能购买到当年收获的新种。教师应根据实验开展的时间,提前准备好蚕豆种子; 注意培养温度。蚕豆在初冬播种,因此其种子萌发的适宜温度大约是 10。而根据多数中学的教学进度,一般在入夏时开展本实验。因此蚕豆培养需要在冷柜中保持 10左右进行;蚕豆在培养之前需要放在 30 40 的水浴锅中进行浸种,有利于蚕豆种子快速萌发。待胚根萌发至1cm 左右,即根尖细胞分裂旺盛时,进行低温处理。( 2) 低温诱导

9、温度与时间及常温的恢复培养 以洋葱与蚕豆为实验材料,低温处理的的最佳温度应控制在 2 4。关于低温诱导时间,应视具体实验材料而定。现有资料对同一种材料说法也不一。就本实验方案选用的蚕豆而言,低温诱导 36h,细胞同步化效果最佳。本实验方案关键步骤是低温诱导后恢复常温培养。恢复培养的时间应严格控制在实验材料一个细胞周期以内。这样,经前期低温处理同步化的细胞,在恢复常温培养后,才会出现一个明显的细胞分裂高峰。如果恢复培养时间超过一个细胞周期,样品的细胞分裂指数将恢复为 3% 4%。就本实验方案,由于蚕豆根尖分生区细胞细胞周期为 17 3h6,因此建议常温恢复培养时间为 10 12h。( 3) 取材

10、固定、解离与染色 建议取材后将根尖固定。固定液能迅速穿透细胞,将细胞的形态固定并维持染色体结构的完整性,达到优良的染色效果1。用固定液固定之后的材料要用 95%的酒精进行充分冲洗,否则会影响实验材料的解离。解离充分但不能过度。具体时间根据不同的实验材料区别对待。例如,蚕豆的根尖由于细胞壁比较厚,解离的时间要 25 30min,也可以在 30左右的水浴锅中进行解离。洋葱根尖细胞常温解离的时间为20min。染色之前要用蒸馏水将解离液冲洗干净,必要时可用 05mol/L 氢氧化钠略洗以中与解离液,再用蒸馏水充分冲洗,以确保染色的效果。建议使用改良苯酚品红染液,能够特异对细胞核染色,而细胞质几乎无色

11、透明,易于观察。染色时间一般为 5min。七、参考文献1徐作英,王重力 2009 中学生物学实验教学论 北京: 北京师范大学出版社,321 3222冯立新,肖桂芝,岳雪玲2005 低温对人外周血淋巴细胞的同步化作用 承德医学院学报,22( 2) : 96 983毛春娜,张爱民,薛建平2011 低温处理对半夏悬浮培养细胞同步化的影响 中国中药杂志,36( 8) : 959 9634周爱文,柯 铁,梅兴国2001 低温诱导红豆杉细胞同步化的研究 武汉化工学院学报,23( 1) : 12 145张铭清,林 荔,肖义军 2011 对“低温诱导植物染色体数目变化”实验细节上的补充 生物学通报,46( 9) : 56 576顾文波2011 细胞周期与细胞同步化 生物学教学,36( 6) : 54 56.6 / 6

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