甲型流感病毒实验室检测技术方案.doc

甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案
(试行)
本方案旨在为全国流感监测网络实验室提供甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案，不用作商业活动或赢利目的。
一、标本的采集种类和规定
1、推荐采集的呼吸道标本种类
疾病发病后应尽快采集如下标本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。气管插管的病人也应收集气管吸取物。标本应置于无菌病毒采样液，并立即用冰块或冰排保存或置于4 ℃ （冰箱），并立即送至实验室。（临床样品采集人员及实验室检测人员的感染控制指导请见相关文献。） 采样同时填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单。（附表1）
2、拭子的选择
标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做柄。不推荐棉拭子和木柄。标本采集管应包含3毫升病毒采样液（具有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）
3、临床标本储存规定
保存在4℃（不能超过4天）或者-70℃或-70℃以下。有条件的实验室均应保存在-70℃或-70℃以下。不应保存在-20℃。
4、标本的分装解决
标本送至实验室后，立即进行解决，避免反复冻融。将原始标本分为三份，一份用于核酸检测，一份用于病毒分离，一份保存待复核。
5、标本的运送
疑似人感染甲型H1N1感染病例列为 A类，用UN2814包装运送。填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单（附表2）。
二、核酸检测
基于PCR原理的核酸检测方法是一种快速有效的诊断方法，在突发传染病应急工作中发挥了巨大作用。
1、基于real-time RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物和探针序列为美国CDC设计）：
4月29日WHO网站上公布了美国CDC设计的针对本次甲型H1N1流感病毒的real-time RT-PCR引物和探针，此实验用于检测疑似甲型H1N1流感病例的呼吸道样本, 因此，用此real-time RT-PCR的方法，建议一方面筛选甲型流感病毒并排除季节性流感病毒和H5N1禽流感病毒。real-time RT-PCR方法参见附件3（中文翻译版），附件4（英文原版）。
2、基于RTPCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物序列为国家流感中心设计）：
目前国家流感中心设计了RT-PCR方法检测新的甲型H1N1流感病毒。RT-PCR的方法参见附件5。
三、病毒分离鉴定
可采用鸡胚和/或MDCK细胞进行流感病毒分离。具有相应条件的网络实验室在收到标本后24h内进行病毒接种。具体方法参见附件6和7。
四、合用于实验室工作人员的甲型H1N1流感病毒生物安全
（一）实验室级别及个人防护
1、对采集自属于感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的诊断性实验工作，在BSL-2实验室内进行。所有样本操作均应在生物安全柜（BSC）内进行。遵循生物安全三级个人防护。
2、对采集自属于感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的病毒分离培养工作，应在BSL-3实验室内进行，并遵循生物安全三级个人防护。
（二）健康监测
1、所有人员均应自测发热及其他症状。
2、感染甲型H1N1流感病毒的症状涉及咳嗽、喉咙痛、呕吐、腹泻、头痛、流鼻涕和肌肉疼痛。如有不适，应立即向上级报告。
3、如有人员在无防护情况下暴露于甲型H1N1流感确诊病例的临床标本或活病毒，应考虑在暴露后的7天时间里使用奥司他韦或扎那米韦进行抗病毒药物防止。
五、附表和附件
附表1 疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单
附表2 疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单
附件3： real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程(2023版)（中文）
附件4： real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程(2023版)（英文）
附件5： RT-PCR方法检测甲型流感病毒
附件6：甲型H1N1流感病毒鸡胚分离方法
附件7：甲型H1N1流感病毒MDCK细胞分离方法

附表1
疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本采样单
姓名
性别
年龄
职业※
现住址
发病日期
标本#
种类
标本量
（g或ml）
采集
日期
备注

※选项：参照传染病报告卡。
#选项：A鼻咽拭子、 B鼻咽吸取物、C鼻腔冲洗液、D鼻腔吸取物、E气管吸取物、F其他（如为其他，请在表格中注明）

采集人员： 采集单位（盖章）：

附表2
疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本送检单
姓名
性别
年龄
职业※
现住址
发病日期
标本#
种类
标本量*
（g或ml）
采集
日期
备注

※选项：参照传染病报告卡
#选项：A鼻咽拭子、 B鼻咽吸取物、C鼻腔冲洗液、D鼻腔吸取物、E气管吸取物、F其他（如为其他，请在表格中注明）
*标本量：假如同一份标本有多个包装请注明。

填表人员： 送样时间： 单位（盖章）：

附件3
real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程
中文翻译版（请同时参考英文原版）
请注意：体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。本规程中的体系仅供参考。

美国CDC实时RTPCR(rRTPCR)检测猪流感操作规程(2023版)
本规程所有权归属疾病控制中心，紧急状态时授权各公共卫生实验室使用。本规程不用作商业活动或赢利目的。
一、概 述
（一）前提
本规程基于对rRT-PCR方法的基本掌握。
（二）实验原理
实时荧光定量RTPCR(rRTPCR)法检测猪流感的方案是用一组寡核苷酸引物和双重标记的TaqMan®探针对呼吸道样本或体外培养的猪流感病毒进行定性检测鉴定。InfA引物和探针为检测出甲型流感病毒而设计，swInfA引物和探针可特异性地检测出所有的猪甲型流感病毒，swH1引物和探针可特异性检测猪流感病毒H1亚型。本实验用于检测甲型流感阳性的疑似猪甲型流感感染病例的呼吸道样本。
（三）使用条件
一步法定量RT-PCR 96孔板热循环系统。
（四）生物安全规定
样本解决应在相应的生物安全实验室完毕。
（五）样本规定
1、呼吸道样本
支气管肺泡灌洗液，气管抽吸物，痰，鼻咽或口咽洗液或拭子。拭子样本所用的拭子顶端应为人造材质（如聚脂或涤纶）、柄为铝制或塑料。不推荐使用棉头木柄的拭子。藻酸钙拭子采样不可取。
2、排除标准
1）未在2－4°C (≤4 天)或-70°C及以下保存的样本
2）以上未列的其它不妥样本
（六）核酸提取
RT-PCR扩增效能依赖于样本模板RNA的质与量。RNA提取操作需通过检查核酸的纯度合格之后，再用于样本实验。商业化的操作程序中涉及QIAamp® 病毒RNA提取试剂盒，RNeasy®小试剂盒 (QIAGEN公司)，罗氏MagNA Pure Compact RNA分离试剂盒, MagNA Pure LC RNA分离试剂盒II, 和罗氏MagNA总核酸纯化试剂盒，在推荐的操作程序下，可提取高纯度的RNA。
（七）免责声明：提到的厂家名仅用作举例，并不表达疾控中心认可。

二、实验材料
（一）试剂
1、一步法荧光定量RT-PCR探针试剂盒；
2、分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶和DNA酶)；
3、正反向引物 (40μM)；
4、双重标记探针(10μM)；
5、阳性对照。
（二）供应
1、实验室标记笔；
2、微量离心管格栅，96孔0.2ml PCR反映管；
3、20μl 和 200μl 可调节移液器及滤芯枪头；
4、0.2ml PCR 反映管盘；
5、光学反映盖板；
6、无菌,无核酸酶的1.5 ml微量离心管；
7、一次性无粉手套。
（三）仪器设备
1. 微量离心机；
2. 漩涡振荡器；
3. 实时荧光定量PCR检测系统，含96孔的热循环反映板。
三、操作程序
（一）准备工作
1. 避免样品污染
由于fluorogenic 5’核酸酶测定的敏感性，应特别注意假阳性产生。推荐以下防止污染的方法：
1）实验准备与核酸提取使用独立区域；
2）实验准备与核酸提取使用专用设备（如移液器，微量离心机）和耗材（如微量离心管，吸头）；
3）实验开始后穿清洁工作服，并使用新的一次性无粉手套；
4）不同样本操作之间，以及怀疑也许污染的情况下均更换手套；
5）试剂和反映管的盖子应尽量关闭。
2、仪器准备
工作台、移液管、离心机必须清洁，用去污剂净化，例如5%的漂白剂、“DNAzapTM”或者“RNase AWAY®”来减小核酸交叉污染的风险。
3、试剂准备
注意：在实验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。
1）引物和探针
（1）分装好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光2-8℃可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）；
（2）涡旋振荡引物和探针；
（3）瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。
2）Real time RT-PCR的试剂
（1）将Master Mix和酶置于冰架上；
（2）融化2×的Reaction Mix；
（3）颠倒混合2×的Reaction Mix；
（4）瞬时离心2×的Reaction Mix和酶，置于冰架上。
4、对RT-PCR的每一步过程均进行检测
1）每个样品的RNA提取物通过度别的引物和探针进行检测：InfA, swFluA, Swine H1 (swH1) 和RNaseP (RP)。RNaseP引物和探针是以人的RNaseP基由于靶基因的，因此对于人的核酸可以作为内部阳性对照。
2）对于每一个过程中涉及的所有引物和探针，均设立无模板对照（NTC）和阳性模板对照（PTC）。
3）人类样本对照（HSC）提供了次级阴性对照，以便确认核酸提取过程和试剂的完整性。
5、建立反映
反映检测混合物充足混合后加入到96孔板中。然后在适当的实验反映和对照中，加入水和提取的核酸或者阳性模板对照（PTC）。
1）为每一个引物和探针标记一个1.5ml的微量离心管；
2）对每一个建立的反映拟定反映数（N）。考虑到NTC、PTC、HSC反映和吸量误差，制备过量的反映混合物是必要的。具体如下：
（1）假如涉及对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1；
（2）假如涉及对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。
3）Master Mix:计算加到每个引物/探针反映混合物中的各个试剂的量。计算如下：
* 体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。

4）加入水之后，通过上下吹打混匀反映混合物，不要涡旋振荡。
5）离心5s使混合物聚集管底，然后将管子置于冰架上；
6）准备板状的反映管子或者96孔板，置于冰架上；
7）每一个master mix吸取20μl到每一孔中，每排按顺序进行，如下图：
实验建立举例：

实验样本举例：

注意：在任何样本被加入之前，应当一方面加入阴性模板对照（NTC）（第1列），用来检查master mix中的污染。HSC应当在待测样本之后加入（第11列），用来检查在样本准备或者加入过程中的交叉污染。阳性模板对照（PTC）应当在所有样品和阴性模板对照（NTC）之后被加入。
8）在将培养板移到核酸解决区域之前，在实验设定区域，在反映板的第一列将NTC反映进行。如上所述。
9）吸取5μl的nuclease free water到NTC孔，将NTC孔盖上。
10）将反映板盖上，移到核酸解决区域。
11）将具有样品的管子涡旋振荡5s，瞬时离心5s；
12）将提取的核酸样本置于冰架上；
13）如上所述，样品应当按列加入，吸取5μl的第一种样本到所有标记这种样品的孔中（例如，样本“S1”如上表格所示）。不同样本之间需更换枪头操作。
14）加完样本的孔要盖住，这将会帮助防止样品的交叉污染，并且可以使操作人员记录其加样的具体进程；
15）为了避免交叉污染，必要时更换手套；
16）对剩下的样本，反复环节13-15；
17）加入5μl的HSC样品加到HSC孔中（第11列）。将HSC孔盖盖。
18）最后，加5μl阳性模板对照RNA到所有PTC孔中，将PTC孔盖上。
19）假如使用8个管子的条状板子，每一条都要做标签标记，来指明每一个样品的位置（不要在反映管子的顶部标记！）。瞬时离心条状管子10－15s，然后置于冰架上。假如使用培养板，4℃，500g离心30s，置于冰架上。

6、RT-PCR扩增条件
反映体系为25ul，反映条件如下：

注：在55度这一环节中要收集荧光信号（FAM）。
* 具体扩增条件请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。
7、解释说明/检查
1）探针/引物的阴性对照反映中得到的荧光增长曲线不应当超过阈值线。假如一个或者多个引物和探针的阴性反映出现了假阳性，则样品也许已经被污染。那么整个实验过程是无效的，严格的按照环节规则重新实验。
2）在37个循环处或者37个循环之前，所有的临床样本的RP反映曲线都应当超过阈值线，这表白从人类RNase P基因扩增到足够量的RNA，也表白了样本质量合格。然而，也许有些样本会由于初始临床样本中的细胞数量较少而无法出现阳性结果。同时，从动物/禽类体内或者经细胞培养得到的样本，经常会RP反映没有结果或者结果很弱。假如在所有临床样本中检测RNase P都阴性，则说明：
（1）从临床材料中对核酸的不适当的提取导致RNA的损失或者来自临床标本的RT-PCR克制剂的残留污染；
（2）没有足够的人类细胞以备检测；
（3）方法建立和实行不妥；
（4）试剂和仪器因素。
3）在40个循环之内，HSC组中InfA，swFluA，swH1探针的荧光增长曲线不应当超过阈值线。假如任何其中任何一个流感特异性探针的增长曲线超过了阈值线，那么有以下解释：
（1）也许由于RNA提取试剂污染。在实验前保证RNA提取试剂无误。
（2）RNA提取过程或建立反映加样过程发生交叉污染。严格遵照操作程序的规定进行反复实验。
（3）在40个循环之前，PTC反映的InfA, swInfA, swH1和RP反映应出现阳性结果。假如没产生预期的阳性结果则视为无效，应严格遵照操作程序进行反复实验。拟定PTC反映失败因素，订正并记录错误因素及更改方案。不再使用没产生预期结果的PTC试剂。
（4）当所有对照都满足规定后，假如InfA反映增长曲线与阀值线在40个循环内有交叉时，则样本被视为A型流感病毒阳性。假如A型流感病毒反映呈阳性，那么Univ SW 和/或 SW H1也也许呈阳性。假如样本InfA和特异亚型反映（swInfA和swH1）的反正增长曲线与阈值线在40个循环内有交叉，则视该样本为猪流感病毒A/H1阳性。假如样本只有InfA和一个亚型的反映阳性或只有InfA阳性，请联系CDC做进一步指导。
（5）在所有对照都满足规定的前提下，假如在40个循环内，待测样本的所有InfA反映阴性则视该样本为阴性。
8、限制规定
1）实验员在实际操作之前应进行操作程序和实验结果分析的培训，纯熟掌握后方可进行实验。
2）当样本量局限性也许会产生假阴性结果，导致的因素也许是不妥的收集，运送或解决。
3）假如反映中存在过量的DNA / RNA模板时也也许出现假阴性。假如某样本的RP反映被克制，则可以将提取的RNA进行2倍或更大倍数的稀释（例如1：10或1：100）来反复实验。
9、备注
引物和探针参见英文版P7。

附件4
real-time RT-PCR方法检测鉴定甲型H1N1流感操作规程
（英文版）

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附件5
基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒

一、目的
对采集的可疑病例标本进行检测，筛选甲型H1N1流感病毒并排除季节性H1N1流感病毒。

二、引物

NIC引物
引物名称
碱基组成
目的片段大小
备注
FluA
FluA-M-F30
TTCTAACCGAGGTCGAAACG
235bp
甲型流感病毒M基因通用检测引物
FluA-M-R264
ACAAAGCGTCTACGCTGCAG
H1HA
H1 F1147
AAGAGCACACATAATGCCAT
527bp
H1N1亚型检测通用引物
H1 R1673
CCATTRGARCACATCCAG
HuH1HA
H1HA F768
ACTACTGGACTCTGCTGGAAC
327bp
人季节性流感病毒H1N1亚型检测引物
H1HA R1094
CAATGAAACCGGCAATGGCTCC
SWH1HA-1
SW-H1 F786
AATAACATTAGAAGCAACTGG
153bp
本次甲型H1N1亚型流感病毒引物
SW-H1 R920
AGGCTGGTGTTTATRGCACC
RnaseP
RnaseP F
AGA TTT GGA CCT GCG AGC G
约80bp
与real-time PCR中RnaseP引物一致
RnaseP R
GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT

三、材料及仪器
1、 RNA 提取试剂盒QIAGen RNeasy Mini Kit （catalog #74104）
2、β－巯基乙醇（SIGMA β-Mercaptoethanol Lot 062K0115）
3、70%乙醇
4、RT-PCR Kit：QIAGEN One step RT-PCR Kit（catalog #210212）
5、RNasin Ribonuclease Inhibitor （Promega catalog #N2111）
6、检测引物
7、Axygen 1.5mL离心管，货号：MCT-150-C
8、Axygen 0.2mL PCR管，货号：PCR-02-C
9、Axygen 10μL，100μL，200μL，1000μL带滤芯枪头
10、10μL，100μL，200μL，1000μL加样器
11、可调转速14K离心机：
12、旋涡混合器：
13、生物安全柜：二级生物安全柜
14、PCR仪：
15、琼脂糖：Biowest Agarose Distributed by Gene Tech（Shanghai）Company Limited Lot No. 101685
16、核酸染料：
17、电泳液：5×TBE电泳缓冲液 cat No. ．电泳槽、电泳仪

四、实验环节
（一）RNA提取
1、根据标本数量分装RLT液：从Kit中取出RLT液，用1.5mL离心管分装，每管500μL（在体系配制区操作）。
2、在生物安全柜内将采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）取100μL加入RLT液管中，充足混匀。
3、每管分别加入5μL β-巯基乙醇，混匀后依次加入600μL 70%的乙醇，充足混匀。
4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管，打开包装将其做好标记。取环节（3）中的混合液600μL加入滤柱中，12023rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。
5、滤柱仍放回收集管上，将环节（3）剩余的混合液所有吸入滤柱中，12023rpm，离心15s，弃离心液。
6、于滤柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12023rpm，离心15s。
7、从QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干净的2mL收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12023rpm，离心15s。
8、弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，离心2min。
9、将滤柱移到一个干净的1.5mL eppendorf管上，向滤柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室温静置1~3min。
10、12023rpm，离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20℃以下保存。
注意：Buffer RPE使用之间加44mL无水乙醇。
（二）反映体系配制
1、实验设计：
检测标本RNA
质控参数：
阴性对照：无菌水（标本RNA提取时，跟标本同时提取无菌水。）
阳性对照：已知病毒RNA
2、PCR反映体系配制（在体系配制区配反映液）
1）按下表加入试剂：
PCR反映体系
组 分
体 积（μL）
RNase Free Water
5×RT-PCR Buffer
119×n
5×n
10mM dNTP Mixture
1×n
Enzyme Mix
1×n
RNase Inhibitor
0.1×n
上游引物
0.5×n
下游引物
0.5×n
Total
20×n

对每一个建立的反映拟定反映数（n=拟进行的PCR管数，涉及阴性，阳性对）。考虑到阴性无模板对照，阳性对照，误差，制备过量的反映混合物是必要的。具体如下：
（1）假如涉及对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1；
（2）假如涉及对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。
2）将上述反映液混匀，分装到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分别做好标记。
3）加RNA模板（在核酸提取区）
将上述分装好的PCR小管分别加入模板。一方面加入阴性对照管（5μL无菌水），然后分别加标本RNA（每管5μL），最后加入阳性对照RNA（每管5μL）。

3、RT-PCR反映
将上述加好模板的反映管混匀，短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR
扩增，反映程序如下：

温度 (oC)
时间
循环数
60℃
1min
1
42℃
10min
50℃
30min
95℃
15min
94℃
30s
35
52℃
30s
72℃
1min
72℃
7min
1
4℃
保存

4、RT-PCR产物检测
1）2.0％琼脂糖凝胶制备：称取2.0g Agarose，倒入耐热玻璃瓶内，再加入电泳液（1×TBE）100mL，轻轻混匀后加热，使Agarose完全熔化。待Agarose胶温度降至50～60℃左右，加入核酸染料，轻轻混匀（不要产气愤泡）。待胶温度降至50℃左右时，将其倒入制胶板，插好电泳梳子。待胶完全凝固（约30～60min）之后，将梳子拔出。
2）将制备好的电泳胶放入电泳槽（带梳子孔的一端在阴极），倒入电泳液（1×TBE）浸过胶面即可。
3）PCR产物各取10μL，加入2μL上样缓冲液（6×Loading Buffer），混匀后加入电泳胶孔内（先加Marker（DL－2023）5μL，然后依次加标本PCR产物，再加阴性对照，最后加阳性对照产物）。
4）电泳电压100V，约30～40min后看结果。
5）将电泳胶放入凝胶成像系统观测结果并照相。

5、结果判断
在系统成立，即阴阳性参考均正常的条件下，各引物所代表意义如下：
PCR引物
待检样品1
待检样品2
待检样品3
待检样品4
待检样品5
待检样品6
FluA
_
+
+
+
+
+/-
H1HA
_
_
+
+
+
+/-
HuH1HA
_
_
+
_
_
+/-
SWH1HA-1
_
_
_
+
_
+/-
RnaseP

+
+
+
+
+
_
结果判断
非甲型流感病毒
甲型流感病毒
非H1N1亚型
人季节性H1N1亚型流感病毒
猪H1N1亚型流感病毒
送国家流感中心复核
送国家流感中心检测
标本不是人源标本/标本中细胞量少/实验或仪器问题

附件6
甲型H1N1流感病毒的鸡胚分离方法
一、目的
流感病毒的鸡胚分离方法是流感病毒分离方法之一，常用于流感病毒的分离、培养。本SOP是为保证鸡胚分离甲型H1N1病毒的操作准确、规范和可靠而制定。
二、操作程序
（一）生物安全规定
甲型H1N1病毒的鸡胚分离实验室生物安全级别：BSL-3，实验操作人员需进行BSL-3级防护。甲型H1N1病毒的鸡胚接种和病毒培养液的收获操作必须在BSL-3级实验室的生物安全柜中进行。
（二）材料
1、9～10日龄SPF鸡胚
2、照卵灯
3、70%～75％酒精
4、一次性1ml注射器，22号针头
5、鸡卵开孔器
6、胶水或医用胶布
7、15mL无菌离心管、试管架
8、10mL无菌移液管
9、无菌镊子
（三）实验环节
1、验卵
1）用照卵灯检测鸡胚，标记出鸡胚的气室与尿囊的界线、胚胎的位置。假如鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全或表面有好多渗水孔，应弃掉。
2）如何判断鸡胚状态
（1）血管：活胚血管清楚，死胚模糊，成淤血带或淤血块
（2）胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动。
（3）绒毛尿囊膜发育界线：密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界线。
2、接种鸡胚尿囊腔和羊膜腔
1）将鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，标记每个鸡胚，通常每个样本接种3个鸡胚。
2）用70%～75％酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔。每份标本接种3枚鸡胚。
3）用1ml注射器吸200µL解决过的临床标本，装上22号针头。
4）将鸡胚置于蛋架上，针头完全进入鸡胚，刺破鸡胚羊膜，将100 µl临床标本注入鸡胚羊膜腔。然后将针头退出至针头的一半，将此外100 µl临床标本注入鸡胚尿囊腔。

5）用同一注射器将同一标本依上法接种此外的两枚鸡胚。
6）用注射器反复吸取2‰次氯酸钠消毒液2~3次后，将针头放于毁形器中销毁，注射器针筒弃于锐器盒中。
7）用胶水或者消毒过的医用胶布封口。
8）甲型H1N1病毒35℃培养，培养鸡胚2～3天。鸡胚进行病毒分离培养时，天天检查鸡胚生长情况，24h内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡应弃去。
3、鸡胚尿囊液和羊水的收获
1）鸡胚在收获前应4℃过夜或至少放置4h以上。
2）标记15mL无菌离心管与相应的鸡胚编号一致。用70%～75％酒精消毒鸡胚气室端。
3）用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，在绒毛尿囊膜无大血管处穿破。用10mL 无菌移液管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收集管中。用移液管刺破鸡胚羊膜，尽量吸取羊水放置于此外的管中。羊水较少时也可以将3个鸡胚的羊水合并。
4）收获病毒培养液后的鸡胚在生物安全柜内装入密封袋，然后进行高压解决。
5）将鸡胚收获液3000rpm离心5min去除血液和细胞。然后进行红细胞凝集实验，如没有红细胞凝集现象，应将收获病毒培养液再鸡胚传代2次。
6）假如有必要，可再通过血凝克制实验鉴定分离物，并将分离物保存在-70℃或-70℃以下。
4、注意事项
1）不要在-20℃条件下保存病毒分离物，由于该温度条件下甲型H1N1病毒极不稳定。
2）甲型H1N1病毒分离操作严格按照生物安全规程的规定。严禁在同一实验室，同一时间接种未知临床标本和已知其他亚型标准病毒。严禁在同一实验室，同一时间接种来自不同动物的标本。动物标本（如猪、禽等）必须与人的标本分别保存。
附件7
甲型H1N1流感病毒的MDCK细胞分离方法

一、目的
流感病毒的MDCK细胞分离方法是流感实验的关键技术，用于流感病毒的分离、培养。本SOP是为保证MDCK细胞分离甲型H1N1病毒的操作准确、规范和可靠而制定。
二、程序
（一）生物安全规定
甲型H1N1病毒的MDCK细胞分离培养实验室生物安全级别：BSL-3。实验操作人员需进行BSL-3防护。甲型H1N1病毒的MDCK细胞分离操作必须在BSL-3级实验室的生物安全柜中进行。
（二）材料
1、75％～90％成片的MDCK细胞，选用合适大小的细胞培养瓶和细胞培养板来用做病毒分离
2、TPCK解决胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型）
3、HEPES缓冲液，1M母液 （GIBCO Cat No 15630）
4、D-MEM培养基（高糖具有L-谷氨酰胺 GIBCO Cat No 11965），Hank's液(病毒所配液室配制)
5、青、链霉素母液（10000 U/mL 青霉素G；10000 µg/mL硫酸链霉素 （GIBCO Cat No 15140）
6、牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液（GIBCO Cat No 15620）
7、临床样品0.5mL
81mL无菌移液管
9、10mL无菌移液管
10、15mL无菌离心管
（三）实验环节
1、准备病毒生长液
1）细胞维持液准备
500mL D-MEM液中加入下列试剂：
（1）青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL 青霉素；100µg/mL链霉素）
（2）牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL（终浓度：0.2%）
（3）HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）
2）病毒生长液
每500mL细胞维持液中加入0.5mL的TPCK-胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶的终浓度为2µg/mL。
2、甲型H1N1病毒MDCK细胞分离环节
1）75％～90％成片细胞的准备，以选取T25细胞瓶为例。
①用40×物镜观测细胞生长状态。
②轻轻倒出细胞生长液，用10 mL 的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞3遍。
2）细胞培养瓶的接种
（1）用无菌的移液管将清洗细胞的Hank's液从细胞培养瓶中移出。
（2）用无菌的移液管吸取适量临床标本置于细胞培养瓶中，温和摇动数次。
（3）然后放于37℃ 5% CO2培养箱中吸附1～2h。
（4）吸出接种物，用10 mL 的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞2遍。然后加入6mL病毒生长液于细胞培养瓶中。
（5）放置于33～35℃培养箱培养。
（6）每日观测细胞病变情况。（细胞病变的特性是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或所有脱落）。
3、细胞培养物的收获
1）当75%～100%细胞出现病变时进行收获，收获之前可以将细胞放于-70℃冰箱，冻融1～2次，以提高收获标本的病毒滴度。即使无细胞病变也应当于接种后第7天收获。收获病毒液时，先温和摇动细胞瓶数次，然后用10mL的无菌移液管吸取病毒液置于15mL无菌离心管中，混匀病毒。
2）收获的病毒液可以进行红细胞凝集实验，如没有红细胞凝集现象，应将收获病毒培养液再MDCK细胞传代2-3次。
3）假如有必要，可再通过血凝克制实验鉴定分离物，并将分离物保存在-70℃或-70℃以下。