普通生物学实验讲义报告.doc

普通生物学实验（动物、植物）

实验一（1） 普通光学显微镜及其使用
一、实 验 目 的
了解普通光学显微镜的构造及其原理，并熟练掌握其操作方法。
二、实 验 用 品
普通复式光学显微镜、载玻片、盖玻片、滤纸、擦镜纸。
三、实验原理和方法
普通光学显微镜从构造上可分光学、机械和电子三大系统。
1、显微镜的光学系统
光学系统通常由物镜、目镜、聚光器和光阑组成。
1)、物镜(objective)
显微镜的质量主要取决于物镜。物镜种类繁多，性能相差悬殊。物镜的放大倍数用数字表示，如4、10、20、40和100等。
a．干燥系(drysystem)物镜
镜检时，物镜与盖片间，不添加任何液体。如4×、10×、20×和40×物镜都属干燥系，使用时不加用任何浸液，只以空气为介质，其折射率为1，所以干燥系物镜的数值孔径小，分辨率亦低。
b．浸没系(immersionsystem)物镜
物镜在使用时，前透镜与盖片之间浸满液体。依充添的浸液的不同，主要可分为油浸系(oil immersion)和水浸系(water immersion)等类别。最常用的浸没液为香柏油(cederoil)，其折射率为1.515，与玻片的折射率相近，且不易干涸。使用水浸物镜时加用水，其折射率1.33。
油浸物镜外壳上刻有：“oil”、“oel”、“imm”和“HI”等字样，水浸物镜刻有“W”或“Water”字样；油、水浸两用物镜则刻上“oil+w”字样；甘油浸没物镜刻有“Glyc”或“Glyz”等字样。
2)、目镜(eyepiece，ocular)
目镜作为影像和肉眼间的放大镜，将物镜映来的影像做第二次放大。同时，目镜作为物镜的补偿，把物镜残留下的像差给予进一步校正，以提高造像质量。目镜作为投影器，把放大的影像投射在摄影暗箱的焦平面上。
目镜通常由两片(组)正透镜组成，上面的透镜叫接目或眼透镜(eye—lens)，它决定倍数和成像的优劣；下面的透镜叫会聚透镜(collectivelens)或场镜(fieldpiece)，它使视野边缘的成像光线向内折射，进入眼透镜中，使物体的影像均匀明亮。上下透镜的中点，或场镜下面设有用金属制造的光阑叫做视野光阑或场光阑(field stop)。场镜或物镜在这个光阑面造像，在光阑上可装入各种目镜测微计、十字线玻片和指针等。由眼透镜射出的成像光线基本上为平行光束，并在目镜之上约10mm处交叉，此交叉点称作出射光瞳。
3）聚光器(condensers)
聚光器等聚光系统，使来自光源的光线放大，并聚成光束，透过载片照明样品，射入物镜。聚光器由聚光镜和孔径光阑(aperture diaphragm)构成。聚光镜属正透镜系统，由一至数片透镜组成，具会聚作用，把照明光线会聚放大，射向被检样品，进入物镜。孔径光阑位于聚光镜下方，光阑的孔径可变，以改变照明光束的直径，调节进光量。孔径光阑的开度，即聚光器数值孔径，左右显微镜的成像质量。物镜的有效数值孔径，其中涵容聚光器的数值孔径，即:
物镜的有效数值孔径＝物镜数值孔径＋聚光器数值孔径/。

2、显微镜的照明
普通光学显微镜，普遍采用中心亮视野透射照明法。
照明光源：照明光源以钨丝灯和卤钨灯为多。卤钨灯优于钨丝灯，为显微镜的主要光源。
3、光路及成像
显微镜的光路或光程(1ight path)即光源照明的通路。光路始于光源灯，光源装在镜座后方的灯室(1amp housing)内。光源灯丝(S)发出的色光，由聚光透镜集光成束或光锥，经镜座中的视场光阑(L)投向反光镜，呈现45°折射向上，入射孔径光阑，光源灯丝在此平面处第一次成像(S1)。透过聚光镜使光线放大、聚集，透射、照明载物台的样品，视场光阑在此平面处第一次成像(L1)，即在样品聚焦的同时，可见清晰的、缩小的视场光阑的影像。成像光束继而进入物镜，在物镜的后焦面(rearfocal plane)的平面处，光源灯丝第二次成像(S2)。成像光束经转折进入目镜，在目镜的场光阑平面处，视场光阑第二次成像(L2)。最终，成像光束从目镜眼透镜射出，在目镜的出射光瞳处，光源灯丝第三次成像(S3)。视场光阑的第三次成像(L3)在人眼的视网膜上。在成像系统中，一个位置的改变，会引起整个成像关系的改变，光源灯前后位置的稍许位移将导致光源成像位置的变动。4、放大率(magnification)
显微镜最后形成的物体放大影像，对被检物体的大小比例称为放大率，即像高比物高。放大倍数以长度计算，而不是以面积或体积计算。
某些显微镜为适应不同需要，镜筒内装有倍数不同的附加透镜系统。在专用的显微摄影装置中，附有摄影透镜(photographic lens)。显微摄影总放大率的计算，除目镜、物镜的放大率外，摄影透镜的放大率亦要计算在内。
显微镜的总放大率(Mt)应为； Mt＝Mob×Me×Mph
Mob：物镜放大率 Me：目镜放大率 Mph：摄影透镜放大率
5、显微镜的使用

正确、合理地使用显微镜，是做好镜检和显微摄影的前提。
1）光路合轴调整
照明光束应与显微镜的光轴合一，使光源均匀地照明视场。镜检和摄影前，光路要合轴调整，使照明光束与显微镜的光轴于同一轴线上。光路系统中的目镜、物镜和视场光阑位置固定，勿需调整，仅聚光器可调。因此，光路的合轴实为聚光器和光源灯的调中。

a.聚光器的调中
聚光器的调中步骤如下：
(1)转动聚光器升降旋钮，把聚光器升至最高位置。
(2)接通光源灯的电源开关。
(3)将制片标本放在载物台上，用4X或低倍物镜对样品聚焦。
(4)缩小视场光阑，在视场中可见边缘模糊的视场光阑图像。
(5)微降聚光器，至视场光阑的图像清晰聚焦止。
(6)用聚光器两个调中的螺杆推动聚光器，使缩小的视场光阑的图像，调至视场中心。
(7)开放视场光阑，使多角形的周边与视场边缘相接。
(8)反复缩放视场光阑，确认光阑中心和边缘与视场完全重合。
(9)使聚光器回复顶点位置。
在视场中，通过观察视场光阑影像的相对移动，使聚光器调中，达到光轴合一。
2）光阑及其使用
显微镜有两种光阑：视场光阑和孔径光阑。视场光阑控制照明光束，限定视场大小。孔径光阑通过光阑的放缩，限定，聚光镜的孔径大小。两者皆为可变光阑(irisdiaphragm)，正确调节和使用光阑，是保证镜检和摄影质量的重要环节。
四、思 考 题
1．物镜的种类各具何种特点?
2．目镜在显微镜的成像上起何作用?
3．聚光器的构成及其作用?
4．如何进行光路合轴调节?
5．物镜和目镜的选用及其组合的原则?

实验一（2） 细胞的形态与结构
一、实验目的和要求
1、 学习并掌握显微镜的正确使用方法。
2、 了解真核细胞的各种形态和基本结构。
3、 学习临时装片标本的制作方法。
4、 了解植物细胞中贮藏的内含物种类及其特性。
二、实验原理
细胞是构成植物体的基本单位，也是植物生命活动的基本单位。根据细胞的结构和生命活动的方式，可以把构成生物有机体的细胞分为两类，即原核细胞和真核细胞。原核细胞内没有典型的细胞核，也没有分化出以膜为基础的具有特定结构和功能的细胞器；而真核细胞的DNA主要集中在由核膜包被的细胞核中，并分化出多种以膜为基础的细胞器。高等植物核绝大多数低等植物均由真核细胞构成。
植物细胞通常很小，其直径一般在20~50μm之间，因而要借助显微镜才能观察到。但也有少数植物细胞，如苎麻(Boehmeria nivea)的纤维细胞长可达550mm，用肉眼即可看到。尽管不同植物细胞在形态、大小上有一定差异，但它们的基本结构是一致的。
三、实验材料和用品
实验材料：1、洋葱鲜鳞茎。
2、新鲜菠菜。
3、马铃薯块茎。
4、新鲜花生米或菜豆种子。
实验器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、剪刀、吸管、尖头镊子、刀片等
实验试剂：
1、碘－碘化钾溶液：
取3g碘化钾溶于100ml蒸馏水中，再加入1g碘，溶解后即可使用。此液应放在棕色试剂瓶中，暗处保存。
2、苏丹III染液：
、先将0.1g苏丹Ⅲ或Ⅳ溶解在50ml丙酮中，再加入70％酒精50ml。
四、实验内容
1、以洋葱鳞茎的表皮为材料，在光镜下观察植物细胞的基本组成和结构。
2、菠菜叶肉细胞中叶绿体的观察。
3、蚕豆表皮细胞气孔的观察。
4、运用特异性染色方法鉴定植物细胞中主要的内含物。
五、实验方法和步骤
1、物细胞结构的观察
1)洋葱鳞片叶表皮细胞临时装片标本的制作与观察
a. 取一洗净的载玻片，用纱布擦干，于玻片中央滴一滴蒸馏水，用尖头镊子从洋葱肉质鳞片叶内表皮撕下一小块表皮，铺在水滴上，用解剖针轻轻将其压入水中，使之展平。
b. 用镊子夹住洗净擦干的盖玻片的一边，使另一边接触水滴的边缘，然后慢慢地放下，以便驱走盖玻片下的空气，不致产生气泡。
c. 用吸水纸吸去盖玻片周围的水，于显微镜下观察。
d. 在低倍下，可见洋葱表皮细胞略呈长方形，排列紧密，每个细胞内有一圆形或扁圆形的细胞核。
e. 在盖玻片的一侧滴上一滴碘－碘化钾溶液，滴在盖玻片边缘的载玻片上，然后用吸水纸一侧将盖玻片下的水分吸去，把染料引入盖玻片与载玻片之间，对材料进行染色观察。
注意：1.撕表皮时不要把表皮撕得过大，如撕下的表皮面积大于盖玻片，要将表皮放在有水的载玻片上，用刀片切成小块，便于观察。
2.撕表皮时动作要迅速，勿将撕下的表皮在空气中暴露时间过久，以免使生活细胞由于失水而受到损伤。
3.撕开的一面最好朝上放在载玻片上，以利于染色和进行组织化学实验的观察。
4.撕下的表皮一定要平铺在有水的载玻片上，如发生褶皱或重叠要用解剖针将其铺平，以免影响观察效果。
2).菠菜叶肉细胞叶绿体的观察
取一新鲜菠菜叶片，用镊子撕去一小块下表皮，用小刀轻轻刮取一点叶肉细胞，制作菠菜叶肉细胞临时装片标本。将所制标本先置低倍镜下观察，然后再转高倍镜，注意叶肉细胞内叶绿体的形态、数目。
3).气孔的观察
取新鲜蚕豆叶片，用刀片在叶的背面轻轻划一个小方块，用镊子从切口处夹住表皮，并向切开的方向撕下表皮，放在载玻片上的水滴中，用镊子展平，盖上盖玻片，在显微镜下观察，先在低倍镜下找出比较薄的部位，然后换至高倍镜下观察。注意观察气孔的形态及类型。
4). 植物细胞的内含物
在细胞代谢活动中，常常有一些代谢产物以不同形式贮存在液泡、细胞质或细胞器中，其中有些物质，如淀粉、脂肪、蛋白质等可以通过特殊的显色方法显示出来。
取马铃薯(Solanum tuberosum)块茎切成两半，用解剖刀在切开的块茎表面轻轻刮一下，将附着在刀口附近的浑浊汁液放在载玻片上，用碘－碘化钾染色，然后盖上盖玻片，在显微镜下观察。
取一粒菜豆(Phaweolus vulgaris)种子，剥去种皮，用刀片对含有丰富贮藏物质的肥厚子叶做徒手切片，选取较薄的切片放在载玻片上，用碘－碘化钾染色，盖上盖玻片后在显微镜下观察。其中被染成金黄色的颗粒是糊粉粒，这是蛋白质的一种贮藏形式。
取花生(Arachis hypogaea)种子，做徒手切片，选取较薄的切片放在载玻片上，用苏丹III染色，然后盖上盖玻片在显微镜下观察。细胞内的脂肪被染成红色。
六、实验报告
1、 绘制洋葱表皮细胞及细胞核。
2、 绘图表示菠菜叶绿体的形态。
3、 绘制蚕豆表皮的气孔。
4、 制造临时装片应该注意些什么问题？

附 植物科学绘图基本方法
植物绘图是通过绘图的方式，来表现植物的一些重要形态解剖特征的常用方法。通过绘图，有助于对植物结构及其特征的认识和理解，是学习植物生物学必须掌握的技能，也是从事植物形态解剖以及分类学研究必备的常用技能之一。
一、绘图的基本要求
为保证所绘制的植物图示的形象与科学，应该注意以下几点：
⑴科学性和准确性 绘植物图不同于一般的美术创作，它必须具有高度的科学性和准确性。这就要求我们必须认真观察要画的对象(切片或标本等)，学习与之有关的文字记载及描述，正确理解了各部分的特征，然后还要选出正常的典型材料，才能在绘图时保证形态结构的准确性。
⑵点、线要清晰流畅 线条要一笔画出，粗细均匀、光滑清晰，接头处无分叉和重线条痕迹，切忌重复描绘。植物图一般用圆点衬阴，表示明暗和颜色的深浅，给予立体感。点要圆而整齐，大小均匀，根据需要灵活掌握疏密变化，不能用涂抹阴影的方法代替圆点。
⑶比例要正确 绘图是要安植物各器官、组织以及细胞等各部构造原有比例绘出，绘放大的解剖图或形态图时，最好要注明放大的倍数，如15×40等，也可以用单位短线表示出长度，如“└┘1cm”等(倍数一般以长度的比例为准)。
⑷突出主要特征 植物学绘图中允许重点描绘植物的主要形态特征，而其他部分可仅绘出轮廓，以表示其完整性。
⑸图纸及版面要保持整洁 绘图完成后，图纸及版面要整洁清晰。
⑹准确的标注 图注一律用正楷书写，应尽量详细，并要求用水平的直线引出，最好在图的右侧，必须整齐一致。作为实验报告，图及图注一律要求用铅笔，通常用2H或3H铅笔，不要用钢笔、有色水笔或圆珠笔。实验题目写在绘图报告纸的上方，图题和所用植物材料的名称和部位写在图的下方。
二、绘图的一般步骤
绘制植物图常常要运用多种测量、描绘的仪器用具，以达到描绘精确的目的。但对一个普通的植物学工作者或研究人员，只需要掌握最简单的绘图技能，即用铅笔直接绘图。应遵循以下步骤：
⑴构图 根据所要表达植物材料的内容要求，设计好所要绘制的各个部分各自所占位置，避免因画面设计不合理造成排列的混乱与失衡，影响绘图的质量。
⑵先绘草图再绘成图 用尖的软铅笔(HB)轻轻地在图纸上勾画出图形轮廓的草图，以便于修改。勾画时，要注意对照观察所画轮廓大小是否与实物相符合。正式绘制时要用2H或3H的绘图硬铅笔，按顺手的方向动笔，描出与物体相吻合的线条。线条要均匀，最好一次成图，不绘重线，以免模糊。
⑶概绘全图细绘局部 在绘植物的宏观解剖图时要先绘全形图，后绘部分的解剖图。边解剖观察，边描绘作图，严格地按一定次序解剖绘图。因材料放置的时间越短，特征就越明显，越不易遗漏。如绘花的外形图后，取出各花瓣一次摆在玻璃板上，一一绘出；然后绘雄蕊与雌蕊的子房、花柱及柱头等。
注意：绘轮廓时可采用各种辅助方法。如比例尺、坐标纸及实物测量等。如果绘的图是要出版或发表的，则还需要用绘图笔细致地描在硫酸纸上，或直接用电脑绘图。

实验二（1）   坐骨神经—腓肠肌标本制备
【实验目的】
学习动物学实验基本的组织分离技术；
学习和掌握制备蛙类坐骨神经-腓肠肌标本的方法；
掌握刺激的种类及形式。
【实验对象】
蟾蜍或蛙
【实验器材】
普通剪刀、手术剪、眼科镊（或尖头无齿镊）、金属探针（解剖针）、玻璃分针、蛙板（或玻璃板）、蛙钉、细线、培养皿、滴管、锌铜弓（或电子刺激器）、任氏液、食盐、1% H2SO4滤纸。
【实验方法与步骤】
本次实验首先由教师示教，然后同学三人一组（手术者一人、助手两人）各任不同的手术职责进行手术。
1. 破坏脑、脊髓
取蟾蜍一只，用自来水冲洗干净（勿用手搓）。左手握住蟾蜍，使其背部向上，用大拇指或食指使头前俯（以头颅后缘稍稍拱起为宜）。右手持探针由头颅后缘的枕骨大孔处垂直刺入椎管（图1-1）。然后将探针改向前刺入颅腔内，左右搅动探针2~3次，捣毁脑组织。如果探针在颅腔内，应有碰及颅底骨

图1-1 捣毁蟾蜍脊髓

的感觉。
再将探针退回至枕骨大孔，使针尖转向尾端，捻动探针使其刺入椎管，捣毁脊髓。此时应注意将脊柱保持平直。针进入椎管的感觉是，进针时有一定的阻力，而且随着进针蟾蜍出现下肢僵直或尿失禁现象。若脑和脊髓破坏完全，蟾蜍下颌呼吸运动消失，四肢完全松软，失去一切反射活动。此时可将探针反向捻动，退出椎管。如蟾蜍仍有反射活动，表示脑和脊髓破坏不彻底，应重新破坏。
2. 剪除躯干上部、皮肤及内脏 
用左手捏住蟾蜍的脊柱，右手持粗剪刀在前肢腋窝处连同皮肤、腹肌、脊柱一并剪断（图1-2），然后左手握住蟾蜍的后肢，紧靠脊柱两侧将腹壁及内脏剪去（注意避开坐骨神经），并剪去肛门周围的皮肤，留下脊柱和后肢（图1-3）。

图1-2横断脊柱 图1-3 剪除躯干上部及内脏
3. 剥皮 
一只手捏住脊柱的断端（注意不要捏住脊柱两侧的神经），另一只手捏住其皮肤的边缘，向下剥去全部后肢的皮肤（图1-4）。将标本放在干净的任氏液中。将手及使用过的探针、剪刀全部冲洗干净。

图1-4 剥去皮肤
4. 分离两腿 
用镊子取出标本，左手捏住脊柱断端，使标本背面朝上，右手用粗剪刀剪去突出的骶骨（也可不进行此步）。然后将脊柱腹侧向上，左手的两个手指捏住脊柱断端的横突，另一手指将两后肢担起，形成一个平面。此时用粗剪刀沿正中线将脊柱盆骨分为两半（注意勿伤坐骨神经）。将其中一半后肢标本置于盛有任氏液中备用，另一半放在蛙板上进行下列操作。
5. 辩认蛙后肢的主要肌肉
蛙类的坐骨神经是由第7、8、9对脊神经从相对应的椎间孔穿出汇合而成行走于脊柱的两侧，到尾端（肛门处）绕过坐骨联合，到达后肢背侧，行走于梨状肌下的股二头肌和半膜肌之间的坐骨神经沟内，到达膝关节腘窝处有分支进入腓肠肌。
6. 游离坐骨神经和腓肠肌
用蛙钉或左手的两个手指将标本绷直、固定。先在腹腔面用玻璃分针沿脊柱游离坐骨神经，然后在标本的背侧于股二头肌与半膜肌的肌肉缝内将坐骨神经与周边的结缔组织分离直到腘窝，但不要伤及神经，其分支待以后用手术剪剪断。同样用玻璃分针将腓肠肌与其下的结缔组织分离并在其跟腱处穿线、结扎。
7. 剪去其它不用的组织
操作应从脊柱向小腿方向进行。
（1） 剪去多余的脊柱和肌肉  
将后肢标本腹面向上，将坐骨神经连同2~3节脊椎用粗剪刀从脊柱上剪下来。再将标本背面向上，用镊子轻轻提起脊椎，自上而下剪去支配腓肠肌以外的神经分支，直至腘窝（图1-5A），并搭放在腓肠肌上。沿膝关节剪去股骨周围的肌肉，并将股骨刮净，用粗剪刀剪去股骨上端的1/3（保留2/3），制成坐骨神经-小腿的标本。
（2） 完成坐骨神经腓肠肌标本 
将脊椎和坐骨神经从腓肠肌上取下，提起腓肠肌的结扎线剪断跟腱。用粗剪剪去膝关节以下部位，便制成了坐骨神经-腓肠肌标本（图1-5B）。
8. 检验标本 
用沾有任氏液的锌铜弓触及一下（或电刺激刺激）坐骨神经或用镊子夹持坐骨神经中枢端，如腓肠肌发生迅速而明显的收缩，说明标本的兴奋性良好。标本浸入盛有任氏液的培养皿中备用。然后再依次用热玻棒、食盐（或1% H2SO4滤纸）刺激坐骨神经中枢端（或肌肉），观察肌肉收缩有何变化。如果放上食盐肌肉无动静，用任氏液将盐冲洗掉，再观察冲洗过程中肌肉收缩有何变化。

图1-5 分离坐骨神经（A）和坐骨神经腓肠标本（B）
【注意事项】
1. 避免蟾蜍体表毒液和血液污染标本，不可压挤、损伤和用力牵拉标本，不可用金属器械触碰神经干。
2. 在操作过程中，应给神经和肌肉滴加任氏液，防止表面干燥，以免影响标本的兴奋性。
3. 标本制成后须放在任氏液中浸泡数分钟，使标本兴奋性稳定，再开始实验效果会较好。
4. 热玻棒的温度应防止过高，以免烫伤标本。
实验二（2） 蛙离体心脏灌流标本的制备
【实验目的】
学习蛙离体心脏灌流标本的制备方法。
【实验对象】 蛙
【实验器材】
蛙类常用手术器械一套、玻璃分针、蛙板、蛙钉、蛙心插管、蛙心夹、试管夹、滴管烧杯、双凹夹、万能支架、细线、任氏液。
【实验方法与步骤】
本次实验首先由教师示教，然后同学三人一组（手术者一人、助手两人）各任不同的手术职责进行手术。
图2-1 插管进入心室示意图
离体蛙心灌流标本制备（斯氏蛙心插管法）：
取蟾蜍一只，打开胸腔，暴露心脏。在主动脉干下方穿双线，一条在左主动脉上端结扎作插管时牵引用；另一根在动脉球上方打一活结备用（用以结扎和固定插管）。 玻璃分针将心脏向前翻转，在心脏背侧找到静脉窦，在静脉窦以外的地方做一结扎（切忽扎住静脉窦），以阻止血液继续回流心脏（也可不进行此操作）。
左手提起左主动脉上方的结扎线，右手持眼科剪在左主动脉根部（动脉球前端）沿向心方向剪一斜口，将盛有少许任氏液、大小适宜的蛙心插管由此开口处轻轻插入动脉球。当插管尖端到达动脉球基部时，应将插管稍向后退（因主动脉内有螺旋瓣会阻碍插管前进），并将插管尾端稍向右主动脉方向及腹侧面倾斜，使插管尖端向动脉球的背部后方及心尖方向推进，在心室收缩时经主动脉瓣进入心室（见图2-1）。注意插管不可插得过深，插管的斜面应朝向心室腔，以免插管下口被心室壁堵住。若插管中任氏液面随心室的收缩而上下波动，则表明插管进入心室，可将动脉球上已准备好的松结扎紧，并固定于插管侧面的钩上，以免蛙心插管滑出心室。剪断结扎线上方的血管，轻轻提起插管和心脏，在左右肺静脉和前后腔静脉下引一细线并结扎（参考图2-1），于结扎线外侧剪去所有相连的组织则得到离体蛙心。此步操作中应注意静脉窦不受损伤并与心脏连结良好。最后，用任氏液反复换洗插管内的任氏液，直到插管中无残留血液为止。此时，离体蛙心标本制备成功，可供实验。
【注意事项】
1. 制备离体心脏标本时，勿伤及静脉窦。
2. 蛙心夹应在心室舒张期一次性夹住心尖，避免因夹伤心脏而导致漏液。
实验三 植物细胞死活的鉴定和组织渗透势的测定
一、实验目的
1、 利用质壁分离现象验证植物细胞的死活及测定植物组织的渗透势；
2、 理解植物组织水势的组成及发生质壁分离现象的条件。
二、实验原理
植物活细胞是一个渗透系统，当其处于高渗溶液中时，细胞失水，原生质体体积缩小，发生质壁分离现象。若将发生质壁分离的细胞转移至低渗溶液中，细胞会重新吸水，原生质体膨胀，质壁分离复原。由于死细胞的质膜失去半渗透性，不能发生质壁分离复原现象。因此质壁分离法可用于鉴定植物细胞的死活。
利用植物活细胞的质壁分离及其复原现象，可测定植物组织的渗透势。当植物细胞或组织放在外界等渗溶液中时，组织与外界溶液的水分交换达到动态平衡，植物细胞处于初始质壁分离状态，细胞压力势为零，溶液的渗透势即等于所测植物的渗透势(压力势为零的水势)。用一系列梯度浓度溶液浸泡组织，并观察细胞质壁分离现象。能引起植物组织细胞发生初始质壁分离的溶液浓度或介于发生质壁分离的溶液和相邻没有发生质壁分离的溶液之间的浓度，即为等渗浓度。根据公式计算植物组织的渗透势。
三、实验器材和试剂
1、植物材料 洋葱鳞茎或蚕豆叶
2、实验器材 显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、解剖针、刀片、酒精灯、滤纸、滴管、移液管、9cm培养皿
3.实验试剂 1mol/L蔗糖溶液
四、实验步骤
1、质壁分离及其复原现象观察
1).撕取一小块洋葱鳞片的内表皮，放在滴有1～2滴蒸馏水的载玻片，盖上盖玻片。显微镜下观察植物细胞的状态，并绘图表示之。
2).在盖玻片的一端滴加2～3滴1mol/L的蔗糖溶液，同时在另一端用滤纸吸去水分，使植物材料浸入蔗糖溶液中，在显微镜下连续观察细胞有何变化，解释变化原因，并绘图表示细胞此时的状态。
3).按照上述步骤，在盖玻片的一端滴加蒸馏水，使材料重新浸入蒸馏水中，观察细胞的变化，并解释变化原因。
4).另取洋葱鳞片内表皮一小块，放在有数滴蒸馏水的载玻片上，酒精灯上小心加热2～3min(或用酒精浸泡)将植物细胞杀死，冷却后在载玻片上滴加1mol/L蔗糖液，盖上盖玻片，置于显微镜下观察植物细胞是否有质壁分离现象出现，并解释原因。
2、植物组织渗透势的测定
1).配制0.1～0.8mol/L8个梯度的蔗糖溶液各10ml，分别盛于小培养皿中，并加上盖子。
2).从部位相近的鳞片撕取大小相近(约几个平方毫米)的内表皮，从浓度高的蔗糖溶液开始，依次每隔3min投放内表皮到一种浓度的溶液中(以便有充足的时间观察，并使组织在不同溶液中处理时间一致)，并使之完全浸没，室温下放置30min。
3).按浓度由高到低依次取出处理过的表皮，放在有1～2相应浓度蔗糖溶液的载玻片，盖上盖玻片，在显微镜下观察观察质壁分离的情况(每次镜检约100个细胞)，并记录不同浓度溶液处理下质壁分离的程度。
4).依据不同溶液中植物细胞质壁分离的程度，确定一个引起50％的细胞角隅上出现质壁分离(作为初始质壁分离)的溶液浓度，或确定引起细胞质壁分离最低浓度下不引起质壁分离最高浓度的平均值，作为等渗浓度。用新的溶液和植物材料进行重复实验过程，以确保结果的准确性。
5).依据所确定的等渗浓度，根据下式计算该植物组织的平均渗透势。
计算公式：平均渗透势＝解离系数i×气体常数×绝对温度T×等渗浓度c。
平均渗透势φs，以bar表示；
蔗糖解离系数i为1；
气体常数R为0.083 L.bar/mol.k；
绝对温度T＝273℃＋实验室温；
等渗浓度c，mol/L。
五、实验报告
1、计算实验中测得的植物组织水势
2、不同浓度的NaCl可否用于测定植物组织的渗透势？

实验四 兔的麻醉及局部解剖
【实验目的】
掌握动物麻醉的方法；掌握解剖哺乳动物的基本技术；
掌握手术器械的使用方法；掌握组织切开、止血等基本操作技术。
【实验对象】
家兔
【实验器材】
哺乳类动物手术器械一套（包括手术刀、粗剪、手术剪、眼科剪、止血钳、镊子等）、兔手术台、注射器、20%氨基甲酸乙酯溶液、1000U/ml肝素溶液。
【实验方法与步骤】
本次实验首先由教师示教，然后同学三人一组（手术者一人、助手两人）各任不同的手术职责进行手术。
1. 动物的麻醉
将家兔称重，按5ml/kg的剂量于耳缘静脉注射20%氨基甲酸乙酯溶液麻醉。然后将家兔背位（仰卧）固定于兔手术台上。
2. 局部解剖

在进行局部解剖之前，先观察兔子的大体外形，区分头、颈、躯干、尾和四肢五部分。
（1） 颈部神经、血管和气管的暴露与分离 
兔的颈部神经、血管、气管的解剖位置关系清晰、分支较少。更为突出的是，兔的减（降）压神经单独为一支，与迷走神经、交感神经、颈动脉伴行（图3-1），是进行心血管活动及内脏神经功能研究的理想的实验材料。

图3-1 家兔的颈部分离

① 分离气管
剪去颈前部兔毛，用手术刀在喉头下缘沿颈前正中线做一5~7cm长的切口，用止血钳纵向分离皮下组织，于正中线分开颈部的胸骨舌骨肌和胸锁乳突肌，暴露气管。用玻璃分针或手术刀柄将覆盖在气管表面的筋膜除去，使气管完全暴露。用弯头止血钳或镊子在气管下穿一根线备用。
② 分离颈总动脉
位于气管两侧，分离覆盖在气管上的胸骨舌骨肌和侧面斜行的胸锁乳突肌，深处可看到颈动脉鞘。分离时，可用左手拇指和食指捏住已分离的气管一侧的胸骨舌骨肌，再稍向外翻，即可将颈总动脉以及神经束翻于食指上。用玻璃解剖针或止血钳轻轻分离动脉外侧的结缔组织，仔细分离鞘膜即可看到搏动的颈总动脉，在其下穿线备用。
③ 神经 
于颈总动脉旁有一束神经与其伴行。小心分离颈总动脉的鞘膜后仔细辩认该神经束中的三条神经：其中最粗的是迷走神经，最细的是减（降）压神经，交感神经粗细介于二者之间。在颈部中央段，迷走神经位于最外侧，减（降）压神经靠近颈总动脉，交感神经位于二者之间。减（降）压神经细如毛发，常与交感神经紧贴在一起。用玻璃分针将所需要的神经分离出1~2cm，穿线备用。
（2） 气管插管 
在暴露的气管上用手术剪于喉头下2~3cm处的两软骨环之间，横向切开气管前壁约1/3的气管直径，再于切口上缘向头侧剪开约0.5cm长的纵向切口，整个切口呈“⊥” 。若气管内有分泌物或血液要用小干棉球拭净。然后一手提起气管下面的缚线，一手将一适当口径的“Y”气管插管斜口朝下，由切口向下插入气管腔内，再转动插管使其斜口面朝上，用线缚结于套管的分叉处，加以固定（图3-2）。

图3-2 气管插管示意图
【注意事项】
1. 麻醉剂剂量不能过量，注射不宜过快。
2. 神经、肌肉和血管都是比较娇嫩的组织，在分离过程中要仔细、耐心、轻柔。
3. 分离时应掌握先神经，后血管；先细后粗的原则。分离的方向一般要求与神经、血管的走向平行，才能避免损伤组织。

实验五 植物体内几种呼吸酶的鉴定
一、实验原理
植物的呼吸其实质是在植物体内进行的一系列酶促氧化还原反应。本实验包括鉴定几种呼吸酶的方法。这些呼吸酶中有的参加线粒体呼吸，有的存在于细胞质中，不参加线粒体呼吸。这些酶鉴定原理如下：
1．脱氢酶 以亚甲蓝作氢受体。氧化态的亚甲蓝，接受底物脱下的氢而还原为无色的还原态亚甲蓝。
2．细胞色素氧化酶 在植物体内，细胞色素氧化酶能催化细胞色素c的氧化。通常利用该酶能催化二甲基对苯二胺和α—萘酚作用，生成蓝色物质的反应来鉴定该酶的存在。
3．多酚氧化酶 该酶催化酚及其类似化合物被分子态氧氧化为醌类化合物的反应。氧化态的醌可自动氧化成棕黑色的化合物。本实验用邻苯二酚为底物检验多酚氧化酶的存在。
4．过氧化物酶 该酶以H2O2为氧化剂，催化H2O2氧化另一种底物。本实验以联苯胺为供氢体，反应后生成蓝色物质。
5．过氧化氢酶 该酶催化H2O2分解成水和氧，O2的产生标志着该酶的存在。
二、实验材料和设备
1植物材料：用水浸泡24h的豌豆种子；马铃薯块茎。
2、设备：试管及试管架；；烧杯；漏斗；量筒；恒温水浴锅；解剖刀；吸量管。
3、试剂：0.01％甲烯蓝溶液；
pH7.0的磷酸缓冲液
（0.2mol配法：NaH2.H2O 10.7g/l NaH2.2H2O 12.17g/l
Na2H.2H2O 21.71g/l Na2H.12H2O 43.70g/l
1％邻苯二酚乙醇溶液
1％α－萘酚乙醇溶液
1％盐酸二甲基－对－苯二胺溶液(冰箱贮存，一周内使用)
1％联苯胺乙醇溶液
3％H2O2。
三、实验步骤
1、脱氢酶
取10g用水浸泡24h的豌豆种子，剥去种皮，分开两片子叶，分别放入两支试管内。向其中1支试管内加入少量蒸馏水，在沸水浴中加热5min，倒出水。然后，分别向两支试管中加入5ml甲烯蓝溶液，染色10min。染色结束后，倒出甲烯蓝溶液，用水冲洗，此的种子表面应呈蓝色。然后加水至接近管口，将试管放入37℃水浴中保温1h，取出并观察种子有无变色，记下观察的结果。
将表面蓝色消失的种子倒出，暴露于空气中，现察种子表面的变化，并解释之。
2、细胞色素氧化酶、多酚氧化酶和过氧化物酶
1)．酶液的制备
取l0g洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放入研钵中，加少量磷酸缓冲液，低温下研磨成匀浆。用缓冲液将匀浆洗入小烧杯中，加磷酸缓冲液至25ml，在冰浴中浸提20min，用脱脂棉过滤。收集滤液15ml，分成两份，一份于沸水浴中煮5min，另一份置于冰浴中。
2)．酶的鉴定 取6支试管分成两组，依次编号为l、2、3。向其中一组试管内加入煮过的酶液各2ml；向另一组试管内加入置于冰浴中的酶液各2ml。然后向1号试管内加入1ml二甲基－对－苯二胺和1mlα－萘酚，向2号试管内加入2ml邻苯二酚；向3号试管内加入1ml联苯胺和1ml H2O2。
将试管内的底物与酶液混匀，于37℃恒温水浴中保温，保温期间摇动数次，观察并记录颜色的变化。
3、过氧化氢酶
将马铃薯块茎切成约5mm3的小块。取两支试管，每支放入3块马铃薯小块。其个1支加入少量的水，将薯块浸没，于沸水浴中加热5min，然后将水倒出。分别向两支试管内加入5ml3％H2O2，观察两种马铃薯小块周围有无气泡产生。
四、实验报告
将所鉴定的5种呼吸酶、底物(分成氧化剂和还原剂两类)和反应的结果列表表示。

酶 的 名 称
底 物
实 验 结 果

加热
不加热

注意：
1：检测过氧化物酶时，当样品显出篮色时，应立即取出观察，否则蓝色会转变成棕色复合物，影响实验结果。

实验六 兔颈部动脉、输尿管插管
【实验目的】
掌握兔颈部动脉、输尿管插管的方法
【实验对象】
家兔
【实验器材】
哺乳类动物手术器械一套（包括手术刀、粗剪、手术剪、眼科剪、止血钳、镊子等）、兔手术台、动脉夹、动脉套管、注射器、20%氨基甲酸乙酯溶液、1000U/ml肝素溶液。
【实验方法与步骤】
本次实验首先由教师示教，然后同学三人一组（手术者一人、助手两人）各任不同的手术职责进行手术。
1. 动物的麻醉
将家兔称重，按5ml/kg的剂量于耳缘静脉注射20%氨基甲酸乙酯溶液麻醉。然后将家兔背位（仰卧）固定于兔手术台上。
2. 颈动脉插管   
颈部剪毛，沿颈部正中线切开皮肤5~7cm，用止血钳钝性分离皮下组织及浅层肌肉，暴露和分离气管分离左、右两侧颈总动脉。事先准备好插管导管，取适当长度的塑料管或硅胶管，插入端剪一斜面，另一端连接于装有抗凝溶液（或生理盐水）的血压换能器或输液装置上，让导管内充满溶液。给动物静脉注射肝素（500U/kg），使全身肝素化，分离出一段颈总动脉，在其下穿两根线备用。将动脉远心端的线结扎，用动脉夹夹住近心端，两端间的距离尽可能长。用眼科剪在靠远心端结扎线处的动脉上呈45º度剪一小口，约为管径的1/3或1/2，向心脏方向插入动脉导管，用近心端的备用线，在插入口处将导管与血管结扎在一起，其松紧以开放动脉夹后不致出血为度。小心缓慢放开动脉夹，如有出血，即将线再扎紧些，但仍以导管能抽动为宜。将导管再送入2~3cm并结扎更紧些，使导管不致脱落。用远心处的备用线围绕导管打结、固定。操作完毕后将血管放回原处（图4-1）。

图4-1 颈总动脉插管示意图
3. 输尿管插管
耻骨联合上缘向上沿正中线作4cm长皮肤切口，再沿腹白线剪开腹壁及腹膜（勿伤腹腔脏器），找到膀胱，将膀胱向尾侧翻至体外（勿使肠管外露，以免血压下降）。再于膀胱底部找出两侧输尿管，认清两侧输尿管在膀胱开口的部位。分离两侧输尿管，在靠近膀胱处穿线将它结扎；再在此结扎前约2cm的近肾端穿一根线，在管壁剪一斜向肾侧的小切口，插入充满生理盐水的细塑料导尿管并用线扎住固定（图4-2），此时可看到有尿滴滴出。记录单位时间尿液的滴数，手术完毕后，用温生理盐水纱布覆盖腹部切口。

图4-2 兔输尿管插管法
1、输尿管 2、插导管部位
【注意事项】
1. 选择家兔体重在2.5~3.0kg左右，实验前给兔多喂菜叶，或用橡皮导尿管向兔胃内灌入40~50ml清水，以增加基础尿量。
2. 手术动作要轻揉，腹部切口不宜过大，以免造成损伤性闭尿。剪开腹壁避免伤及内脏。
3. 输尿管插管时，注意避免插入管壁和周围的结缔组织中；插管要妥善固定，不能扭曲，否则会阻碍尿的排出。

实验七 叶绿素的提取及理化性质的鉴定
一、实验目的
1． 了解叶绿素的分子结构、理化性质及其生物学功能。
2． 学习提取叶绿素并对其理化性质进行分析的基本方法。

二、实验原理
叶绿素是植物吸收太阳光能进行光合作用的主要色素，高等植物叶绿体中主要含叶绿素a和叶绿素b。叶绿素是一个双羧酸的酯，在碱的作用下可发生皂化反应，产生叶绿酸钾。在酸性条件下，卟啉环中央的美离子可以被H+取代，产生褐色的去镁叶绿素。叶绿素中的Mg2+也可以被其它金属离子，如Cu2+或Zn2+等取代，此时叶绿素仍保持绿色。叶绿素在光照下会发出暗红色的荧光。

三、实验内容
利用叶绿素能溶于有机溶剂的特性，用丙酮将叶绿素从叶中提取出来，再运用一些简单的物理和化学方法鉴定叶绿素的理化性质。

四、实验步骤
1． 叶绿素的提取
将新鲜菠菜(Spinacia)