蛋白质和多肽的氨基酸序列分析.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,第十章,蛋白质和多肽的氨基酸序列分析,引言,氨基酸是一种小分子的两性化合物，分子量在,75,200Da,之间，其化学通式为：,在生物体内出现的氨基酸都是,L,型，仅在少数微生物来源的多肽中出现,D,型氨基酸。,蛋白质和多肽是由,20,种氨基酸按照一定的顺序通过肽键连接成一长链，然后通过链内、链间的离子键、疏水作用等多种作用力进行折叠卷曲形成一定的构象并发挥其独特作用。氨基酸的排列顺序即,蛋白质的一级结构决定了蛋白质的高级结构及功能,。,因此，分析蛋白质的氨基酸序列是进行蛋白质结构功能研究中不可缺少的部分。引言,蛋白质测序的研究历史,1947,采用部分水解的方法试图测定蛋白质的氨基酸序列,Consden,等利用色谱技术成功测定了短杆菌肽,S6,的氨基酸序列,Sanger,首次测定了牛胰岛素的一级结构（由,51,个氨基酸残基组成）,Spackman,、,Stein,、,Moore,制造了自动化的氨基酸分析仪，使氨基酸定量分析进入了一个崭新的阶段,Edman,推出第一台自动测序仪,1958,1955,1940,年前,1967,引言,牛胰岛素的一级结构,引言,一级结构测定的基本流程,1.,拆分,蛋白质分子的多肽链,;,2.,鉴定多肽链的,N-,末端和,C-,末端残基,;,3.,用两种或几种不同的断裂方法将,多肽链裂解,成较小的片段,;,4.,对各肽段的氨基酸序列进行,测序,;,5.,重建,完整多肽链的一级结构,;,6.,确定半胱氨酸残基间形成的,二硫键的位置,；,7.,酰胺基,位置的确定。,引言,测定蛋白质的一级结构前的准备工作,1.,样品,纯度,必须,97%,以上；,聚丙烯酰胺凝胶电泳要求一条带,2.,测定蛋白质的,相对分子质量,；,SDS-PAGE,，凝胶过滤法，沉降系数法,3.,测定蛋白质,多肽链种类和数目,；,种类：,SDS-PAGE,数目：,N,末端氨基酸残基摩尔数,/,蛋白质摩尔数,4.,测定蛋白质的,氨基酸组成,；并根据分子量计算每种氨基酸的个数；,引言,第一节 氨基酸组成分析,章节,第二节 蛋白质的末端测定,第三节,亚基拆离、肽链降解和肽段的分离,第四节,肽段的,氨基酸顺序测定,第五节,蛋白质一级结构的重建,第一节氨基酸组成分析,二、特殊氨基酸的保护,三、衍生方法及原理,第一节 氨基酸组成分析,四、氨基酸定性和定量分析,一、蛋白质或多肽的水解方法,五、测定氨基酸组成的实验步骤,氨基酸组成分析的目的,现代分离提纯技术的发展使蛋白质操作微量化，但也给,定量,带来了困难，一般很难通过常规的称量或测蛋白溶液在,280nm,的光吸收值来准确定量蛋白质，所以如果在蛋白质酶解或测序前，取蛋白质样品的一部分进行氨基酸组成分析，根据结果便可以推算出蛋白量的可靠值。,另外，在蛋白质测序中有时遇到测不出结果的情况，一种可能是蛋白质的,N,端封闭,，另一种可能则是样品本身不是蛋白质或绝大部分,是非蛋白质物质,，解决这个问题的很好途径便是做一个氨基酸组成分析以确定样品的成分。,除了蛋白质研究和重组蛋白需要测定氨基酸组成外，医学上也需要测定血液或各种体液中的游离氨基酸。,1,水解,在一定温度、酸度等条件下，蛋白质或多肽的肽键断裂，水解成游离氨基酸。,3,色谱,利用高效液相色谱对这些氨基酸进行定性和定量色谱分析。,2,衍生,在游离氨基酸残基上衍生一个生色基团,目前蛋白质或多肽的氨基酸组成分析主要包括,3,个步骤，即：,最终获得蛋白质或多肽中各氨基酸所占摩尔百分数或摩尔比。,氨基酸组成分析的步骤,一、蛋白质或多肽的水解方法,水解,是蛋白质氨基酸组成分析的第一步，作用是破坏蛋白质的肽键，得到,游离的氨基酸,，用于之后的定性定量分析。,这是极其重要的一步，因为水解质量的好坏将直接影响到最终分析结果的正确与否,。,虽然多肽的氨基酸组成分析已向更灵敏、更精确、更快速以及自动化方向发展和改进，但还,没有一种单独适用于所有残基,的，并且能在水解液中定量回收的水解方法出现，很多因素如温度、时间、水解试剂、添加剂、水解方法等对水解的完全程度均有影响。,下面主要对一些常用的水解方法作简要介绍。,1,、酸性水解,酸性水解是采用较多的一种水解方法，其中,HCl,是最通用的水解剂。,条件,：6 mol/L HCI,、真空、,110,，水解时间为,20,24h,。即可用于液相水解模式也可用于气相水解模式。,损失,：在该条件下，得到的氨基酸不消旋，但天冬酰胺和谷氨酰胺分别被完全水解为天冬氨酸和谷氨酸，,色氨酸则被完全破坏,，半胱氨酸不能从样品中直接测定，酪氨酸部分被水解液中痕量杂质所破坏，丝氨酸和苏氨酸被部分水解，损失分别为,10%,和,5%,。,相关措施：,对某些,氨基酸的破坏率,，需要用不同水解时间测定这些氨基酸的含量，然后外推到水解时间为,0,时，算得的氨基酸含量，即代表了真正数值。,有些,脂肪族氨基酸残基间的肽键,，如,Ile-Ile,、,Val-Val,、,Ile-Val等之间的肽键难于裂解，可以通过延长水解时间如水解,92h,甚至,120h,来解决。但是长时间的水解，会使较敏感的氨基酸残基的损失更大。,半胱氨酸和甲硫氨酸,往往先将蛋白质用过甲酸氧化后再水解，相应得到磺基丙氨酸和甲硫氨酸。,2,、碱性水解,碱性水解一般选用,NaOH,和,KOH,作为水解剂。例如将水解样品加入,5mol/L NaOH,中，充氮气后填充管，,110,水解,22h,。,该水解方法是,HCl,水解的互补法。因为碱水解时，多数氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、精氨酸以及半胱氨酸遭到破坏，其它的氨基酸外消旋化，,仅色氨酸是稳定的,。所以此法仅限于测定色氨酸的含量。,3,、酶水解,用,一组蛋白酶,水解肽链，特别适用于对化学水解敏感的氨基酸如天冬酰胺和谷氨酰胺的测定。,优点,是水解过程中氨基酸不发生消旋化，几乎可以保持所有的组成氨基酸不被破坏。因为酶水解条件温和，对天冬酰胺、谷氨酰胺等皆无破坏作用。,缺点,是反应需要较长的时间，水解的产物为较小的肽段，水解不完全。另外，因为酶本身也是蛋白质，对样品的测定结果可能会有干扰。,常见蛋白水解酶及其作用位点,4,、微波辐射能水解,微波是一种高频电磁波，其能量传递是通过分子的极化，而水分子的极化作用是非常高的，微波能量的快速吸收能导致完全,水解的时间大大缩短,。在微波辅助酸水解和微波辅助酶水解中，水解时间可从过去的几十小时缩短到几十分钟。,因此，微波辅助蛋白质水解技术的出现大大提高了氨基酸组成分析的效率。,5,、膜上蛋白质印迹样品的水解（原位分析）,如果蛋白质样品采用电泳法,(,如,SDS-PAGE),分离，很难从凝胶中洗脱下来，可采用电印迹法把样品转移到,PVDF(,聚偏氟乙烯,),膜上，然后在,PVDF,膜上直接进行盐酸水解和氨基酸分析，称之为,原位,(in situ),分析。,可将水解指管放入水解反应器中，在反应器底部加入,200ul,含,7,巯基乙酸的,6mol/L,盐酸，,110,真空水解,24 h,，水解结束后用,200 ul,含,30,甲醇的,0.1 mol/L,盐酸反复三次将氨基酸从,PVDF,膜中抽提出来，以便进行下一步的分析。,总之，蛋白质水解阶段所采用的方法不同，会对氨基酸组成分析产生重要影响。对于不同的蛋白质、不同的研究目的、以及样品量的多少，应采取不同的水解方法。,二、特殊氨基酸的保护,不同水解条件下，各种氨基酸的回收有所不同。一些敏感氨基酸如,色氨酸和半胱氨酸,可能遭水解破坏，导致无法正确测定其含量。,因此水解过程中，需要考虑对特殊氨基酸的保护。,色氨酸的保护,水解酸中加添加剂,：例如加入巯基乙酸和,-,巯基乙醇，可使色氨酸的回收可达,80,。,有机酸,：,3mol,L,疏基乙磺酸或,4mol/L,甲磺酸在水解时对色氨酸有一定的保护作用。,酶,：利用蛋白酶作为水解剂，条件温和，对天冬酰胺和谷氨酰胺及色氨酸均无破坏作用。,碱,：用氢氧化钠和氢氧化钡代替酸水解，可保护色氨酸不被破坏。,光谱法：,分光光度法,：应用较早，在蛋白质分子中，如不含胱氨酸和其他有干扰的发色基团的氨基酸，根据其在,6mol/L,盐酸胍的中性溶液中的紫外吸收，测定色氨酸和酪氨酸的含量，此经验公式只适用于色氨酸对酪氨酸的比值为,0.21,时的情况。,二阶微分光谱法,：常被用来确定蛋白质中芳香族氨基酸的含量，计算公式复杂，,Hewlett Packard,公司推出的,DAD,检测器配合其化学工作站软件，能较方便地在线检测并定量肽段中的色氨酸。,半胱氨酸的保护,：,还原烷化法：,产生能抗水解的半胱氨酸衍生物。烷化试剂包括,4乙烯吡啶和碘代乙酸。,缺点：为了确保试剂接近巯基，还原和氧化通常在变性剂存在下进行，多余试剂和变性剂要用,HPLC,、沉淀法或透析去除，每一步都可能造成样品的损失。,氧化反应,：过甲酸氧化反应被用来转化半胱氨酸和胱氨酸成为半胱磺酸再进行测定。,缺点：会影响其他氨基酸特别是甲硫氨酸会转变成甲硫氨酸砜，酪氨酸会降解。必须准备能分析两次的样品量一次提供半胱氨酸数据，另一次则提供其他氨基酸的组成数据。,三、衍生方法及原理,衍生是将氨基酸衍生为有利于测定或分离的化合物。,大多数氨基酸不含有芳香环等生色团，无法直接用紫外法检测，需要先将氨基酸,衍生为具有较强紫外或荧光吸收的衍生物。,从衍生角度看，氨基酸分析可以分为柱后反应法和柱前衍生法两大类。,柱后反应法,将游离氨基酸经过色谱柱分离后，各种氨基酸再与显色剂,(,茚三酮、荧光胺、邻苯二甲醛,),作用。,优点,：比较稳定，对样品预处理要求低，容易定量和自动化操作。,缺点,：检测灵敏度不高，分析时间长,(,蛋白质水解液需,1 h,而某些生理样品则需,4 h,以上,),。,柱前衍生法,将氨基酸和化学偶联试剂先反应生成氨基酸的衍生物，然后再用色谱柱将各种衍生物分离，直接检测衍生物的光吸收或荧光发射。,优点,：此法可检测,OPA-,（邻苯二甲醛），,PTC-,，,PTH-,，,DABS-,，,Dansyl-,和,DABTH-,氨基酸，分析灵敏度高，可利用,HPLC,进行氨基酸分析。,缺点,：有的衍生物不稳定，衍生试剂可能干扰氨基酸检测。,柱后反应法,VS,柱前衍生法,几种常见的氨基酸分析方法,：,1,、茚三酮反应,2,、荧光胺法,3,、邻苯二甲醛,(OPA),法,4,、,PTC-AA,分析法,5,、,Dansyl-Cl,（,DNS-Cl,）法,6,、,磺酰氯二甲胺偶氮苯,（,Dabsyl-Cl,）法,1,、茚三酮反应,-,氨基酸与水合茚三酮一起在水溶液中加热，除脯氨酸和羟脯氨酸产生黄色物质，其它氨基酸都产生,蓝紫色物质。,此反应十分灵敏，根据反应所生成的蓝紫色的深浅，在,570nm,波长下进行比色就可测定样品中氨基酸的含量,。,2,、柱后荧光胺法,荧光胺能在室温下迅速和一级胺发生反应，其,荧光产物,的激发波长,390 nm,，发射波长,475 nm,。,荧光胺与氨反应的灵敏度比茚三酮与氨反应的灵敏度大约提高了,3,个数量级。,3,、邻苯二甲醛,(OPA),法,OPA,最早是被作为柱后衍生试剂而引进的，后来也逐渐应用于柱前反应中。,OPA,能在还原剂巯基乙醇存在下和一级胺产生具有很,强荧光,的异吲哚衍生物，该反应在室温下,1 min,即可完成。,4,、,PTC-AA,分析法,属柱前衍生法，源于,Edman,降解法测定蛋白质一级结构。,异硫氰酸苯酯,(PITC),能在碱性条件下和氨基酸反应，生成,苯氨基硫甲酰,（,PTC,）,-AA,，能在,254nm,检出。此法分析灵敏度和荧光胺、,OPA,的荧光法相同。,5,、,Dansyl-Cl,（,DNS-Cl,）法,荧光试剂二甲氨基萘磺酰氯（,DNS-Cl,）能与所有氨基酸柱前反应形成高稳定性的带有,荧光,的,DNS-,氨基酸。但反应耗时。,6,、,磺酰氯二甲胺偶氮苯,（,Dabsyl-Cl,）法,灵敏度是,Dansyl-Cl,法的,1/5,，反应产生有色衍生物，能方便地在,254 nm,和,425 nm,处用紫外检测。,有报道用,DABITC,代替,Dabsyl-Cl,，反应产生,DABTH-AA,，在酸性环境中显红色，易在,254 nm,，,269 nm,，,436 nm检测,。,四、氨基酸定性和定量分析,氨基酸的定性和定量分析一般采用纸层析、薄层层析、离子交换柱层析等方法。采用,HPLC,仪和氨基酸自动分析仪更好。随着仪器的不断改进，一个样品的测定仅需,20min,即可完成。,单向纸层析,双向纸层析,薄层层析,离子交换层析,高效液相色谱,（,high performance liquid chromatography,，,HPLC,）,蛋白质中氨基酸的组成一般用,每摩尔蛋白质中氨基酸残基的摩尔数,表示，或,每,100g,蛋白质中含氨基酸的克数,表示。,所以只有知道蛋白质的相对分子质量，才能推出它的氨基酸组成。,例：血小板衍生生长因子的氨基酸组成,五、测定氨基酸组成的实验步骤,目前各大公司如,Beckman,，,Hewlett Packard,，,Perkin E1mer,，,Waters,等都有各自的自动进样、氨基酸分析和定量报告联为一体的商品化氨基酸自动分析仪出售，下面介绍几种常规实验室测定氨基酸组成的方法。,1,、邻苯二甲醛,(OPA),法,实验操作：,称取,5mg OPA,溶于,0.1m1,甲醇中，加入,50 ul,巯基乙醇，用,0.2 mol,L pH9.5,的硼酸缓冲液稀释至,1 ml,。通氮气并避光保存，每隔两天加入,5ul,巯基乙醇以维持其强度，此,OPA,反应试剂能用,23,周。取,10 u1,标准氨基酸混合液,(50100 pmol),或样品水解液，加,10 ul pH9.5,的硼酸缓冲液,(,内含,2,SDS,和,100 pmol-,氨基丁酸,),，然后加入,10 u1 OPA,试剂，混合均匀，反应,1 min,后再加入,20 ul 0.1 mol/L,的,KH 2PO4,中止反应，并立即取,20 ul,注入,RP-HPLC,柱进行分析。,仪器,为,Beckman 344HPLC,仪，反相柱,RP-18(250mm 4.6mm),，荧光检测器。,流动相：,A 50mmol/L,乙酸缓冲液,pH6.8:,甲醇,:THF=80:19:1,B 50mmol/L,乙酸缓冲液,pH6.8:,甲醇,80:20,梯度条件,是：5min,，,10,B;10min,，,15,B,20min,，,10,B,；,25min,，,15,B,；,35min,，,50,B,；,50min,，,90,B;,55min,，,100,B,。,用乙醇代替剧毒的乙腈或甲醇作为有机相来定量分析氨基酸，灵敏度可达,10 pmol,。,2,、,PTC-AA,实验操作,：,氨基酸或样品在,Eppendorf,管中真空干燥后溶解在,50 ul,偶联试剂,(,乙醇,:,三乙胺,:,水,7:1:1),中。此溶液在旋转真空干燥后再次溶解于,50ul,偶联试剂中，然后加入,2ul PITC(,异硫氰酸苯酯,),，反应混合物在,250C,下保温,15 min,，再次旋转真空干燥，真空度,(1.313 Pa),。如此生成的,PTC-AA,溶解在适量流动相,A,中，取一部分上柱定量分析。,仪器,为,Beckman Gold System HPLC,仪，反相柱,RP-18(250mm4.6mm),或,PTH-,柱，,254 nm,检测。,流动相：,A 50mmol/L,乙酸钠，,pH6.8,B 50mmo1,L,乙酸钠，,pH6.8:,乙腈,50:50,HPLC,柱采用水浴夹套,40,恒温，并用,5,流动相,B,平衡。,梯度条件,是：,0 min,5%B,5 min,5,-15,B,10 min,15,B,；,30 min,15,60,B,40 min,60 5,B,流速,是,1ml,min,。,3,、茚三酮法,实验操作,：水解后氨基酸样品溶解于,Na-S,样品稀释液中,100 u1,上样分析，实际进样量,50 ul(100 pmol5nmol,，均呈线性,),。,仪器：,Beckman 6300,氨基酸分析仪,。,流动相：,Na-E 0.0 min,温度,：,0.0 min 48,Na-D 27.80 min 11.8min 65,Na-F 39 min 32.5min 77,Na-R 76.00 min 50min 48,Na-E 77.00-90 min,流速：,缓冲液,14 ml/h,茚三酮,7 ml/h,第二节蛋白质的末端测定,蛋白质的末端分析的目的,:,确定其,氨基末端残基及羧基末端残基,了解蛋白质分子中,肽链的组成情况,。例如，牛胰岛素单体有,2,个,N-,末端和,2,个,C-,末端，是由,2,条肽链通过二硫键相连而成；血红蛋白分子有,4,个,N-,末端和,4,个,C-,末端，为,4,个亚基通过次级键组成的分子。,末端分析通常采用专一性化学试剂与末端氨基或羧基反应，然后分解出被作用的末端氨基酸加以测定。由于与羧基反应的活化能相当高，所以用于与羧基反应的专一性试剂比较少，而,N,端测定的方法较多。氨肽酶及羧肽酶等外切酶也常有应用。,下面介绍常用的,N-,末端和,C-,末端测定的方法，以及封闭,N-,末端的测定。,二C-,末端的测定,三、,封闭,N-,末端的测定,第二节 蛋白质的末端测定,一、,N-,末端的测定,一、,N-,末端的测定,N,末端测定方法比,C,末端更加成熟、可靠和准确，主要的方法有：,1,、二硝基氟苯法（,DNFB,法、,Sanger,法）,2,、二甲氨基萘磺酰氯法（,DNS-Cl,法）,3,、异硫氰酸苯酯法（,PITC,法）,4,、,DABITC,法,5,、氨肽酶法,1,、二硝基氟苯法（,DNFB,法、,Sanger,法）,二硝基氟苯在弱碱性条件下，与肽链的,N,端氨基作用，形成二硝基苯基肽链（,DNP-,肽），经酸水解后，,N,端残基成为,二硝基苯基（,DNP,）,-,氨基酸,，可用有机溶剂（如乙醚）抽提，再进行纸层析或薄层层析后，根据层析斑点的位置作定性鉴定。,FDNB,不仅与,N-,末端的,-,氨基起反应，也与,侧链,上的,-,氨基、巯基、酚羟基和咪唑基反应，但水解产物极性较强，不被乙醚抽提，而不干扰末端的测定。,当,N-,端残基为,脯氨酸,或,羟脯氨酸,时，因,DNP-,脯氨酸或,DNP-,羟脯氨酸在盐酸水解条件下极不稳定，如,DNP-,脯氨酸易分解成脯氨酸以及,-,氯,-DNP-,氨基戊酸和,-,氯,-DNP,氨基戊酸，所以回收率甚低，不能进行测定。,2,、二甲氨基萘磺酰氯法（,DNS-Cl,法）,荧光剂,DNS-Cl,可与肽链,N,端氨基反应生成,DNS-,肽经酸水解，,N-,末端残基形成,DNS-,氨基酸,，用乙酸乙酯抽提，然后用层析法鉴定。,DNS-,氨基酸于,360nm,或,280nm,处产生强烈荧光，根据荧光点位置确定,N,端氨基酸。,DNS-,脯氨酸,经,6 M HCl,于,110,水解过夜有,70%,被破坏。,色氨酸,及其,DNS,衍生物在盐酸水解时完全被破坏，可改用巯基乙烷磺酸在真空下水解，并用乙酸乙酯抽提非极性得,DNS-,氨基酸加以鉴定。,赖氨酸的,-,氨基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基以及酪氨酸的羟基也能与,DNS-Cl,进行反应。但半胱氨酸和组氨酸侧链衍生物在酸水解时并不稳定。,当,N-,末端为,组氨酸,、,精氨酸,或,半胱氨酸,（,S-,羧甲基半胱氨酸形式或磺酸形式）时，对其测定也受到一定限制。,当,N-,末端氨基酸为,谷氨酸,或,谷氨酰胺,、,天冬氨酸或天冬酰胺,时，因有高温水解过程，对它们不能区别。,3,、异硫氰酸苯酯法,在弱碱中，异硫氰酸苯酯（,PITC,）与,N,端氨基偶联生成苯基硫甲酰衍生物（,PTC-,肽）。在酸性溶液中，,PTC-,肽经环化裂解生成,PTC-,氨基酸和,N,端少个氨基酸的剩余多肽。由于,PTC-,氨基酸不稳定，很快转化成苯基乙内酰硫脲氨基酸,（,PTH-,氨基酸,）,。,生成,PTH-,氨基酸非常稳定，在,268nm,处有强吸收峰。,噻咪啉酮衍生物经氯乙烯抽提后，留下的肽链再可作下一次的循环，分析次一个氨基酸残基。因而此法也称为,Edman,顺序降解，可用于蛋白质或多肽的,N,端顺序测定，一般可测定末端,30,个左右的残基，是制造氨基酸顺序分析仪的理论基础。,4,、,DABITC,法,DABITC,（,4-N,N-,对甲氨基偶氮苯,-4-,异硫氰酸酯）能与,N,端氨基反应生成,DABTH-,氨基酸,，经层析分离后，用盐酸气熏即可出现红色斑点，很容易鉴定。,5,、氨肽酶法,氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的,N-,端逐个的向里水解。,根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的,N-,末端残基顺序但由于酶的特异性和对各种,氨基酸水解速度不用，结果,往往不易判断，在实际应用,中容易导致错误结论。,二、,C,末端的测定,C,末端测定方法较少，而且较,N,末端分析误差大。可采用的方法有：,1,、羧肽酶法,2,、硼氢化锂法（,LiBH,4,法，还原法）,3,、肼解法,1,、羧肽酶法,羧肽酶是一种肽链外切酶，能从多肽链的,C,端逐个的水解氨基酸。根据不同的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的,C,末端残基顺序。,实际应用时，由于羧肽酶对不同的,C,末端氨基酸作用的速度不同，而且反应是连续的，不能停在某一步上，因此给正确判断氨基酸的顺序造成了一定的困难。,4,种常用羧肽酶,：,羧肽酶,来源,专一性,CpA,胰脏,能释放除,pro,、,Arg,和,Lys,以外的所有,C,端氨基酸,CpB,胰脏,主要水解,C,端为,Arg,或,Lys,的肽键,CpC,植物或微生物,相当广泛，几乎能释放,C,端的所有氨基酸,CpY,面包酵母,可释放,C,端所有氨基酸,2,、硼氢化锂法（,LiBH,4,法，还原法）,硼氢化锂可与,C,末端氨基反应生成相应的,-,氨基醇，水解后抽提氨基醇，可用层析法分离、鉴定。,3,、肼解法,当蛋白质和无水肼在,100,反应,5,10 h,，肼可断裂所有的肽键，使所有氨基酸残基形成肼的衍生物,氨基酸酰肼，可与苯甲醛作用形成不溶的二亚苄基衍生物而除去，唯有,C,末端氨基酸以游离的形式存在于上清液中。,肼解法不适宜于,C,端为胱氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺的测定。,肽链中的丙氨酸、丝氨酸以及甘氨酸残基形成的酰肼化合物不稳定，在水溶液中容易转化为原来的氨基酸而干扰结果。,三、封闭N-末端的测定,有些蛋白质的肽链,没有游离的氨基端,，,较多的情况是氨基端因受到乙酰化或谷氨酸残基自身环化为焦谷氨酸残基而被封闭。此时我们可采用相应方法对封闭N-末端进行测定。,1,乙酰化,N-,末端,肼解条件下，,N,端的乙酰基形成乙酰肼。然后，使其与,DNS-Cl,作用，形成,N-,乙酰,-N-,丹磺酰肼，经乙醚抽提出来后，可应用薄层层析等方法鉴定。,由于乙酰基与氨基形成的酰胺键比较稳定，在部分酸水解条件（如,pH 2,，,105 90min,）下有可能产生乙酰基氨基酸，与已知标准化合物对照，也可以应用层析等方法对其加以鉴定。,2,吡咯烷酮羧酸末端,牛肝焦谷氨酸氨肽酶能水解出末端的吡咯烷酮羧酸，从而使剩下的有自由氨基端的肽链可以用,Edman,方法递减分析。,3,甲酰基末端,甲酰基常以甲酰甲硫氨酸的形式存在于原核体系的初生肽链的端部。,甲酰氨键比起一般肽键要不稳定得多，所以弱酸条件（如,0.5 M HCl,的甲醇溶液）下在室温处理,48,小时，可以使甲酰基水解下来。然后再可仿照乙酰基的测定方法加以鉴定。,第三节亚基拆离、肽链降解和肽段的分离,从蛋白质相对分子质量的测定和,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果，可以知道蛋白质是否由多亚基组成。若末端分析只有单一的结果，说明分子由相同亚基组成，无需将亚基拆开、分离。,反之，分子若有两种以上不同亚基组成，首先要将不同亚基之间的连接拆开，并进行分离提纯。提纯后的亚基肽链一般都是相对分子质量也比较大，需要将大的肽链降解成小的肽段，并将肽段提纯，然后才能正式开始顺序测定工作。,二、肽链的部分降解,三、肽段的分离提纯,第三节 亚基拆离、肽链降解和肽段的分离,一、亚基拆离和二硫键的断裂,一、亚基拆离和二硫键断裂,蛋白质由一条以上的肽链组成时，肽链间的结合可能是靠非共价键结合，也可能是靠共价键结合。在进行肽链顺序分析时，首先要将它们分离开来。,若多亚基间以,非共价键连接,，在温和条件下即可以拆离亚基，如改变溶液,pH,，将,pH,降低到,3,4,或升高到,9,10,；或者加入变性剂，如,8 mol/L,尿素或,6 mol/L,盐酸胍等。,例如，血红蛋白经,8 mol/L,脲处理后，,及,链可以得到分离；核酮糖二磷酸羧化酶在,0.2 mol/L,巯基乙醇及,1%SDS,溶液中保温,1,小时，大小亚基便相互分开。,拆离后的亚基可以用凝胶过滤方法进行分离。,拆分,靠共价键结合的因比较牢固须用特殊的化学作用使其破坏。,最常见的是半胱氨酸残基经氧化作用而形成胱氨酸残基，即,二硫键结构,。,1,过甲酸氧化法,优点：,能将巯基（,-SH,）和二硫键（,-S-S-,同时氧化成磺基，生成的磺酸基很稳定，肽链不再重新形成二硫键，便于肽链分离。,缺点：,氧化过程中，同时将蛋磺酸的侧链氧化成亚砜，色氨酸的侧链也遭破坏。,2,还原法,一般可使用过量巯基化合物，如,-,巯基乙醇,。在室温或,pH 8,9,条件下放置数小时，即可使二硫键还原成巯基。,加入,8 mol/L,尿素或,6 mol/L,盐酸胍使蛋白质变性。在这种情况下，还原剂才能有效地作用于暴露的二硫键。,二硫键还原后，需要用,巯基保护试剂,，如碘乙酸，以防其重新被氧化。,二、肽链的部分降解,由于氨基酸顺序测定多数采用,Edman,降解法，它一次能分析肽链长度约,10,余个氨基酸残基，所以分离得到的单链如果太长，须,将长的肽链断裂成易分析的较短肽链,。,肽链部分降解的方法要求选择性强、裂解点少、反应率高，一般采用化学裂解和酶解法两种。,1,化学裂解法,溴化氰（,CNBr,）,与肽链中蛋氨酸侧链的硫醚基发生反应，生成环化的溴化亚氨内酯，此产物水解后，产生高丝氨酸内酯，使蛋氨酸羧基端的肽键断裂。,这一方法的优点是产率高（可达,85%,）、专一性强，故实际应用较多。,2,酶解法,酶解法相对化学裂解法而言，有许多优点，如专一性强、裂解条件温和、副反应少等，再则蛋白水解酶对肽链的水解率也比较高，而且不同的蛋白水解酶对不同氨基酸形成的肽键水解专一性不同。,因此，酶解法被广泛使用。,几种常用蛋白水解酶的作用位点,3,羟胺裂解法,羟胺（,NH,2,OH,）,在碱性条件下（,pH 9.0,）能专一性裂解,-Asn-Gly-,间的肽键，也能部分裂解,-Asn-Leu-,或,-Asn-Ala-,间的肽键；在酸性条件可以断裂,-Asp-Pro-,间的肽键，产率可达,80%,。,4,部分酸水解,一般认为酸水解没有什么专一性而被忽视，后来发现部分酸水解还是有一定的专一性。,在,稀酸,的条件下，也即在高浓度胍的甲酸中（,pH 2.5,），可裂解,-Asp-Pro-,间的肽键，产率高达,80%,90%,。,在,浓酸,条件下，含羟基氨基酸氨基端肽键容易断裂。,但是终究部分酸水解的专一性差，副反应多，此法比较难掌握。,三、肽段的分离提纯,肽链经部分裂解得到肽片段必须分离提纯，才能进一步测定其氨基酸顺序。,先采用凝胶过滤，得到不同相对分子质量的肽片段组分，同时也脱去了样品中的盐类。然后，肽片段组分可用离子交换层析进一步提纯，也可应用双相高压纸电泳和层析相结合的方法，,HPLC,或,FPLC,具有更高的分辨率,。,第四节,肽段的氨基酸顺序测定,目前，进行蛋白质序列测定有二个关键步骤，即：,氨基酸残基一个一个,依次,从蛋白质和多肽的末端切割下来。可采用化学法或酶法进行裂解。可以从蛋白质和多肽的,N,端进行裂解，也可以从,C,端进行分析。,正确鉴定每次切割下来的氨基酸残基。利用高效液相色谱，对带有生色基团的氨基酸残基进行分离分析。,二、,N,端蛋白质序列仪,三、影响,N,端,Edman,反应裂解率的因素,第四节 肽段的氨基酸顺序测定,四、,N,端测序前样品处理,一、,N,端测序原理,五、,C,端测序原理,六、,C,端蛋白质序列仪,七,、,C,端测序样品前处理,八、影响,C,端测序反应产率的因素,一、,N,端测序原理,至今应用最广的,N,端顺序测定法大多仍以,Edman,降解原理为基础。,偶联：蛋白质和多肽的自由,-,氨基经与异硫氰酸苯酯,(PITC),试剂偶联，与其紧挨的第二个残基的键合力大大减弱，很容易断裂。,裂解：在无水条件下酸裂解，仅仅切下反应的那个残基，得到,ATZ,-氨基酸,。紧挨的第二个氨基酸残基暴露出自由的,-,氨基，又可与,PITC,进行偶联反应。,转化：,ATZ,-氨基酸不稳定，三氟乙酸水溶液（25%）条件下可转化成稳定的PTH-氨基酸。,PTH-氨基酸的鉴定：可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及质谱等各种手段进行分析。,二、,N,端蛋白质序列仪,自,70,年代初自动序列仪诞生以来，经过了一系列更新换代，仪器日趋灵敏、快速，下面就其中几种代表性的仪器作一简单介绍。,1,液相旋转杯序列仪,这是最初的自动化仪器。整个仪器的“核心”部分是一个反应杯，它由一个马达带动并有调速控制。,蛋白质或多肽样品经溶解后，通过一根导管注入反应杯,中，样品随着旋转的离心力被均匀地涂在杯壁上，形成一层,薄膜,，其厚薄可由转速控制。反应的试剂和溶剂分别通过导管进入反应杯，与杯内薄层上的样品的,N,端自由氨基进行,Edman,反应；降解下来的,ATZ,氨基酸衍生物通过另一导管引出并收集，再将,ATZ,氨基酸转换成,PTH,氨基酸后进行鉴定，依次循环分析。此仪器由于消耗的样品量多，目前在蛋白质化学实验室已很少作用。,2,固相序列分析仪,由于一些小肽或疏水性多肽，不易吸附在一般支持物上,(,如旋转杯,),，只得将它们,共价固定在惰性载体,后进行,Edman,化学降解反应。,固相测序的优点是样品共价结合后，不会在有机溶剂洗涤，抽提等过程中丢失，因而可以增加循环次数。其缺点是共价结合不外乎通过氨基或羧基与载体上的活性基团作用，蛋白质和多肽中的谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸等含有除,-,氨基或,-,羧基以外氨基或羧基的氨基酸残基将结合在载体上，不能正确确定。,3,气相序列仪,用,弹筒型玻璃反应室,(,内部体积约,0.05ml,）代替了液相序列仪中的旋转玻璃杯，用一种,四级铵盐聚合物“polybrene”,固定样品，,Edamn,降解反应中有的试剂如三甲胺以,气体方式输送,，其它试剂以流动或液相脉冲方式输送。,优点：,灵敏度高，耗费样品量少，通常仅需,10100 pmol,；试剂和溶剂消耗少，大约是液相序列仪的,1,10,，降低了费用；缩短了每步降解循环时间，提高了分析效率。,三、影响,N,端,Edman,反应裂解率的因素,在测序中往往可以发现，即使,N,端很均一的蛋白质,(,第一个循环出现单个氨基酸残基,),，经过十几个循环后,背景明显不及第一个残基清晰,。这是由于,Edman,反应是一个化学过程，在其偶联、裂解、转化等步骤都有可能发生一些副反应，从而影响最终裂解效率。,例如,三氟乙酸除起裂解作用外，可能与,丝氨酸,Ser,和,苏氨酸,Thr,上的羟基反应，继而部分封闭,Ser,和,Thr,的,N,端,-,氨基，导致,Ser,和,Thr,时产率突然降低。,丝氨酸和苏氨酸的,PTH-,衍生物也会部分转化成其他产物，造成产率的降低。,偶联试剂,PITC,本身也将发生副反应，形成一些“杂质”。,四、,N,端测序前样品处理,1.,纯度鉴定,宜采用多种互补有效的手段鉴定样品的纯度，如,SDS-PAGE,、反相,HPLC,、毛细管电泳、阴离子或阳离子的,FPLC,等。,2.,脱盐,可采用多种有效的脱盐方法如反相,HPLC,、凝胶过滤、透析、超滤等，但需注意在进行脱盐过程中除需考虑是否除盐完全外，所用试剂、仪器乃至操作规范也必须是测序级的，应尽量避免引入新的杂质。,3.,疏基修饰,4.,去除,N,端封闭的基团,五、,C,端测序原理,虽然建立在,Edman,化学法上的自动化,N,端测序技术日趋成熟，但仍有不少问题需借助,C,端序列分析来解决。,C,端测序尤其适合于基因重组蛋白是否正确表达的鉴定和大规模生产时的质量控制、,N,端封闭蛋白的分析以及,DNA,探针的设计。,原理,基于与,N,端,Edman,降解类似的原理，,C,端分析采用化学试剂与蛋白质和多肽的,-,羧基反应,，反应后的,C,末端衍生物,被切割下来，通过,HPLC,系统进行,分离分析,。一个完整的,C,端序列分析包括以下几个步骤。,(1),活化,蛋白质和多肽,C,端的自由羧基与乙酸酐反应生成混合酸酐，并进一步环化成聚噁唑酮，而侧链上的羧基形成的混合酸酐则难以成环。,C,末端的聚噁唑酮在四丁基铵硫氰酸盐的作用下，转,化为乙内酰硫脲,(TH),。,(2),酰胺化保护侧链羧基,侧链羧基形成混合酸酐后，与哌叮硫氰酸盐（,piperidine thiocyanate,）进一步作用形成酰胺，以保护侧链。,(3),烷基化,由于,C,末端环化成的,TH,衍生物较为稳定而不易被切割，因此产率不高。用,Bromomethylna,phthylene,选择性地烷基化修饰硫原子，形成烷基化,-TH(ATH),衍生物，裂解产率将大大提高,.,。,(4),修饰,Thr,和,Ser,的羟基,蛋白质和多肽中的羟基会干扰测序，因此需要修饰。在活化过程中，乙酸酐也会与羟基反应将其乙酰化，但反应不完全，在,N-,甲基咪唑（,N-methlimidazole,，,NMI,）和乙酸酐的共同作用下，,Thr,和,Ser,上的羟基基本被乙酰化。,(5),裂解和衍生,C,末端的,ATH,衍生物在酸性条件下与硫氰酸盐反应而被裂解生成,ATH-,氨基酸，新的,C,末端自动形成,TH,，而不必重新活化。,因此，整个测序过程只需在开始时对,C,端进行一次性活化，并修饰,Asp,和,Glu,侧链羧基，以及,Thr,和,Ser,的羟基。,六、,C,端蛋白质序列仪,C,端序列仪一般由,N,端序列仪改装而成，其基本结构与后者相似，两者的不同之处主要在于,:,(1),反应所用的,试剂,不同，因此两者不可兼容，否则极易堵塞管道。,(2),在,C,端序列仪中，所有的化学反应均在弹筒型反应室中进行，切割下来的,ATH-AA,仅在转化腔内干燥和溶解后即进入,HPLC,系统分离分析。而在,N,端测序仪中，,ATZ-AA,需在转化腔中转化为,PTH-AA,。,七、,C,端测序样品前处理,C,端测序样品的纯度鉴定和疏基修饰方法与,N,端测序基本相同。,下面介绍,C,端测序样品的,脱盐,和,游离氨基的衍生,。,(1),脱盐的方法：,目前使用最普遍的,C,端脱盐方法是采用,ProSorb,装置,，,ProSorb,的结构及使用方法与,ProSpin,大致相同，不同的是用,filter,代替了,ProSpin,中的离心管，,fliter,可将样品中的小分子物质随水分一起吸收，以达到脱盐和浓缩样品的目的。,2)-,氨基的衍生,为了使,Lys-ATH,衍生物获得更好的分离效果，需先将蛋白质或多肽中,Lys,的,-,氨基,与,Phenylisocyanate(,PhNCO,),反应成衍生物,八、影响,C,端测序反应产率的因素,C,端测序副反应较多，最高起始产率仅为,20,，而对于,Glu,，,Asp,，,Ser,，,Thr,等氨基酸，其产率将更低。如,C,端富含上述几种氨基酸，测序将十分困难。另外，一旦遇到,Pro,，由于吡咯环的存在而不能与乙酸酐反应成环，整个测序过程将终止。,到目前为止，,C,端序列可测,l10,个残基，平均,35,个，一次测序需要的量比,N,端测序要大得多，至少需,1nmol