基于诊断核酸序列突变分析方法：PCR、杂交和NGS.docx

翻译自Diagnostics based on nucleic acid sequence variant profiling PCR,hybridization, and NGS approacheS
基于诊断的核酸序列突变分析方法：PCR、杂交和NGS
摘要
核酸序列的突变与许多疾病相关。对DNA/RNA类生物标记物的可靠检测和定量能够为我们提供有效的治疗方法，使精准医疗成为可能。临床使用的核酸分析技术可大概分为PCR、杂交和NGS这三类以及它们的混合使用方法。本文综述了当前主要商用分析方法的分子机制及其转化为体外诊断的进程。
目录
1. 前言 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0
2. 聚合酶链式反应 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
2.1. ARMS和相关技术. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0
2.2. Blocker PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
2.3. 多重PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
2.4. 数字PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0
3. 杂交 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
3.1. 微阵列 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
3.2. 荧光条码 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
3.3. 原位杂交 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
3.4. 其他读取方式 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
4. NGS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0
4.1. 主流NGS平台 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
4.1.1. Illumina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0
4.1.2 Ion Torrent . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
4.2. 其他NGS平台 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
4.2.1. Pacific Biosciences . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 0
4.2.2. Oxford Nanopore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
4.2.3. Genia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. 0
4.3. 序列富集 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0
4.3.1. 杂交捕获 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . 0
4.3.2 AmpliSeq . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
4.3.3. Droplet-based enrichment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0
4.3.4. Ligation-based enrichment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
5. 作者观点. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
5.1 合成生物学
5.2 合成生物学促进DNA诊断的开发
6. DNA诊断的未来
能力有限，翻译中有很多错误之处。强烈建议查看原文，以更好的理解作者的意图。
1前言
人体DNA序列的突变非常普遍；一些研究认为，两组不相干的人基因组中，每300个核苷酸中就有一个不同。由于这些突变发生在内含子或者是不改变氨基酸序列的无义突变，其中绝大部分对表型只有很小或者没有影响。然而大量的遗传性疾病是由单基因的序列突变引起的，而且突变在肿瘤生长和转移的过程中至关重要。同样，病原体DNA的序列突变也会对人体健康造成不同程度的影响，其中病原体的耐药性已经成为世界范围内的医疗卫生问题。
许多对序列突变的检测和定量技术被用于疾病和基因组的研究。这些技术可以概括为三类以及这三类的混合使用：聚合酶链式反应（PCR），杂交技术和下一代测序技术（NGS）（图一）。每种技术各有优缺点，本文会对他们进行比较分析。本文写作期间有大量的PCR和杂交分析技术被FDA认证批准作为体外诊断试剂。而NGS仍处于临床应用的初期，仅有illumina 和Ion Torrent 在2014年获得FDA认证。一些公司，特别是基因健康管理公司，通过实验室自建项目（Laboratory developed test，LDTs）而非体外诊断，来提供临床NGS分析服务，但是LDTs最近也被纳入FDA监管范围内。详情见BOX1对IVDs和LDTs的解释。

Figure 1 可用于序列突变检测和分析的技术汇总。三类方法：PCR、杂交和NGS。这三类技术会有所重叠，并且许多技术可以联合使用。
BOX1:
美国对于应用于临床的DNA检测的监管规则。
体外诊断（IVDs）。
美国政府定义IVDs：预期用途为疾病诊断或其他条件（健康状态测试，用于疾病的预防、治愈，缓解、治疗）的试剂，仪器和系统。医疗器械被分为一类、二类和三类。第三类需要最复杂和最严格的监管审查。大部分DNA检测被归为第二类医疗器械（比如肺结核PCR和囊胞性纤维症NGS）
FDA监管商用IVDs产品，对其安全性和有效性进行合理保证。为了能够合法出售IVD产品，需要提交给FDA一份上市前文件，满足以下要求之一：1）510(k)许可。2)创新许可 或3）上市前批准。
FDA510(K)许可（FDA cleared）是最容易通过的，但需要向FDA证明该产品“实质上等同”于以前通过FDA510(K)许可过的产品，最终都要追溯到1976年以前的产品或者是FDA新批准的产品。
如果新研制的产品如果没有合适的等同设备存在，那么也能获得许可，但FAD会认为该产品有低等到中等的风险。
FDA批准（FDA approved）是对第三类IVD产品的最高等级监管。
实验室自建项目（LDTs）。
在某个特定的实验室内一些新的检测项目被建立、评估和验证。这些检测项目叫做实验室自建项目。这种检测只能在该实验室内使用，不能外传或者出售给其他任何实验室或者医疗保健机构。通常情况下，实验室将选择开发和使用LDT是因为当前没有商业化试剂盒可用。
联邦政府通过医疗保险和医疗补助服务中心（CMS ）和临床实验室改进修正案（CLIA ）很大程度上地管理其开发、评估和实验室自建项目的使用。在美国大约有25万所CLIA实验室，其中绝大多数LDTs相对简单（如血液固醇检测）且没有经过FDA的评估。
IVDs是在一个地方生产出来然后卖给医院并给临床决策提供诊断信息的仪器或试剂盒。与之相反，LDT是医生或者医院把病人的样本邮寄给CLIA实验室，并在数天后收到实验室的检测报告。与IVDs不同，LDTs并不需要临床验证，尽管许多上市的LDTs进行过大量的临床验证，如基因健康公司的对乳腺癌复发可能性的预测的治疗标准OncoType Dx assay。
LDTS监管的不确定性，2014年10月，FDA提出了一个监管LDTs框架，被看作是应对越来越多的基于NGS的癌症检测LDTs的举措。FDA报告受到了病理学家，CLIA,CMS不同程度的质疑。美国病理学会和美国分子病理学会提出了建议以及替代方案。此文章写作期间，在未来，对LDT监管仍不明确。

DNA序列突变检测在疾病的学多阶段都是有用的，每一个阶段有不同的临床价值。详见BOX2，诊断测试的分类汇总。从技术层面来讲，序列突变检测中，应用不同需要的性能水平也会不同。比如生殖细胞常染色体显性突变风险评估中，50%的突变靶标可被稳定检测区分出来。对于用来检测并判断治疗方法的肿瘤活检样本来说，与野生型序列相比可能只包含5%的突变。对于非侵入性筛查和循环应用的外周血来说，DNA测试必须足够特异才能够检测到突变频率为0.1%或更低的等位基因。
临床应用的DNA分析技术的发展必然滞后于科学研究，因为对诊断测试来说，高分析精度是必要但不充分条件。FDA认为IVDs要满足临床所需求的高灵敏度和特异性。BOX3是对这些指标要求的详细说明。
BOX 2：DNA诊断的临床作用
能给为临床决策提供有用信息，是一个有价值的DNA诊断所必须的。因此DNA诊断测试可依据病人类型和根据检测结果所能得出的相应决策来分类。
1. 风险评估。一部分携带有种系突变的人群（可遗传）罹患某种疾病的风险要高。分析无明显病症的个体在将来患有某种疾病的可能性即为风险评估。例如Myriad Genetics公司推出的女性乳腺癌风险评估：BRCA1/2测试。
2. 筛查。对一些疾病来说，传统的诊断方法具有侵入性或不方便，因此在没有明确的疾病症状的情况下会很少使用。分析无明显病症的个体，尽可能在疾病发生的早期检测出来即为筛查。例如Exact Sciences公司为55岁以上人员提供的筛查结直肠癌的测试：ColoGuard test
3. 诊断。患者可能出现非特异的疾病迹象（比如：疼痛，低血压），许多疾病都有这些症状。诊断检测能够提供明确的疾病评估。例如：罗氏的SeptiFast 检测。可在6h内直接检测覆盖90%血流感染常见致病菌的25种细菌或真菌。
4. 预后。诸如癌症等疾病，有较长时间跨度和复杂的病情发展状况。疾病分级的预后分析能够提供能可供参考的治疗方案。例如：Genomic Health公司的 OncoType Dx检测，能够通过检测乳腺癌活体组织中相关RNA的表达水平，来评估乳腺癌复发的可能性，为患者是否需要化疗提供参考。
5. 疗法选择。对于某一疾病来说，有多种治疗方法。会根据功效、副作用和价格来选择治疗方法。许多癌症治疗方法，如酪氨酸激酶抑制剂，只对特意人群有效或者对耐受性肿瘤无效。例如：Foundation Medicine 公司的Foundation One panel分析了315个基因突变的转移性肿瘤，结果表明一线治疗方案对这些肿瘤无效。
6. 监控。随着治疗的进行，病人的病情会得到好转，但是复发的风险也会升高。通过对癌症患者外周血中DNA进行分析来监控术后病情，是一个能够提升治疗效果的有前途的新方向。尽管当下没有大范围使用的产品，一些公司如Sysmex Inostics 和Guardant Health已宣布将要研发对于低水平突变的癌症复发检测试剂。

BOX3：性能指标分析
在使用特异性和灵敏度这两个表述DNA分析性能的概念时，会有些许混淆。在实验室早期的概念验证阶段，一个DNA序列突变检测分析方法的分子灵敏度为：能够准确的检测出来的目的DNA序列的数量或浓度（例如20拷贝）。分子特异性为：目的突变DNA序列产生的信号高出野生型或其他突变的程度（如：检测到的阳性样本的信号值与阴性对照信号值的商）。对NGS来说，分子特异性即为其测序过程的固有错误率。
评估一个检测试剂的分析灵敏度和分析特异性，要有一套阳性和阴性对照样本，阳性对照样本有突变目的序列，阴性对照样本无突变。这些样本已经被第三方验证过。
分析灵敏度：阳性对照样本中，被评估试剂所能正确的检测出为阳性的样本所占阳性对照样本总数的比率。
分析特异性：阴性对照样本中，被评估试剂所能正确的检测出为阴性的样本所占阴性对照样本总数的比率。
一般情况下，一个检测试剂的分析特异性和分析灵敏度要非常接近100%，才能上市成为诊断试剂。
临床灵敏度和临床特异性要考虑对患者疾病诊断的有效性。临床灵敏度：正确的检测为阳性的病患数占disease-positive patients（有该疾病） 的比率。临床特异性：正确的检测为阴性的人数占disease-negative patients（无该疾病） 的比率。由于临床灵敏度和特异性不能用来计算低水平的信息如DNA靶标序列，所以要用其他算法来进行比较。通常，FDA需要公司提交临床灵敏度和特异性数据。
其他临床对比分析指标包括内容和平台的考量。内容即为被作为疾病检测靶标的基因或突变。平台即为运行检测程序的仪器和试剂。分析灵敏度和特异性展现平台的性能，而临床灵敏度和特异性则展现内容和平台两个方面的性能。内容和平台都可能成为诊断测试性能的瓶颈。

此外，市场一般要求这些测试能够为临床治疗提供有用的信息，否则这些测试就没有多少临床实用性，付费机构，如医保中心等就不会提供报销。最后，即使是FDA许可/批准医疗中心报销，IVD仍然面临消费者接受度低的问题。由于以上原因，许多有前途的技术在转化过程中失败。然而，随着公众关注度，政府支持和私人投资的增长，我们预想临床应用的DNA检测技术会在未来几年内不断增长。
本文不讨论第四种DNA分析和诊断技术，即等温扩增技术。普通等温扩增方法使用聚合酶以靶标序列为模板扩增产物，但是使用酶而不是高温来解链。等温扩增的优势在于只需要精准的温控系统即可，适用于POCT和资源设备匮乏的地区。然而等温扩增在精确定量，多重扩增和序列选择性方面表现较差，因此在医院实验室设备和研究中很少使用。
2 聚合酶链式反应
聚合酶链式反应是用引物，DNA聚合酶和dNTP扩增模板DNA分子的技术。反应液在至少两个温度下循环：一个使双链DNA变性的高温（如95℃），和用于引物结合和聚合酶扩增的低温（如60℃）。理论上每一个循环都会使目的序列量加倍，因此即使是很低拷贝的靶标DNA分子也能被快速扩增至能通过荧光或其他方法检测出的摩尔浓度级别。PCR是目前应用最广的DNA序列检测方法。
与其他两类检测技术相比，PCR的主要优势在于精确定量，高灵敏度和易于使用。比如，定量PCR作为DNA和RNA定量的金标准，通常被认为要比微阵列和NGS精确。PCR的主要弱点在于：由于引物二聚体的存在会造成假阳性或假阴性，而不能进行高通量分析。（多重PCR虽然增加了通量，但根本就不能与NGS和微阵列相比）
2.1 ARMS和相关技术
通过PCR检测序列突变主要依靠寡核苷酸的使用和设计（引物和blockers），来使其扩增突变序列的效率高于野生型。突变阻滞扩增系统（amplification-refractory mutation system，ARMS）是检测DNA序列突变，包括SNP的早期方法。ARMS的原理是：TaqDNA聚合酶缺少3’-5’外切酶活性，在一定条件下PCR引物3’末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变，设计适当的引物可以通过PCR方法直接达到区分突变性和野生型基因的目的(Fig. 2a)。
对单核苷酸多态性（SNP）来说，其等位基因突变的情况为50%或0%，ARMS引物有足够的特异性进行稳定检测，也就是能检测出来。但是对活检样本中的体细胞突变检测来说，突变只占到5%或者更低，这时ARMS引物就不能区分突变和野生型序列。一些热不稳定的或者易于被DNA聚合酶识别的错配会导致对野生型的扩增而造成假阳性，这个问题可以通过在正义链或者反义链上设计引物来缓和，DNA的两条链都可以被用来设计引物。另外可以有意在引物接近3’端的地方引入错配（也就是除了3’端的特异位点，可以人为地引入其他错配来增加特异性），当然，这样做会降低目标基因的扩增效率(Fig. 2b)。
许多公司都有以ARMS技术研发的试剂盒，比如凯杰therascreen，罗氏cobas研发有获得FDA批准的检测肺癌和结肠癌KRAS和EGFR基因突变的试剂盒。这些试剂盒可用石蜡包埋的组织切片进行测试。生物梅里埃THxID研发有获得FDA批准的检测黑色素瘤BRAF基因突变的试剂盒，同样可用石蜡切片。厦门艾德生物研发的大量癌症突变检测试剂盒获得FDA批准以及欧盟IVD产品认证。
等位基因特异性blocker PCR 中Blocker的应用以及竞争性等位基因特异性Taqman PCR（Fig.2c）使ARMS技术得到显著提升。Blocker是一个可以和野生型模板完美结合的寡核苷酸，从而抑制ARMS引物对野生型模板的结合。Blocker 需要进行化学修饰以阻止聚合酶在其3’端延伸（磷酸化或者加MGB），并增加其结合的稳定性。Applied Biosysterms 研发并上市了castPCR试剂盒，可检测45个癌症基因中的586个突变位点，只用于研究，并没有被FDA认可。
另一个等位基因特异性PCR的可用方法是使用两段引物（就是一个引物分为两段，中间可以连接，也可以不连），比如Seegene公司的DPO技术和Swift Biosciences的myT 引物（Fig.2d）。这些引物均包含一个长的5’区域，主要用来结合靶标基因并使杂交稳定，一个短的3’区域，主要负责特异性结合。DPO和myT引物比ARMS引物特异性更强，在短的3’区域的单个核苷酸的错配要比在长区域的错配更不稳定，也因此更特异。Seegene的单纯性疱疹病毒检测试剂盒已得到FDA的批准。

Fig2. 等位基因特异性PCR引物检测序列突变（a）ARMS引物。3’端能与突变序列完美结合，而与野生型发生错配。Taq或者其他DNA聚合酶对错配引物的扩增效率明显较低。（b）在3’端倒数第二个位置人为引入一个错配碱基，虽然扩增效率会有所降低，但是对野生型的扩增几乎完全被抑制。（c）asbPCR 和castPCR 中使用的ARMS 引物和blocker。Blocker与引物竞争性的结合野生型的模板，因此野生型扩增进一步受到抑制。由于杂交热力学，blocker对突变序列和引物的结合没有显著的影响。（d）DPO和myT 引物有两个片段组成， 一个较长的5’结合片段和一个较短的3’结合片段。DPO引物的两个片段间通过肌苷连接。myT引物的两个片段通过直角双链DNA连接。
2.2 Blocker PCR
另一种可供选择的PCR方法，是通过使用blocker 寡核苷酸抑制野生型扩增，来检测序列突变。引物一般没有等位基因特异性，如果没有blocker与野生型结合，引物会以大致相同的效率同时扩增突变型和野生型。Blocker PCR与ARMS相比的优势在于：首先，无需知道突变序列在blocker结合区域的序列信息。其次，在每个PCR循环过程中都能带来特异性，因为引物不能结合已被blocker覆盖的区域。相反，ARMS引物只有在扩增出特异性片段后，才会有特异性。
首次报道的使用blocker PCR的案例是使用肽核酸（PNA）blocker (Fig. 3a). DNA聚合酶无法置换或者降解PNA blocker，因此野生型的扩增在blocker结合区域被终止。设定合适的退火温度，使blocker与结合区域形成错配囊泡，不能顺利的结合突变序列。同样的逻辑可用于其他类型的blocker 分子：DiaCarta's xeno nucleic acids (XNA)，被修饰的核酸，比PNA更具亲和性，显著提高区分突变的能力。Biocept's Selector assay 是使用5’磷酸化修饰的DNA blocker作为经济可行的方案（PNA和XNA合成费用昂贵）。PNA Bio的PNAClamp assay可检测EGFR, KRAS, BRAF, PI3K,和IDH1基因的癌症基因突变，指导癌症治疗，已经获得CE-IVD认证。
另一种blocker PCR方法是低退火温度共扩增PCR（COLD-PCR）和相关的ICE COLD-PCR分析。这些分析方法依靠更加复杂的温控系统，促使blocker与野生型模板结合。Transgenomic 公司的MX-ICP分析便是基于ICE COLD-PCR，在美国已经作为LDT项目。
Integrated DNA Technologies研发了一种概念上完全不同的blocker PCR，即 RNAse H-dependent PCR (rhPCR)。与其他blocker作用方式不同，它的blocker的5’端是正常的引物，但是在3’区域的突变位点引入了一个RNA核苷（本来是A现在是rA），这个核苷的存在能够阻止DNA聚合酶的扩增，当这个Blocker或者说primer/blocker与突变序列结合后，rA与模板配对，然后被RNAse H2酶剪切，剪切后的引物在DNA聚合酶的作用下进行扩增（RNAse H2能够特异性消化DNA-RNA杂合链中的RNA常用于cDNA第二链的合成。RNAse H2不能消化单链DNA、单链RNA、双链DNA或双链RNA）。当primer/blocker与野生型模板结合后，rA并不能与模板匹配，因此就不能被RNAse H2酶剪切，也就不能进行扩增。（fig3b）与其他blocker技术相比，rhPCR技术的优点在于，RNAse H2的存在有效的抑制了引物二聚体的形成和基因组的非特异性扩增。

Figure 3 通过blocker PCR的等位基因突变扩增（a) blocker PCR：引物在待扩增模板的上游，Blocker与野生型序列能够很好的结合，而与突变序列不能完全结合。引物扩增野生型的时候会被Blocker阻止。这里用的blocker 可能是PNA (PNAClamp), XNA (DiaCarta), 或者5’端磷酸化修饰的DNA(Biocept) (b) rhPCR：含有RNA核苷的引物结合突变序列后，被RNAse H2酶剪切，能够正常扩增。而结合野生型的引物并不能被RNAse H2酶剪切，因此就不能进行扩增。
2.3 多重PCR
以上所述的PCR都有一个问题，多重扩增即同时分析多个突变靶标序列。实现多重PCR需要克服三个主要难点：dNTP的消耗，不同扩增产物的监测和扩增过程中引物二聚体的形成。
在单重PCR中随着扩增子的积累，dNTP会逐渐被消耗。在多重PCR中，需要同时扩增多个靶标，高浓度靶标的扩增会显著抑制低浓度靶标的扩增。
实时PCR(如定量PCR)需要通过荧光来反应每个循环中扩增子的浓度。Cq值是PCR扩增过程中，扩增产物（荧光信号）到达阈值时（进入指数增长期）所经过的扩增循环数，与靶标的最初浓度成对数-线型相关。可检测并区分的荧光数量限制了同时定量检测目标的个数。传统的检测荧光有5个。
引物二聚体，是引物之间互作形成的短片段扩增子，这些扩增子与靶标序列毫不相干。单重PCR只有2条引物，认真的设计和优化能够有效避免引物二聚体的产生。但是在多重PCR中可能有2N条引物，每条引物都可能与其他引物形成引物二聚体，因此有4N2种可能性会形成引物二聚体。实际应用当中的情况会更加复杂，引物二聚体的情况会更严重。
工程学上的解决多重PCR问题的方法是研发仪器和一次性芯片把PCR反应液进行空间分隔，使得每一部分只有一对引物。Biofire Diagnostics (现在属于Biomerieux)开发的FilmArray系统可以同时扩增10个靶标（已经可以20个以上）。Biofire拥有FDA许可的呼吸道和胃肠道感染病检测试剂组。Cepheid 2012年发布的一款仪器可进行1000重的PCR分析，相关仪器和试剂已获得FDA认证和批准。
2.4 数字PCR
使用传统PCR方法对低频率的等位基因突变进行检测，在稳定性和定量方面一直面临挑战。即使用最优化的引物和Blocker，由于分子互作的随机性，对野生型序列的扩增也将不可避免的始终存在。尤其是在突变序列的检测中，等位基因频率的定量会受到每步扩增放大的影响。
数字PCR (Biorad ddPCR，Rain Dance RainDrop)是把单重PCR反应溶液分散到成千上万个液滴当中，这些液滴是由反应液和油混合形成的乳剂（Fig.4）。通过其他微流控方法也可以把反应液进行分散处理(Thermo Fisher Open Array, Fluidigm BioMark)。数字PCR的优势是通过把反应液分散为大量的液滴，每一滴里面预期会有0或1个拷贝数的目的序列。0和1最终的形成的信号完全不同，有阳性扩增的液滴因此就能很容易的与无模板的液滴区分开来。由于出现阳性扩增的液滴的数量可直接计数得到，因此定量就变得非常简单。
目前，数字PCR被用于学术和临床研究，而且也被LDT采用。例如：Trovagene PCM V600E 便是使用数字PCR对尿液样本中BRAF突变的细胞游离DNA进行检测分析。

Fig 4 数字PCR。含有样本DNA和PCR试剂的溶液通过微流控与油混合产生纳升到皮升大小的液滴。每一滴可视为单独的PCR反应液，且每滴仅含有一个或者数个模板分子。因此，很容易区分目的突变和野生型模板的扩增信号。
3．杂交
杂交是指合成的DNA引物或探针以碱基配对原则结合DNA靶标序列的过程，是现代DNA分析和诊断技术的基础，但是如果没有DNA扩增或信号放大技术，杂交技术不可能拥有现在的分子灵敏度。通常，杂交会与PCR或者荧光显微镜联合使用。近来在传感器技术上的进步让杂交技术不用再依赖DNA扩增。这使得杂交技术可以与PCR和NGS相比肩。
与其他两种技术相比，杂交的优势在于：简单、多重和抗变换性，因为是生物物理现象，所以杂交不像酶那样只能在某些条件下反应，它可以在许多缓冲条件下进行。杂交的弱势在于它不能扩增序列，且必须联合信号放大技术或者高灵敏度的信号读取仪器使用。
3.1 微阵列（基因芯片）
微阵列通过空间上的合理排列实现多重读取。不同序列的DNA探针被固化在芯片表面的不同位置。通过末端转移酶在含有目的片段核酸样本的3’端添加荧光标记物，然后与微阵列杂交。若有目的片段结合到探针上，便在探针的位置上产生荧光斑点，荧光的密度表示目的片段的量（Fig 5）。

Fig.5. DNA微阵列分析RNA的表达。被分析的RNA或cDNA 会被末端转移酶连接上荧光标记物，然后与微阵列上的不同序列和位置探针进行杂交。特定位置的荧光密度表示目的片段的量。
微阵列可直接用来检测样本总量大、表达量高的RNA（无需核酸扩增），也可被用来检测多重PCR反应生成的扩增子。微阵列的灵敏度取决于目的片段与微阵列的杂交效率、照相的荧光显微镜的灵敏度以及微阵列芯片的本底荧光。昂飞公司的基因芯片技术可以在一个芯片上合成上百万个不同的探针，检测限达到每孔1-10拷贝个mRNA。
原则上，微阵列能够对核酸浓度进行高质量的定量。但是实际上，不同的基因和转录组、不同的微阵列平台甚至是同一生产商生产的不同芯片都会影响微阵列的定量。第一、杂交量和动力学与芯片表面的探针密度是非线性相关的：高密度的探针之间会非特异性的杂交并随机延伸。第二、目的片段的序列和长度会影响杂交。第三、临近的DNA序列和其他光谱接近的荧光会对荧光强度产生影响。因此，经过优化的微阵列可被认为对不同核算靶标只能提供可重复的相对定量而不是绝对定量。
FDA批准或者许可的微阵列诊断试剂：Agendia's MammaPrint assays能够通过对70个基因的表达分析，提供乳腺癌复发的风险分析。Autogenomics INFNITI CYP2C19 assay能够分析基因多态性，以此来指导抗抑郁药和抗癫痫药的用药。Affymetrix's CytoScan Dx能够检测染色体突变，对发育迟缓，智障和先天畸形进行评估。另外，安捷伦的SurePrint基因表达微阵列正在等待FDA许可。
3.2荧光编码技术
荧光编码技术总共包含有100-1000种荧光编码可供选择和多重读取。荧光编码技术可分为两类：荧光强度编码技术和荧光条形编码技术（Fig6）。荧光强度编码根据荧光强度的不同来识别目的序列。Fig6a展示了Luminex 的荧光强度编码技术xTag，其原理为：用不同配比的两种红色分类荧光染料将直径为5.6微米的聚苯乙烯微球染成不同的荧光色（只是荧光强度不同，应该是同一通道，不同荧光强度就是识别条码），把针对不同待测物的抗体分子或者基因探针以共价交联的方式结合到特定的编码微球上，每个编码微球都对应相应的检测项目。先把针对不同待测物的荧光编码微球混合，然后加入待测物质或者待测的扩增片段，所形成的复合物再与标记荧光素发生结合反应。微球在流动鞘液的带动下单列依次通过红绿激光，红激光用来判定微球的荧光编码，绿激光用来测定微球上报告分子的荧光强度。从而达到快速准确的定量检测目的。假设每种荧光染料的荧光强度可以被区分成30个等级，那么xTag技术就有900个编码可用。Luminex研发的基于此技术的的呼吸道疾病诊断系统已经获得FDA批准。
荧光条形编码技术是根据荧光的排列顺序来识别目的序列。Fig6b展示了通过电场拉伸核酸条码的Nanostring技术， 条码有6个不同的位点，每个位点有四种荧光可供标记。相邻位点的荧光必须能够区分开来，排除掉这些组合后，仍然有972种可能的条码组合。原理是设计出捕捉探针和报告探针两种探针，分别与靶mRNA结合。其中捕捉探针标有生物素，用于将杂交复合物固定在cartridge板上；报告探针则带有四色荧光基团，其不同的排列组合方式代表不同的目的基因。将总RNA与这两种探针进行杂交、纯化、固定，扫描报告探针尾部的荧光集团确定其捕获的基因及其表达量。由于基因表达量的鉴定是由荧光集团的排列组合决定的，背景噪音不会影响基因的定量，因此该方法与基因芯片相比具有极高的灵敏度，可用来检测极低丰度的mRNA，即使每个细胞只表达单个mRNA也能够被检测出来，且其精确性与real-time PCR相当，但通量则比real-time PCR高得多。Prosigna是Nanostring研发的通过分析50个基因的表达水平来评估乳腺癌复发可能性的产品，已得到FDA许可。
Firefly Bioworks（已被Abcam收购）研发了另一种荧光条形编码技术，其微米尺寸的水凝胶粒子以其较大的体积和先进的纳米制造技术，可用的条码要比以上几种方法要多得多。Abcam已经把此种技术应用到 microRNA的分析研究中。
原图图片易让人误解，换了一个。报告探针有6个荧光位点，每个位点有四种荧光可供标记，这样就有46种可能的组合。
每条都有六种荧光
这都应该是六个位点，作者意思是四种荧光

Fig 6 基于核酸杂交的荧光编码技术。（a）Luminex xTag 荧光强度编码，每个微球有两种荧光染料，两种荧光染料的强度可以用来区分微球上标记的是什么探针，然后通过第三种荧光来检测是否存在目的序列。（b）Nanostring nCounter 条形编码技术。靶标RNA先和报告探针、捕获探针结合形成三聚体，然后依靠捕获探针上的生物素固定在平台上，施加电场，此时三聚体的核酸链成线性伸展开来，就会看到不同荧光斑点组成的条带。
3.3 原位杂交
原位杂交（In situ hybridization, ISH）不仅能够提供靶标基因的序列和浓度，还能在组织标本上对靶标进行定位，使得ISH特别适合对异质细胞或组织样本的拷贝数突变（CNVs）进行检测分析，而且检测信号非常强。
进行原位杂交首先要把需