实验三-单向琼脂扩散实验.ppt

Text:24 pt.with 24 pt.square bullet,Subpoint,Subpoint,Subpoint,Text:24 pt.with 24 pt.square bullet,Subpoint,Subpoint,Subpoint,Title(no leads)(30 Pt.)Times bold,Text:24 pt.with 24 pt.square bullet,Subpoint,Subpoint,Subpoint,Text:24 pt.with 24 pt.square bullet,Subpoint,Subpoint,Subpoint,Title(no leads)(30 Pt.)Times bold,Text:24 pt.with 24 pt.square bullet,Subpoint,Subpoint,Subpoint,Text:24 pt.with 24 pt.square bullet,Subpoint,Subpoint,Subpoint,Title(no leads)(30 Pt.)Times bold,Text:24 pt.with 24 pt.square bullet,Subpoint,Subpoint,Subpoint,Text:24 pt.with 24 pt.square bullet,Subpoint,Subpoint,Subpoint,Title(no leads)(30 Pt.)Times bold,Text:24 pt.with 24 pt.square bullet,Subpoint,Subpoint,Subpoint,Text:24 pt.with 24 pt.square bullet,Subpoint,Subpoint,Subpoint,Title(no leads)(30 Pt.)Times bold,单向琼脂扩散实验,江南大学微生物与免疫学实验室,教学对象：强化班学生,实验课时：,3,学时,课程类型：专业实验课,课程要求：必修,每组人数：,4,人,实验目的与要求,掌握单向琼脂扩散试验的原理、结果分析及应用,实验原理：,将适量的抗体均匀混入琼脂内制成琼脂板，打孔，在孔中加入一定量的待测抗原，抗原向四周呈辐射状扩散，与抗体相遇，在比例合适时形成白色沉淀环。沉淀环直径的大小与抗原含量成正比，用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，从标准曲线上，可以查出待检样品中抗原的含量。本试验主要用于检测标本中各种,免疫球蛋白,和,血清,中各种补体成分的含量，敏感性很高。,单向琼脂扩散试验,试剂与器材,羊抗人,IgG,血清,待检人血清,标准参考血清,pH7.4 0.01M PBS,缓冲液,琼脂粉,载玻片、打孔器、,37,恒温箱、湿盒、可调微量加样器等；,单向琼脂扩散试验,实验方法,标准曲线的制备,1,制作琼脂板所需要的,1.5%,离子琼脂，首先分装其,1/2,量的,3%,盐水琼脂，溶化后置,56,水浴中平衡温度备用。,2,稀释抗体，用,pH7.4,的,PBS,稀释标准抗人,IgG,抗体，使最终浓度为抗体效价的一倍，其分装量应与,3%,盐水琼脂量相等。,3,制备琼脂板：将已稀释的抗人,IgG,抗体于,56,水浴中预热，再倾注于已溶化并维持,56,的,3%,盐水琼脂中混匀，取,5ml,即刻倾注于玻片上，待凝固后即可。,4,打孔：将琼脂板置于模板上，在同一直线上用打孔器打孔,4,个，孔距,10mm,。,单向琼脂扩散试验,实验方法,标准曲线的制备,5,用,PBS,缓冲液稀释不同浓度的标准参考蛋白：浓度分别为,800mg/L,、,400mg/L,、,200mg/L,、,100mg/L,。,6,加样：将已稀释的不同浓度的工作标准蛋白依次用微量加样器每孔加入,10ul,。,（注意：每一稀释度均应更换塑料吸头）,。,7,将加样的琼脂板放湿盒中，置,37,温箱，,24,小时后观察结果。,8,用尺子测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为纵座标，以标准参考蛋白量（单位,/ml,）为横座标，绘制成标准曲线。,单向琼脂扩散试验,实验方法,人血清中,IgG,正常值的测定：,1,将已制备好的抗体琼脂板置于打孔模板上，每一琼脂板可打孔,2,个。,2,取正常人血清，用,PBS,做,1:4,稀释。,3.,用微量加样器分别取稀释后人血清标本,10,l,加入孔中，每份各加两孔。,4.,作好标记放湿盒中，置,37,温箱，,24,小时后观察结果。,单向琼脂扩散试验,结果计算,分别量取各孔样品沉淀环的直径，根据提供的参考标准曲线，计算待检血清中各种免疫球蛋白的含量,成人血清中,IgG,范围,7001660mg/L,单向琼脂扩散试验,实验结果,单向琼脂扩散试验,实验结果,单向琼脂扩散试验,注意事项：,制备抗体琼脂板时，琼脂温度必须严格控制，温度太低琼脂会凝固，太高则会影响抗体的活性；,加样孔内的琼脂应挑干净，切不可损坏孔的边缘，确保每孔的液面基本一致；,加样量一定要精确，并且不能逸出孔外，否则结果不好观察；,加样时，吸取每份标本均应更换塑料吸头；,实际检测过程中，标准曲线必须与样品测定同时制备；,孵育时间应控制在,2448,小时，时间太短可能产生不了沉淀线，时间太长会造成沉淀线的扩散。,单向琼脂扩散试验,